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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2015, 31(9):238-243
镰 刀 菌（Fusarium） 是 一 种 世 界 范 围 内 非 常
重要的植物病原真菌，能侵染小麦、玉米和水稻
等多种作物造成严重病害［1］。镰刀菌不仅能够污
染田间作物、仓贮粮食和饲料，还能够引起蔬菜
水果以及玉竹、黄芪、三七和半夏等药用植物的
根（ 茎 ） 腐 病［2-5］。 同 时， 一 些 茄 腐 镰 刀 菌（F.
solani）、 尖 孢 镰 刀 菌（F. oxysporum） 和 串 珠 镰 刀
菌（F. verticillioides）等还能引起难于根治的人皮肤
炎、角膜炎或系统性感染［6］。更严重的是，镰刀菌
在侵染过程中会产生大量真菌毒素，包括脱氧雪腐
收稿日期 ：2015-03-02
基金项目 ：国家重点基础研究发展计划项目（2013CB127801），国家自然科学基金项目（31201475）
作者简介 ：胡祖权，男，博士，研究方向 ：抗体基因工程 ；E-mail ：huzuquan@gmc.edu.cn
通讯作者 ：张静柏，女，博士，研究方向 ：抗体基因工程 ；E-mail ：jingbozhang@mail.hzau.edu.cn
抗镰刀菌单链抗体在大肠杆菌中可溶性表达条件的研究
胡祖权1，2，3  李和平2，4  吴平2，4  廖玉才2，3  张静柏2，3
（1. 贵州医科大学生物与工程学院，贵阳 550004 ；2. 华中农业大学麦类作物分子生物技术实验室，武汉 430070 ；3. 华中农业大学植物科学
技术学院，武汉 430070 ；4. 华中农业大学生命科学技术学院，武汉 430070）
摘 要 ： 通过优化诱导表达条件，实现抗镰刀菌单链抗体在大肠杆菌周质中高效可溶性表达。将抗镰刀菌单链抗体 FvSG7
转化到大肠杆菌 XL1-Blue 中，确定诱导表达培养基，诱导温度、诱导剂 IPTG 的浓度和诱导时间条件下培养重组大肠杆菌，通过
Western 杂交和 ELISA 检测分析单链抗体的可溶性表达情况以及抗体的活性。重组大肠杆菌培养至 OD600nm 为 0.5 时加入终浓度为 0.1
mmol/L IPTG，25℃诱导表达 2 h 可获得最大量的可溶性单链抗体。通过对诱导温度、IPTG 浓度和诱导时间等表达条件的优化，可
以显著提高 FvSG7 抗体在大肠杆菌 XL1-Blue 周质中的表达量。
关键词 ： 单链抗体 ；可溶性表达 ；大肠杆菌 ；优化
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.09.034
A Study on the Optimization of Condition for Soluble Expression of
Fusarium-specific scFv Antibody in Escherichia coli
Hu Zuquan1，2，3 Li Heping2，4 Wu Ping2，4 Liao Yucai2，3 Zhang Jingbo2，3
（1. College of Biology and Engineering，Guizhou Medical University，Guiyang 550004 ；2. Molecular Biotechnology Laboratory of Triticeae
Crops，Huazhong Agricultural University，Wuhan 430070 ；3. College of Life Science and Technology，Huazhong Agricultural University，
Wuhan 430070 ；4. College of Plant Science and Technology，Huazhong Agricultural University，Wuhan 430070）
Abstract: The objectives of the work is to optimize the conditions for inducing expression, and obtain the soluble and high-yield
expression of a Fusarium-specific single-chain variable fragment（scFv）antibody in the periplasmic space of Escherichia coli XL1-Blue. The
recombinant plasmid containing a Fusarium-specific scFv antibody FvSG7 was transferred into E. coli XL1-Blue. After the culture medium for
inducing selected, the soluble expression level and activity of FvSG7 antibody were analyzed by Western blot and ELISA detection for studying
the influence of temperature, IPTG concentration and induction time on expression level. The maximum productivity of soluble FvSG7 antibody
was obtained after induction at 25℃ for 2 h, with a final concentration of 0.1 mmol/L β-D-thiogalactopyranoside（IPTG）and the cultured
bacteria growing to the OD600 value of 0.5. In conclusion, the soluble expression of FvSG7 antibody in the periplasm of E. coli XL1-Blue increased
significantly by optimizing the expression’s conditions of induction temperature, IPTG concentration and induction time.
Key words: single-chain variable fragment antibody ；soluble expression ；Escherichia coli ；optimization
2015,31(9) 239胡祖权等：抗镰刀菌单链抗体在大肠杆菌中可溶性表达条件的研究
镰刀菌稀醇（Deoxynivalenol，DON）、玉米赤霉烯酮
（Zearalenone，ZEN）、伏马菌素（Fumonisin，FB）和 T-2
毒素等，这些毒素在作物、粮食和饲料中积累，进
入食物链，严重危害人、畜健康［1，7］。镰刀菌毒素
具有较强的细胞毒性、免疫毒性、神经毒性以及致
癌、致畸和致突变等作用，能够引起人和动物急性
或慢性中毒，如 DON 能够引起呕吐、FB 可诱导马
脑白质软化症（ELEM）和猪肺水肿（PPE）等。我
国镰刀菌毒素的污染处于高发生率和高含量的严峻
态势［8，9］，监控镰刀菌的污染情况有助于在田间病
害大面积发生前采取有效的预防措施，也可控制真
菌毒素进入食品或饲料中。
免疫学检测方法具有操作简单、价格低廉、灵
敏度高和特异性好等特点，已被广泛用于真菌及
其毒素的检测分析［10-12］。单链抗体（Single-chain
variable fragment，scFv）是具有完整抗原结合位点
的最小抗体片段，由 VH 片段和 VL 片段通过连接肽
（Linker）连接而成，不仅具备良好的亲和力和特异性，
还可以在大肠杆菌等表达系统中高效表达，制备过
程简单，生产周期短［13，14］，在免疫学检测中的应用
前景十分广泛。为了发展高效廉价的镰刀菌免疫学
检测方法，本课题组在构建鸡源单链抗体基因文库
的基础上，通过噬菌体展示技术筛选获得高亲和力
的抗镰刀菌单链抗体 FvSG7 及其编码基因［10］，已用
于构建抗体融合蛋白及免疫检测，具有良好的开发
应用前景。单链抗体表达后由于不需要糖基化修饰
过程，可以采用比真核表达系统更为简单的大肠杆
菌生产技术制备。但是，包涵体表达的单链抗体复
性后的生物活性往往受到影响，而且增加生产成本，
限制了单链抗体的应用。因此，高效可溶性表达是
其生产应用的前提条件。影响蛋白原核表达的影响
因素很多，包括宿主菌、表达载体、目的基因、温度、
IPTG 浓度和诱导表达时间等，课题组在前期工作中
已成功在大肠杆菌 XL1-Blue 中表达出可溶性 FvSG7
单链抗体［10］，但其表达量需进一步提高。因此，本
研究重点对该单链抗体的最适诱导表达温度、IPTG
浓度和诱导时间等因素进行优化，以提高重组大肠
杆菌周质中可溶性单链抗体的表达量，为后期大规
模的表达、纯化和应用奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株和质粒 抗镰刀菌单链抗体编码基因
FvSG7（GenBank 登录号 ：KC304795）为本实验室
筛 选 获 得 ；重 组 质 粒 pHENHi-FvSG7 由 本 实 验 室
构 建 ；大 肠 杆 菌（Escherichia coli）XL1-Blue 感 受
态 细 胞 购 于 Stratagene 公 司 ；重 组 大 肠 杆 菌 XL1-
Blue［pHENHi-FvSG7］由本实验室转化重组质粒
pHENHi-FvSG7 到 XL1-Blue 感受态细胞中获得。
1.1.2 试剂 胰蛋白胨和酵母提取物购自英国 Oxiod
公司 ；碱性磷酸酶（AP）标记羊抗鼠抗体购自美国
Sigma 公司 ；抗 His 单克隆抗体购自天根生化科技
（北京）有限公司 ；BCIP/NBT 显色试剂盒购自武汉
博士德生物工程有限公司。Ni-NTA 蛋白纯化基质购
自 Qiagen 公司 ；蛋白分子量标准购自 Fermentas 公
司 ；对硝基苯磷酸二钠（pNPP）购自 Amresco 公司 ；
氨苄青霉素（Amp）和异丙基 -β-D- 硫代半乳糖苷
（IPTG）购自中国 MDBio 公司 ；引物由上海英骏有
限公司合成。其余试剂为国产分析纯。
1.1.3 培养基及试剂配制 LB 培养基 ：1%（W/V）
胰 蛋 白 胨，0.5%（W/V） 酵 母 提 取 物，1%（W/V）
NaCl，pH 7.0；2× TY 培养基：1.6%（w/v）胰蛋白胨，1%
（W/V） 酵 母 提 取 物，0.5%（W/V）NaCl，pH7.0 ；
PBS 缓冲液 ：137 mmol/L NaCl，2.7 mmol/L KCl，10
mmol/L Na2HPO4，1.8 mmol/L KH2PO4，pH7.2-7.4 ；
PBST 溶液：含 0.1%（V/V）的 PBS 溶液；TBS 缓冲液：
20 mmol/L Tris-HCl，150 nmol/L NaCl，pH8.0 ；TBST
溶 液 ：含 0.1%（V/V）Tween-20 的 TBS 溶 液 ；PPP
溶液：30 mmol/L Tris-HCl，20%（W/V）蔗糖，pH 8.0；
Buffer B ：50 mmol/L NaH2PO4，300 mmol/L NaCl，20
mmol/L 咪唑，pH 8.0 ；Buffer C ：50 mmol/L NaH2PO4，
300 mmol/L NaCl，250 mmol/L 咪唑，pH 8.0。
1.2 方法
1.2.1 培养基的选择 取 5 μL 甘油保存的重组大肠
杆 菌 XL1-Blue［pHENHi-FvSG7］ 接 种 于 20 mL 含
1%（W/V）葡萄糖和 100 μg/mL Amp 的 LB 培养基中，
37℃，200 r/min 振荡过夜培养 12 h。取 1 mL 菌液分
别接种至 100 mL 含 100 μg/mL Amp 的 LB 和 2× TY
培养基中，37℃，200 r/min 振荡培养至 OD600nm 为 0.5，
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.9240
加入终浓度为 1 mmol/L 的 IPTG，30℃诱导表达 8 h，
收集周质蛋白进行 ELISA 检测。
1.2.2 单链抗体诱导表达条件优化 甘油保存菌过
夜培养后，取 2 mL 菌液接种至 200 mL 含 100 μg/mL
Amp 的新鲜培养基中，37℃，200 r/min 振荡培养至
OD600nm 为 0.5，按 5 mL/ 管分装至细菌培养管中，对
诱导表达条件进行优化。首先，在加入终浓度为 1
mmol/L 的 IPTG 条件下，分别在 25℃、30℃和 37℃
条件下诱导表达 8 h，确定单链抗体的诱导表达温度；
接着，在该温度条件下，分别加入终浓度为 0、0.01、
0.03、0.05、0.08、0.1、0.3、0.5、0.8、1.0、1.2、1.5、
1.8 和 2.0 mmol/L 的 IPTG 诱导表达 8 h，分析 IPTG
浓度对单链抗体表达量和活性的影响 ；最后，在确
定的最适温度和 IPTG 浓度条件下，分别诱导表达 0、
2、4、6、8、10、12 h，并测定菌液 OD600nm 值。
1.2.3 渗透压休克法提取大肠杆菌周质蛋白 收集
4 mL 菌液于离心管中，3 000 r/min 离心 5 min，菌
体 用 300 μL PPP 溶 液（ 含 1 mmol/L EDTA） 重 悬，
冰上放置 15 min 后，在 4℃条件下 6 000 r/min 离心
15 min，收集上清。沉淀重悬于 600 μL 终浓度为 5
mmol/L 的 MgCl2 溶液（含 1 mmol/L EDTA）中，冰
浴 15 min 后，在 4℃条件下 6 000 r/min 离心 15 min，
收集上清合并后用于 Western blot 和 ELISA 检测分析。
1.2.4 Western blot 分析 取 10 μL 提取的周质蛋白
经过 12% SDS-PAGE 电泳后，利用半干转印仪（美
国 Bio-Rad）将凝胶中的蛋白转印到硝酸纤维素膜
（NC 膜）上，于封闭液（含 5% 脱脂奶粉的 TBS 溶液）
中 37℃放置 2 h。经 TBST 洗涤 3 次后，加入 10 mL
封闭液稀释（1∶5 000）的抗 His 单克隆抗体，室
温平缓摇动 2 h。TBST 洗涤 3 次，再用封闭液稀释
（1∶5 000）的 AP 标记羊抗鼠抗体孵育 2 h。最后，
经 TBST 和 TBS 分别洗涤 5 次后，用 BCIP/NBT 显色
试剂盒显色 10-20 min。加入蒸馏水终止显色反应，
观察显色情况并用 GS-800 扫描仪（美国 Bio-Rad）
扫描。
1.2.5 ELISA 检 测 在 ELISA 板 孔 中 加 入 100 μL
SCWPs（20 μg/mL）或 PBS（对照），37℃水浴包被 2 h，
用 PBS 洗涤 3 次 ；加入 150 μL 封闭液（含 2% 脱脂
奶粉的 PBS 溶液），37℃水浴封闭 2 h，用 PBS 洗涤
3 次 ；加入 90 μL 封闭液和 10 μL 周质蛋白，37℃反
应 1.5 h，用 PBST 和 PBS 分别洗涤 3 次 ；依次加入
100 μL 封闭液稀释（1∶5 000）的抗 His 单克隆抗
体和 AP 标记羊抗鼠抗体，37℃反应 1.5 h，用 PBST
和 PBS 分 别 洗 涤 3 次 ；加 入 100 μL 0.2%（W/V）
pNPP 显色液，黑暗条件下反应 15-30 min，再加入
50 μL 3 mol/L 的 NaOH 溶液终止反应，用酶标仪测
OD405nm 读值。
2 结果
2.1 培养基的选择
采用常用的 LB 和 2× TY 培养基培养重组大肠
杆菌，检测其生长速度和单链抗体的表达情况。结
果发现重组大肠杆菌培养至 OD600nm 为 0.5 时，在 LB
培养基中需要培养约 5 h，而在 2× TY 培养基中仅
需 3.5 h 左右，说明重组大肠杆菌在 2× TY 培养基
中生长速度更快，这可能与其含有更多的营养物质
有关。加入 IPTG 诱导表达 8 h 后，ELISA 检测显示
LB 和 2× TY 培养基培养后收集的菌体周质蛋白的
平均值分别为 1.019 和 1.472，后者约为前者的 1.5 倍。
因此，选择 2× TY 培养基作为 FvSG7 抗体的诱导表
达培养基。
2.2 温度对单链抗体表达的影响
在加入 IPTG 终浓度为 1 mmol/L 的情况下，分
别在 25、30 和 37℃培养诱导重组 E. coli 表达 8 h，
渗透压休克法提取细胞周质蛋白，通过 Western blot
分析单链抗体的表达情况如图 1 所示，单链抗体在
25℃诱导表达时获得最高的表达量。同时，该温度
诱导表达的单链抗体在 ELISA 检测时也得到相对较
高的值（图 2）。因此，FvSG7 抗体的诱导表达温度
确定为 25℃。
25
35
40
55
70
kD
M 1 2 3
M ：蛋白分子量标准 ；1-3 ：25、30 和 37℃诱导表达的周质蛋白
图 1 Western blot 分析温度对单链抗体表达量的影响
2015,31(9) 241胡祖权等：抗镰刀菌单链抗体在大肠杆菌中可溶性表达条件的研究
2.3 IPTG浓度对单链抗体表达的影响
在 25℃培养条件下，分别加入不同终浓度的
IPTG 诱导表达 8 h，渗透压休克法提取细胞周质蛋白，
通过 Western blot 分析单链抗体的表达情况，图 3 显
示 IPTG 在低于 1.0 mmol/L 时，浓度对单链抗体的表
达量没有太大的影响，更高的 IPTG 浓度反而得到
较少的抗体表达量。同时，ELISA 检测结果也显示
IPTG 浓度对周质蛋白的活性影响不大，与其表达量
的影响基本一致（图 4）。此外，在没有 IPTG 的情况
下，也有少量单链抗体在周质蛋白中表达。通过对
单链抗体的表达量和活性，以及实验操作和成本等
方面的考虑，我们认为约 0.1 mmol/L 的 IPTG 浓度用
于单链抗体的表达比较合适。
2.4 诱导时间对单链抗体表达的影响
在 25℃和 0.1 mmol/L IPTG 条件下，分别诱导
培 养 0、2、4、6、8、10 和 12 h， 测 定 菌 液 浓 度，
并且采用渗透压休克法提取细胞周质蛋白，通过
Western blot 分析单链抗体的表达情况，图 5 显示在
诱导前已有少量抗体表达，加入 IPTG 诱导培养 2 h
即可得到最大抗体量。在诱导表达 2-12 h 内，周质
蛋白中的单链抗体积累量逐渐减少，与菌液浓度（图
6）呈正相关。通过 ELISA 检测周质蛋白中单链抗
体的活性，结果（图 7）表明其活性在诱导培养 2 h
时达到最大值，与菌液浓度和单链抗体的积累量相
一致。
2.0
1.5
1.0
0.5
25ć 30ć 37ć△A405 nm 0
图 2 ELISA 检测温度对单链抗体活性的影响
M
70
kD
55
40
35
25
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
M：蛋白分子量标准；1-14：0、0.01、0.03、0.05、0.08、0.1、0.3、0.5、0.8、
1.0、1.2、1.5、1.8 和 2.0 mmol/L IPTG 诱导表达的周质蛋白
图 3 Western blot 分析 IPTG 浓度对单链抗体表达量的影响
0
0 0.01 0.03 0.05 0.08 0.1 0.3
IPTG⎃ᓖ/mmol·L-10.5 0.8 1.0 1.2 1.5 1.8 2.00.51.52.52.01.0ƸA405nm
图 4 ELISA 检测 IPTG 浓度对单链抗体活性的影响
1.0
0.8
0.6
0.4
O
D
60
0
nm
0.2
0
0 2 4 6ᰦ䰤h 8 10 12
图 6 不同诱导培养时间对菌液浓度的影响
70
kD
M 1 2 3 4 5 6 7
55
40
35
25
M ：蛋白分子量标准 ；1-7 ：诱导表达 0、2、4、6、8、10 和 12 h 后的周质
蛋白
图 5 Western blot 分析诱导时间对单链抗体表达量的影响
2.5 单链抗体超量表达、纯化及检测
通过对 FvSG7 抗体表达条件的优化，确定在
2× TY 培养基中加入终浓度为 0.1 mmol/L 的 IPTG，
25℃诱导表达 2 h 即可从重组大肠杆菌周质中获得
大量的可溶性抗体。在该条件下表达提取的周质蛋
白经 Ni-NTA 柱纯化后，其产量可达到 13 mg/L。在
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.9242
加 入 200 nmol/L 纯 化 的 抗 体 进 行 ELISA 检 测 时，
显 色 反 应 30 min 后 的 OD405nm 值 达 到 2.268， 表 明
FvSG7 抗体纯化后仍保持很高的亲和力。
3 讨论
原 核 表 达 系 统 具 有 生 产 周 期 短 和 简 单 经 济
等优势，单链抗体最初构建时即是在 E. coli 中表
达［15，16］。原核生物 E. coli 也是目前发展最成熟、应
用最广泛的表达系统［13］。单链抗体在 E. coli 中的表
达主要有 3 种形式，即直接在细胞质中以包涵体形
式表达、与菌体蛋白融合表达或分泌表达［14］。包涵
体通过变复性获得具有生物活性的蛋白仍然是本领
域亟待解决的关键技术之一，Skerra 和 Plückthun［17］
最早发展的细胞周质分泌表达体系已成为各种单链
抗体最常用的表达途径［13］，但其突出的缺点是相对
表达量较低［14］。单链抗体在 E. coli 中诱导表达的影
响因素很多，包括氨基酸序列和蛋白结构等抗体的
固有特性以及一些外在因素或宿主理化环境，如培
养温度、抗体表达加工环境和过程、抗体对细胞的
毒性及分子伴侣等辅助分子的存在情况等［14，18，19］。
目前，各种抗原的特异单链抗体可以通过直接从杂
交瘤细胞中克隆或噬菌体等展示技术筛选获得，可
溶性高效表达则是获得单链抗体后需要研究的又一
重点和难点［13］，大量研究试图通过改造宿主菌、构
建融合蛋白、突变抗体基因或优化表达条件等手段
来改善抗体的表达量、稳定性或活性［14，20，21］。本
研究在优化 FvSG7 抗体的原核表达条件时，无论是
菌液浓度和周质蛋白中的单链抗体积累量，还是周
质蛋白中的抗体活性，都没有随着诱导时间的延长
而得到更多的积累和提高，分析其原因可能是表达
的 FvSG7 抗体对菌体具有一定的细胞毒性，而菌体
量的减少使得周质蛋白中单链抗体总量相应减少。
总之，本研究通过对单链抗体表达条件的优化，成
功实现抗镰刀菌单链抗体在大肠杆菌中的可溶性高
效表达，纯化后的单链抗体仍具有很高的活性，为
FvSG7 抗体的生产应用奠定了良好的实验基础，同
时为大肠杆菌生产小分子重组抗体提供了有价值的
参考。
4 结论
相对于 LB 培养基，重组大肠杆菌在 2× TY 培
养基中表达 FvSG7 抗体的效率更高。通过比较不同
诱导温度、诱导剂 IPTG 的浓度和诱导时间对可溶性
抗体表达的影响，确定 FvSG7 抗体的优化表达条件
为 ：重组大肠杆菌培养至 OD600nm 为 0.5 时，加入终
浓度为 0.1 mmol/L IPTG，25℃诱导表达 2 h。FvSG7
抗体在该条件下大量表达纯化后，产量可达到 13
mg/L，并保持很高的亲和力。
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2.0
1.5
1.0ƸA 405 nm
0.5
0
0 2 4 6ᰦ䰤h 8 10 12
图 7 ELISA 检测不同诱导时间对单链抗体活性的影响
2015,31(9) 243胡祖权等：抗镰刀菌单链抗体在大肠杆菌中可溶性表达条件的研究
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（责任编辑 李楠）