全 文 ：[基金项目 ] 　国家科技重大专项课题(2009ZX0 9502-024)
[作者简介 ] 　许勇(1976 -), 女 ,药物分析硕士 , 主管药师 ,主要
从事中药质量控制研究。
＊通讯联系人 , E-mail:ji shen2006@yahoo.com.cn
【化学测定方法】
高效液相色谱 -串联三重四极杆质谱分析法测定
刀豆中黄曲霉毒素 G2 、G1 、B2 、B1
许勇 ,王少敏 ,郑荣 ,毛丹 ,王柯 ,季申＊
(上海市食品药品检验所 ,上海　201203)
[摘要 ] 　目的:建立刀豆中黄曲霉毒素 G
2
、G
1
、B
2
、B
1
的测定方法。方法:样品经 70%甲醇提取 、HLB柱净化后 ,用高效
液相色谱 -串联质谱进行分析测定。结果:黄曲霉毒素 G2、B2在 0.75 ～ 30pg范围内与峰面积呈良好的线性关系 , 黄曲
霉毒素 G1、B1在 2.5 pg～ 100 pg范围内与峰面积呈良好的线性关系 , r>0.999。回收率在 66.9% ～ 86.7%之间。结论:
本法简便快速 、结果准确 、重现性好 ,可用于刀豆中黄曲霉毒素的测定。
[关键词 ] 　刀豆;黄曲霉毒素 G2 、G1 、B2、B1;高效液相色谱 -串联三重四极杆质谱
[中图分类号 ] 　O657.63　　　　[文献标识码 ] 　A　　　　[文章编号 ] 　1004-8685(2011)01-0041-03
HPLC-triplequadrupoleMSdeterminationofaflatoxinG2 , G1 , B2 , B1 inCanavalia
gladiata(Jacq.)
XUYong, WANGShao-min, ZHENGRong, MAODan, WANGKe, JIShen＊
(ShanghaiInstituteforFoodandDrugControl, Shanghai201203, China)
[ Abstract] 　Objective:ToestablishaHPLC-triplequadrupoleMSmethodfordeterminationofaflatoxinG2 , G1 , B2 , B1 in
Canavaliagladiata(Jacq.).Methods:Afterbeingextractedby70% methanol, purifiedbyHLBcolumn, aflatoxinswereanalysed
byHPLC-triplequadrupoleMS.Results:Thereisagoodlinearrelationshipwithintherangeof0.75 pg～ 30 pgforaflatoxin
G2 , B2 , andtherangeof2.5 pg～ 100 pgforaflatoxinG1 , B1.Therecoverywasbetween66.9% ～ 86.7%.Conclusion:The
methodissimple, sensitive, accurate, specificandreproducibleinthequalityGreenBeans.
[ Keywords] 　Canavaliagladiata(Jacq.);aflatoxinG2 , G1 , B2 , B1;HPLC-triplequadrupoleMS
　　真菌毒素污染已经是一个全球性的问题 , 黄曲霉毒素是
真菌毒素的重要代表之一 , 黄曲霉毒素的污染问题显得更为
突出。 1993年 ,黄曲霉毒素被世界卫生组织(WHO)的癌症研
究机构(IARC)划定为 I类致癌物 , 是一种毒性极强的剧毒物
质 [ 1] 。中药在储存过程中 , 极易发生霉变现象 , 从而会产生对
身体有害的黄曲霉毒素。为了找到适宜的黄曲霉毒素检测方
法 , 保证临床用药的安全性 ,我们建立了用高效液相色谱 -串
联三重四极杆质谱对刀豆中的黄曲霉毒素 G2、G1、B2、B1进行
了测定。方法简便 、准确 、专属性强。
1　材料与方法
1.1　仪器与试剂
　　液相色谱 -串联质谱仪:美国 Agilent公司 1200液相色谱
-API5500三重四极杆串联质谱仪 , 配有电喷雾离子源(ESI);
多功能真空样品处理器;氮气吹干仪(N-EVAPTM112型 ,美国
OrganomationAssociates, Inc公司);分析天平(BS2202/TE-
612-L/CP225D型电子天平 , 德国 Sartorius公司);HLB柱
(3mL/60mg, Waters, 095A)。
　　黄曲霉毒素混合对照品溶液(美国 SUPELCO公司提供
Lot:LB 33367, 黄曲霉毒素 G2 、G1 、B2 、B1 的浓度分别为
0.3μg/ml、1.0 μg/ml、 0.3 μg/ml、 1.0 μg/ml);刀豆(批号:
90721, 产地:浙江)。
　　甲醇 、乙腈均为色谱纯(MERCK公司), 试剂均为分析纯
[中国医药(集团)上海化学试剂公司 ] 。
1.2　液相色谱条件
　　色谱柱:(PhenomenexSB-C18 , 4 μm, 2.0 ×50 mm)。以
10 mmol/L醋酸铵溶液为流动相 A, 以甲醇为流动相 B, 按表 1
进行梯度洗脱;体积流量:1.0 ml/min;柱温:25℃;进样量
10 μl。
表 1　流动相条件
时间 /min 流速 /(mL/min) A相 /% B相 /%
0 0.50 70 30
4.5 0.50 15 85
6 0.50 0 100
6.5 0.50 70 30
10 0.50 70 30
41中国卫生检验杂志 2011年 1月第 21卷 第 1期　ChineseJournalofHealthLaboratoryTechnology, Jan2011;Vol21　No1
1.3　质谱条件
　　经过对毛细管出口电压 、碰撞池能量等质谱参数的优化 ,
最终确定黄曲霉毒素 G2、G1、B2、B1质谱条件见表 2。
表 2　黄曲霉毒素 G2、G1、B2、B1 检测的质谱参数
名称 保留时间(min)
去簇电压
(DP:伏) 定量离子
碰撞能量
(CE:伏) 定性离子
碰撞能量
(CE:伏)
黄曲霉毒素 G2 3.63 55 331.1/313.1 33 331.1/245.1 40
黄曲霉毒素 G1 3.94 60 329.1/243.1 35 329.1/311.1 30
黄曲霉毒素 B2 4.17 55 315.0/287.1 35 315.0/259.1 40
黄曲霉毒素 B1 4.42 60 313.1/241.0 50 313.1/285.0 40
1.4　供试品溶液的制备
　　取样品粉末(过二号筛)5 g, 精密称定 , 精密加入 70%甲
醇 50ml, 超声处理 30min, 离心 5 min(离心速度 2500 r/min),
精密吸取上清液 10ml, 用水稀释至 20ml,摇匀 , 取 10ml,通过
已经处理好的 HLB(先用甲醇 2ml洗脱 ,再用水 2 ml洗脱)柱
(流速 3 ml/min), 随 后用 30%甲醇 2 ml洗 脱 (流速
6 ml/min),弃 去洗脱液 , 再 用 1.5 ml甲醇 洗脱 (流速
1 ml/min),收集甲醇洗脱液 , 用水稀释至 2 ml, 摇匀 ,即得。
1.5　阴性对照溶液的制备
　　取缺刀豆的样品按供试品溶液的制备方法制备阴性对照
溶液。阴性样品溶液在与黄曲霉毒素 G2、G1、B2、B1色谱峰相
同位置处无干扰峰 , 表明样品中其他成分对黄曲霉毒素 G2、
G1 、B2、B1的测定无干扰(图 1)。
图 1　黄曲霉毒素G2、G1、B2、B1 对照品(A)、刀豆样品(B)
刀豆加入对照品(C)阴性对照(D)的总离子流色谱图
1黄曲霉毒素 G2 2黄曲霉毒素G1 3黄曲霉毒素 B2 4黄曲霉毒素 B1
2　结果
2.1　对照品溶液的制备
　　取黄曲霉毒素混合对照品溶液 , 加 50%甲醇制成含黄曲
霉毒素 G2 、G1 、B2、 B1 浓度分别为 30 ng/ml、 100 ng/ml、
30 ng/ml、100 ng/ml的对照品溶液。
2.2　线性关系考察
　　取黄曲霉毒素 G2、G1 、B2 、B1对照品溶液 , 用 75%甲醇配
制成 5个不同浓度的对照品溶液。取刀豆样品(不含黄曲霉
毒素 G2 、G1、B2 、B1)5 g, 一式 5份 , 按 1.4所述方法制备供试
品溶液 ,将供试品溶液于 50℃氮吹至干 ,分别精密加入上述系
列对照品溶液 2 ml,涡旋混匀 , 作为基质对照溶液。精密吸取
各基质对照溶液 10 μl, 进样分析 , 记录各待测组分色谱峰面
积 , 以各成份的进样量为横坐标(X), 各成份的峰面积为纵坐
标(Y),进行回归分析 , 校正曲线结果见表 3。
表 3　回归方程和相关系数
名称 线性范围 /pg回归方程 相关系数 γ
黄曲霉毒素G2 0.75～ 30 Y=7.71×103 X+2.7×103 0.9991
黄曲霉毒素G1 2.5～ 100 Y=2.22×104 X+4.54×103 0.9995
黄曲霉毒素B
2 0.75～ 30 Y=2.34×104 X+164 0.9996
黄曲霉毒素B1 2.5～ 100 Y=1.64×104 X+3.76×103 0.9999
2.3　检测限
　　将基质对照溶液适当稀释后 , 制得一系列不同浓度的基
质对照溶液 , 进样分析 , 以信噪比 3∶1作为检测限 , 黄曲霉毒
素 G2、 G1、 B2、 B1 的最 低检 测限 分别 为 0.12 μg/kg、
0.03 μg/kg、 0.01μg/kg、0.02μg/kg。
2.4　精密度试验
　　取基质对照溶液(黄曲霉毒素 G2、G1 、B2 、B1浓度分别为
3ng/ml、10ng/ml、3 ng/ml、10 ng/ml), 连续进样 6次 , 记录峰
面积 , 结果表明 ,黄曲霉毒素 G2、G1 、B2 、B1 6次进样峰面积的
RSD值在 0.8% ～ 2.3%范围内 ,精密度良好。
2.5　重复性试验
　　因样品未检出黄曲霉毒素 , 故采用加样方法进行重复性
试验。取本品粉末(过二号筛)5g(未检出黄曲霉毒素 G2 、G1 、
B2、B1), 一式 6份 ,精密称定 , 精密加入黄曲霉毒素对照品溶
液 0.3ml, 按正文方法制备供试品溶液 , 进样分析 , 记录峰面
积 , 计算回收率。结果表明 ,测定重复性良好。
表 4　重复性试验结果
编号 1 2 3 4 5 6 平均 RSD
黄曲霉毒素 G2 79.138% 78.915% 79.138% 79.585% 80.256% 81.597% 79.8% 1.3%
黄曲霉毒素 G1 75.114% 76.456% 75.785% 76.456% 78.468% 76.456% 76.5% 1.5%
黄曲霉毒素 B2 74.220% 82.939% 72.879% 71.761% 84.504% 88.080% 79.1% 8.8%
黄曲霉毒素 B1 77.126% 75.785% 79.809% 76.456% 75.114% 78.468% 77.1% 2.3%
2.6　稳定性试验
　　取中间浓度回收率试验的供试品溶液 , 室温下放置 0、
2h、4 h、12 h、24h,进样测定。计算黄曲霉毒素 G2、G1、B2、B1
42 中国卫生检验杂志 2011年 1月第 21卷第 1期　ChineseJournalofHealthLaboratoryTechnology, Jan2011;Vol21　No1
浓度 , 其 RSD值在 3.7% ～ 8.5%范围内 , 表明在 0 ～ 24 h内 ,
供试品溶液化学性质稳定。
2.7　加标回收率试验
　　取本品粉末(过二号筛)5 g(未检出黄曲霉毒素), 一式 9
份 , 以 3份为一组 ,分别精密加入黄曲霉毒素 G2 、G1、B2、B1对
照品溶液各 0.15 ml、0.3ml、0.5ml, 精密加入 70%甲醇 50 ml,
余同供试品溶液制备方法制得加样回收率供试品溶液。依法
测定 , 计算回收率及相应 RSD值 , 结果表明 , 本方法回收率试
验结果良好(表 5 ～表 7)。
表 5　低浓度添加水平回收率试验结果
(黄曲霉毒素 G2、G1、B2、B1的添加浓度分别为 0.9 μg/kg、3 μg/kg、
0.9 μg/kg、3 μg/kg)
名称 1 2 3 平均 RSD
黄曲霉毒素 G2 78.011% 79.794% 78.902% 78.9% 1.1%
黄曲霉毒素 G1 78.100% 77.699% 79.036% 78.3% 0.9%
黄曲霉毒素 B
2 74.890% 77.565% 75.782% 76.1% 1.8%
黄曲霉毒素 B1 81.176% 82.379% 85.856% 83.1% 2.9%
表 6　中间浓度添加水平回收率试验结果
(黄曲霉毒素 G
2
、G
1
、B
2
、B
1
的添加浓度分别为 1.8 μg/kg、6 μg/kg、
1.8 μg/kg、6 μg/kg)
名称 1 2 3 平均 RSD
黄曲霉毒素 G
2 86.292% 85.174% 88.751% 86.7% 2.1%
黄曲霉毒素 G1 77.126% 83.162% 82.492% 80.9% 4.1%
黄曲霉毒素 B2 72.655% 71.984% 72.879% 72.5% 0.6%
黄曲霉毒素 B1 78.468% 79.809% 79.809% 79.4% 1.0%
表 7　高浓度添加水平回收率试验结果
(黄曲霉毒素 G2、G1、B2、B1的添加浓度分别为 3 μg/kg、 10 μg/kg、
3 μg/kg、10 μg/kg)
名称 1 2 3 平均 RSD
黄曲霉毒素 G2 75.278% 74.066% 74.605% 74.6% 0.8%
黄曲霉毒素 G1 70.700% 70.700% 73.528% 71.6% 2.3%
黄曲霉毒素 B2 65.717% 66.256% 68.814% 66.9% 2.5%
黄曲霉毒素 B1 69.488% 67.064% 68.680% 68.4% 1.8%
2.8　样品测定结果
　　按拟订方法测定刀豆样品 , 结果未检出黄曲霉毒素 G2、
G1 、B2、B1。
3　讨论
3.1　洗脱溶剂的选择
　　为了选择合适的洗脱溶剂 , 试验中 , 取对照品溶液(曲霉
毒素 G
2
、G
1
、B
2
、B
1
浓度分别为 30ng/ml、100ng/ml、30 ng/ml、
100 ng/ml)4 ml,一式 5份 ,分别通过已经处理好的 HLB(先用
甲醇 2 ml洗脱 , 再用水 2 ml洗脱)柱 , 再分别用 10%、 30%、
50%、70%、100%甲醇 2ml洗脱 , 收集洗脱液 , 进样分析 , 计算
回收率 , 结果显示 , 随着甲醇浓度的提高 , 溶剂对黄曲霉毒素
的洗脱能力逐渐增强 , 并且黄曲霉毒素 G2 最容易被洗脱下
来 ,当溶剂为 50%的甲醇时 ,黄曲霉毒素 G2、G1、B2 、B1的回收
率分别为 11.5%、3.9%、3.6%、1.0%,当溶剂为 100%的甲醇
时 , 曲霉毒素 G2、G1 、B2、B1的回收率均在 98%以上。因此 , 为
了提高黄曲霉毒素 G2、G1、B2、B1的回收率 , 同时减少杂质干
扰 , 我们选择 30%的甲醇溶液 ,洗脱杂质 , 后用 100%的甲醇洗
脱黄曲霉毒素 G2、G1、B2 、B1。
3.2　洗脱溶剂用量的选择
　　为了完全将黄曲霉毒素 G2、G1 、B2 、B1从 HLB上洗脱下
来 , 试验中 ,取黄曲霉毒素 G2、G1 、B2 、B1 对照品溶液(曲霉毒
素 G2 、G1、B2、B1 浓度分别为 3 ng/ml、 10 ng/ml、 3 ng/ml、
10 ng/ml)1ml, 通过已经处理好的 HLB(先用甲醇 2ml洗脱 ,
再用水 2 ml洗脱)柱 , 分别用甲醇 1 ml、1.5ml、2ml、 3ml甲醇
洗脱 , 收集各洗脱液 ,进样分析 , 计算回收率 ,结果显示 , 1.5 ml
甲醇已经完全能将黄曲霉毒素 G2 、G1 、B2、B1从 HLB柱上洗脱
下来 , 故最终确定甲醇的洗脱体积为 1.5ml。
4　结论
　　目前黄曲霉毒素 G2 、G1 、B2 、B1文献报道的测定方法有薄
层色谱法 [ 2] 、免疫亲和柱荧光光度法 [ 3] 、间接竞争酶联免疫吸
附法 [ 4]等。薄层色谱法用于黄曲霉毒素分析的优越性是对实
验室仪器设备要求较低 , 但此方法操作繁琐 , 耗时 、灵敏度不
高 , 进行目测定量时主观性较大。免疫亲和柱荧光光度法提
高了方法的灵敏度 , 专属性比较强 , 并且是 2010年版《中国药
典》附录中收载的中药中黄曲霉素 G
2
、G
1
、B
2
、B
1
的通用测定
方法。但此方法所用的免疫亲和柱价格比较昂贵 , 且有时会
出现假阳性。间接竞争酶联免疫吸附法主要是作为定性的筛
选方法。
　　与上述方法相比较 , 本法采用 HLB柱对样品进行净化后 ,
通过高效液相色谱 -串联三重四极杆质谱对样品进行进样分
析 , 一方面降低了分析的成本 , 提高了检测的灵敏度 , 同时又
减少了假阳性 , 提高了测定的准确性 ,有较强的实用性。
[参考文献 ]
[ 1] 张艺兵 ,鲍蕾 , 褚庆华.农产品中真菌毒素的检测分析 [ M] .北
京:化学工业出版社.
[ 2] GB/T5009.23 -2006.食品中黄曲霉毒素 B2 、B1 、G2、G1 的测定
[ S] .
[ 3] 郑荣 ,毛丹 ,王柯 ,等.HPLC法测定中药中黄曲霉毒素B2 、B1、G2、
G
1
的含量 [ J].药物分析杂志 , 2005, 26(6):5-8.
[ 4] GB/T5009.22 -2003.食品中黄曲霉毒素 B1的测定 [ S].
(收稿日期:2010-10 -25)
43中国卫生检验杂志 2011年 1月第 21卷 第 1期　ChineseJournalofHealthLaboratoryTechnology, Jan2011;Vol21　No1