全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第10期
淀粉酶是一种具有广泛用途的酶制剂，大量应
用于粮食加工、食品工业、酿造、发酵、纺织品工
业和医药行业等，依据其用途可以分为工业用途、
医药用途、分析用途。淀粉酶在具体的应用中，不
同的用途对淀粉酶的酶学性质的要求不同，这就使
得对于不同性质的淀粉酶的需求越来越多，可以通
收稿日期 ：2013-03-21
作者简介 ：薛蓓，女，硕士，讲师，研究方向 ：食品微生物学及生物技术 ；E-mail ：13658940092@163.com
通讯作者 ：韦宇拓，E-mail ：weiyutuo@gxu.edu.cn
地芽孢杆菌 Geobacillus sp.GXS1α-淀粉酶的饱和突变及
酶学性质研究
薛蓓1  裴建新2  王治宾3  罗章1  韦宇拓4
（1. 西藏农牧学院食品科学学院，林芝 860000 ；2. 广西科学院国家非粮生物质能源工程技术研究中心，南宁 530007 ；3. 成都蓉生药业有限
责任公司，成都 610041 ；4. 广西大学微生物及植物遗传工程教育部重点实验室，南宁 530005）
摘 要 ： 采用半理性设计方法，在网站 Geno3D 上以 PDB 数据库中 B. stearothermophilus 麦芽糖淀粉酶（BSMA）的三维结构
为模板，对 AMY（α-淀粉酶）进行三维结构同源建模（二者氨基酸的同源性为 33％）。比较同源建模预测的 3D 结构和模板 BSMA
的 3D 结构关键位点，在此基础上通过计算机辅助设计软件 ProSa2003，根据能量变化确定了 AMY 三个饱和突变位点 ：D192、
E221 和 D289。利用兼并引物对 AMY 的假定活性中心位点 D192、E221 和 D289 的氨基酸分别进行饱和突变，定点（饱和）突变
库筛选得到 4 个有活力的突变子 D192A、E221N、E221L 和 D289L，并对突变酶的酶学性质进行初步研究。
关键词 ： 地芽孢杆菌 α-淀粉酶 酶学性质 饱和突变　
Saturation Mutagenesis and the Enzyme Properties of the Alpha-
Amylase from Geobacillus sp.
Xue Bei1 Pei Jianxin2 Wang Zhibin3 Luo Zhang1 Wei Yutuo4
（1. Department of Food Science，Tibet Agricultural and Animal Husbandry College，Linzhi 860000 ；2. National Engineering Research
Center for Non-food Biorefinery，Guangxi Academy of Science，Nanning 530007 ；3.Chengdu Rongsheng Pharmaceuticals
Co.，Ltd，Chengdu 610041 ；4. Key Laboratory of Microbial and Plant Genetic Engineering of Ministry of Education，
Guangxi University，Nanning 530005）
Abstract:  In this study, manipulation of half rational design was performed. Firstly, the dimensional structure of AMY（alpha-amylase of
Geobacillus sp. GXS1）was built via homology modeling by using a close-related（33% homology in sequence）maltogenic amylase（BSMA）
from B. stearothermophilus as a template. Secondly, three amino acid positions at the active site of AMY（Asp192, Glu221 and Asp289）were
selected by structural superposition onto AMY combined with energy calculation by the computer-aided design software ProSa2003. These
three putative amino acids for the active site of AMY, Asp192, Glu221 and Asp289, were subjected to saturation mutagenesis using degenerate
primers. Four mutants（Asp192Ala, Glu221Asn, Glu221Leu and Asp289Leu）were obtained from the saturation mutant library, and studied the
enzymatic properties of mutation enzyme simply.
Key words:  Geobacillus Alpha-amylase Characterization Site-saturation mutagenesis
过自然筛选，也可以对现有酶的化学改良或者蛋白
质工艺改良得到。
本研究在已克隆表达 Geobacillus sp.GXS1 的 α-
淀粉酶的基础上，对位于假定活性中心的 D192、
E221、D289 位点分别进行饱和突变，以期获得活力
较高、产麦芽糖较高的突变子，为工业化生产高活
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第10期154
力的 α-淀粉酶打下基础，并为本实验室对 α-淀粉酶
的进一步分子改造积累经验。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌种和质粒 重组表达质粒 pSE380-amy2，
E.coli XL10-Gold 和 JM109 为广西大学酶工程与发酵
研究所保存。
1.1.2 酶和试剂 Primer STAR DNA 聚合酶、各种
限 制 性 内 切 酶 λDNA /Hind III DNA Marker 为 大 连
TaKaRa 宝生物工程公司产品 ；T4 DNA 连接酶、限
制性内切酶 Dpn I 购自 MBI Fermentas 公司 ；PCR 引
物合成和测序委托测序委托上海捷瑞生物工程有限
公司完成 ；IPTG 购自 Calbiochem 公司 ；其他试剂为
国产分析纯试剂。
1.1.3 培养基 LB 培养基［1%（M/V）Tryptone，0.5%
（M/V）Yeast extract，1%（M/V）NaCl］。
1.1.4 引物 根据 3 个突变氨基酸及其两侧的碱基
序列，用 MutaPrimer 1.00 软件设计 3 对引物（表 1）。
表 1 引物序列
突变点 突变引物 引物序列（5-3）
D192 正向突变引物
TTGACgggTACCGGCTCNNKACAGTGCGC-
CACGTGCC
反向突变引物 AACGATTTTGGCACGTGGCGCAC
E221 正向突变引物
ACTTTTTCCTTCTCgggNNKGTGTGGAGCG-
ACGATCC
反向突变引物 CAATATAGCGCGGATCGTCGCTCCA
D289 正向突变引物
CGTTTTTGGACAACCATNNKACCGTGCGG-
TTTACGAAGcttGCGAT
反向突变引物 TGTCAATCGCAAGCTTCGTAAACCGCAC
下划线表示利用碱基的简并性，通过同义突变引入的限制性酶切位点，小
写字母部分表示突变的碱基。其中在 D192 位点引入 Kpn I 的酶切位点，在
E221 位点引入 Ava I 的酶切位点，在 D289 位点上引入 Hind III 的酶切位点。
1.2 方法
1.2.1 DNA 操 作 质 粒 DNA 提 取、 纯 化、 酶 切、
连接及转化参考文献［1］进行。
1.2.2 饱和突变的 PCR 扩增 以本实验室构建的重
组质粒 pSE380-amy2 为模板，利用不同引物及一步
反向 PCR 法扩增含有目的突变序列的全长基因。
1.2.3 α-淀 粉 酶 基 因 饱 和 突 变 文 库 的 构 建 与 筛
选 将上述纯化后的饱和突变 PCR 产物直接转化大
肠杆菌 XL10-Glod 宿主菌构建突变文库。挑取 LA
（Amp）平板上对应有透明圈的单菌落，液体培养后
测粗酶的最适温度、pH、Km 值、Vmax 等性质以进行
复筛，复筛的重组子测序正确后再进行突变酶的纯
化，并进一步确定突变酶纯酶的各项酶学性质。
1.2.4 饱和突变酶的基因测序及序列分析 所有突
变型 α-淀粉酶基因的测序工作委托上海捷瑞生物工
程有限公司，每个样品均重复测序 3 次，核苷酸及
其氨基酸序列利用 Vector NTI 及 NCBI、BLAST 等工
具进行分析。
1.2.5 重组酶的表达与纯化 将重组酶在 LB 培养
基培养至 0D600=0.6 左右，加入 IPTG 使其终浓度为
1 mmol/L 进行诱导表达，继续培养 24 h 后离心收集
菌体，超声波破胞，离心弃沉淀，上清液为粗酶液，
粗酶液用镍亲和层析柱纯化。
1.2.6 α-淀粉酶酶活测定 淀粉酶活力的测定按照
参考文献［2］中的 Bernfeld 法，1 个酶活力单位（1 U）
定义 ：在 65℃、pH7.0 条件下，1 min 生成 1 μmol 葡
萄糖所需的酶量。淀粉酶的比活力（U/mg）= 淀粉
酶的活力 / 蛋白含量。
1.2.7 蛋 白 含 量 测 定 按 照 参 考 文 献［3］ 中 的
Bradford 方法测定。
2 结果
2.1 amy基因饱和突变PCR
利用设计的 3 对突变引物，以野生型表达质粒
pSE380-amy2 为模板，反向 PCR 扩增得到 5.6 kb 左
右的突变型表达质粒。PCR 产物经 1.0% 的琼脂糖
凝胶电泳分析，结果（图 1）表明，扩增片段约为 5.6
kb，与预期的结果相符。PCR 产物经 Dpn I 消化模
板后，直接转化 XL10-gold 感受态细胞。
2.2 突变体的获得及序列分析
构建定点饱和突变筛选文库，利用平板筛选方
法，筛选到 12 个有酶活的突变子，提取质粒后经
测序，结果表明有 8 个突变子为同义突变，另外 4
个突变子分别为 D192A、E221N、E221L 和 D289L，
其中 D192A 突变子是 192 位的天冬氨酸（GAT）变
为丙氨酸（GCT），E221N 突变子是 221 位的谷氨酸
（GAA）变为天冬酰氨（AAT），E221L 突变子是 221
位的谷氨酸（GAA）变为亮氨酸（TTG），D289L 突
2013年第10期 155薛蓓等 ：地芽孢杆菌 Geobacillus sp.GXS1α-淀粉酶的饱和突变及酶学性质研究
变子是 289 位的天冬氨酸（GAT）变为亮氨酸（CTT），
野生型与突变型的核苷酸及氨基酸序列用 NTI 软件
分析比对结果如图 2 所示。
2.3 突变型AMY的纯化及SDS-PAGE分析
突变菌株用 IPTG 诱导，粗酶液 SDS-PAGE 蛋
白质电泳结果（图 3）表明，突变菌株均具有明显
的 53 kD 左右的特征蛋白条带出现，重组蛋白的分
子量大小与理论值相符，带有 6 个 His 标签的突变
酶经镍柱亲合层析纯化处理后，可明显的见到一条
M ：λDNA/Hind Ⅲ Marker ；1 ：Revert PCR of mut-D190 ；2 ：Revert
PCR of mut-E219 ；3 ：Revert PCR of mut-D287
图 1 重组质粒 pSE380-amy2 的反向 PCR
23.13
9.416
6.557
4.361 5.6
kbkb
M 1 2 3
2.322
2.027
536 550 560
Kpn lA
B
570 580 590
631 640 650
Ava l
660 670 680 690
841 850
Hind III
860 870 880 890 900
171 180 190 200 210 220 230 240
266 280 290 300 310 320 330 340
536
536536536536536536
WILD
D192A
D289L
E221L
E221N
Consensus
631
631631631631631631
WILD
D192A
D289L
E221L
E221N
Consensus
841
841841841841841841
WILD
D192A
D289L
E221L
E221N
Consensus
171
171171171171171171
WILD
D192A
D289L
E221L
E221N
Consensus
266
266266266266266266
WILD
D192A
D289L
E221L
E221N
Consensus
图 2 野生型和突变型 α-淀粉酶核苷酸（A）与氨基酸（B）的同源性分析
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第10期156
蛋白质条带出现。 这说明野生型在 pH6.0-8.0 之间受 pH 影响比较小，
而 D192A、E221L 和 D289L 突变酶的酶活在这个范
围内受 pH 的影响比较大。116
kD kD
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9
66.2
45 53
35
25
18.4
M ：蛋 白 质 Marker ；1: 包 含 空 白 质 粒 pSE380 的 重 组 大 肠 杆 菌
JM109（DE3）；2-5 ：分别包含突变子 D192A/E221N/E221L/D289L
的重组大肠杆菌 JM109（DE3）；6-9 ：经镍柱亲合层析纯化的重组
突变酶 D192A/E221N/E221L/D289L
图 3 表达产物的 SDS-PAGE 电泳分析
2.4 野生型和突变型酶最适温度的比较
从 30-100℃，对野生型和突变型 α-淀粉酶进
行酶活的测定，结果（图 4）表明，野生型、突变
型 D192A 和 E221N 的酶活最适温度为 65℃ ；突变
型 E221L 的酶活最适温度为 70℃ ；突变型 D289L
的酶活最适温度为 60℃。与野生酶相比，E221N、
D192A 突 变 酶 酶 活 受 温 度 的 影 响 程 度 比 较 小，
E221L、D289L 突变酶酶活受温度的影响程度大些。
20 30 40 50 60 70 80 90 100 110
0
20
40
60
80
100 WILD
D192A
D289L
E221N
E221L
Temperatureć
R
el
at
iv
e
ac
tiv
ity
%
图 4 野生型与突变型 α-淀粉酶在 40-70℃范围内酶活受
温度的影响
2.5 野生型和突变型酶最适pH的比较
pH 值从 pH4.0-10.0，对野生型和突变型的 α-
淀粉酶进行酶活的测定，结果（图 5）表明，野生
型、 突 变 型 D192A、E221N 和 D289L 的 酶 活 最 适
pH 都在 7.0，其中 E221N 与野生型几乎没有区别，
而突变型 E221L 的酶活最适 pH 是 6.5，比野生型
下降了 0.5 U。在 pH6.0-8.0 之间，野生型、突变型
E221N 酶活随 pH 值的升高变化比较缓慢，而突变
型 D192A、E221L 和 D289L 的酶活变化趋势比较大，
4 5 6 7 8 9 10
0
20
40
60
80
100
D289L
D192A
E221L
wild
E221N
pH
R
el
at
iv
e
ac
tiv
ity
%
图 5 野生型与突变型 α-淀粉酶在 pH4.0-10.0 的范围内酶
活受 pH 的影响
2.6 野生型和突变型酶的比活力、Km值的测定
对 Km 值的计算，采用的是双倒数计算法，在
保持测定体系不变的情况下，使用底物的不同浓度
进行测量，然后绘制出双倒数图，从而得到的 X 轴
的截距的负倒数即为 Km 值。比活是每毫克酶蛋白
的酶活力，经镍柱分离纯化的酶，测定其活力并用
Bradford 方法测出蛋白质浓度后即可求出。野生酶
及突变酶的 Km 值、比活力结果如表 2 所示。
表 2 野生酶及突变酶 Km 值和比活力的测定
测试因子 wild mut-D192A mut-E221N mut-E221L mut-D289L
Km 值（mg/mL） 2.93 3.41 2.66 3.84 4.34
比活力（U/mg） 353.95 269.78 370.64 318.25 170.45
2.7 野生型和突变型酶Tm的测定
Tm 值是一个能够反应热稳定性的参数，将经镍
柱纯化后的酶液，在不同的温度下（50-90℃）处理
20 min，然后再按照酶活的测定方法进行测定。结
果（图 6）表明，与野生型相比，突变体 D192A 的
Tm 值几乎没变 ；突变体 E221L、E221N 的 Tm 值分
别提高了 2.5℃、2℃ ；突变体 D289L 的 Tm 值下降
了 1.5℃。
2.8 野生型与突变型的HPLC产物分析比较
在含有 1%（W/V）底物（可溶性淀粉）的磷
酸缓钠冲液（pH 为野生型和突变型的最适 pH）中
加入纯化后的野生型和突变型酶，反应终体积为
1 mL，在最适温度下分别水浴 1 h 后，将反应液放
在沸水中煮沸 5 min 终止其反应，用 HPLC 检测其
2013年第10期 157薛蓓等 ：地芽孢杆菌 Geobacillus sp.GXS1α-淀粉酶的饱和突变及酶学性质研究
反应产物。野生酶及突变酶的水解产物中各组分所
占比例（表 3）显示。野生型与突变型酶都可以把 1%
可溶性淀粉转化为麦芽糖，相对于野生型（0.26%），
突变型 D192A、E221L 和 D289L 转化麦芽糖的浓度
下降了，分别为 0.099%、0.22% 和 0.08%，而突变
型 E221N 转化麦芽糖的浓度稍有提高为 0.34%。
表 3 野生型与突变型 α-淀粉酶水解淀粉产物中各组分所
占比例比较
组分（%） wild mut-D192A mut-E221L mut-E221N mut-D289L
葡萄糖 18.96 21.7 33.2 18.36 16.38
麦芽糖 48.78 39.4 37.95 49.9 48.78
麦芽三糖 32.27 38.89 28.8 31.8 34.8
2.9 α淀粉酶基因氨基酸序列同源建模
通过网站 Geno3D 对所克隆到 α-淀粉酶基因氨
基酸序列进行同源建模 3D 结构预测，比较同源建
模预测的 3D 结构和模板 3D 结构关键位点，然后据
此选择 3 个待突变位点，这 3 个位点分别是 192D、
221E 和 289D，根据模型分析正好对应于 BSMA 的
328D、357E 和 424D（ 图 7）， 而 328D、357E 和
424D 位点是 BSMA 活性中心最关键的 3 个位点，对
转糖苷作用发挥着重要的作用。
2.10 突变酶和野生酶活性中心氨基酸之间的氢键
分析
对突变酶和野生酶活性中心氨基酸之间的氢键
进行了分析，结果表明当 192 位突变为 Ala，221 位
突变为 Asn 或 Leu 时，289 位突变为 Leu 时活性中
心氨基酸残基间的氢键距离发生了的变化，结果如
图 8，这些变化有可能对突变酶的酶学性质产生着
重要的影响。
图 6 野生型与突变型 AMY 的 Tm 值
50 55 60 65 70 75 80 85 90 95
0
50
100
wild
D192A
E221L
D289L
E221N
Temperatureć
R
es
id
ua
l a
ct
iv
ity
%
ASP192
GLU221
ASP289
ASP328
GLU357
ASP424
A
B
图 7 alpha-amylase 催化区同源建模（A）及 BSMA（B）
的 3D 结构图
2.11 利用ProSa2003能量分析
利用软件对 α- 淀粉酶分子 D192、E221、D289
位氨基酸在被替换为其余 19 种氨基酸时进行了能量
预测，结果如图 9，从预测结果来看，D289 的稳定
性较差，在突变为其他 19 种氨基酸时能量都出现了
升高，这也可能是导致对该点突变后没能筛选到酶
活提高的突变酶的原因之一。
3 讨论
通常，对于一个未知结构蛋白质，如果能在蛋
白质结构数据库中找到同源性大于 30% 的已知结
构作模板，其预测准确性可达到 0.15-2 nm［4］。而
Geobacillus sp.GXS1 的 α-淀粉酶与 B. stearothermophi-
lus maltog-enic amylase（BSMA） 的 同 源 性 为 33%，
应该能预测出具有一定准确性的空间结构，所推测
的 3 个活性中心氨基酸则是保守区中更为保守的残
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第10期158
基，在许多 α-淀粉酶中都能找到它们的存在［5-11］。
本研究对 Geobacillus sp. GXS1α-淀粉酶的 3 个
位 点 进 行 饱 和 突 变， 大 量 筛 选 后 仅 筛 到 D192A、
E221N、E221L、D289L 四个有活力的突变子，说明
这 3 个位点是 Geobacillus sp. GXS1α-淀粉酶中比较关
键的氨基酸残基。对突变酶和野生酶的三维结构利
用 DeepViewer 软件进行分析，分析结果显示和底物
结合的活性中心氨基酸残基有 9 个 ：Phe15、Trp64、
His77、Pro67、Asp192、Glu221、His288、Asp289、
Tyr325，这些氨基酸与底物以氢键的作用方式结合
在一起，并且相对较为保守［12-16］。
研究表明，酶分子能量的降低可以导致酶分子
稳定性的提高［17-19］，这种稳定性的提高有可能促使
突变酶的酶学性质发生改变，同时突变酶其他空间
结构上的微小变化也可对其酶学性质产生直接或间
接的影响。本研究中 E221 突变为 N 时能量是降低的，
试验结果表明突变酶比活稍有提高，与预测结果一
致，并且对于氨基酸 Asn，由于其带有具有极性性
质的侧链基团，这些极性侧链基团可以形成更多的
氢键，使底物与酶分子的结合力更强，更稳定，促
使酶活力发生改变 ；D192、E221 分别突变为 A、L
时能量也是降低的，突变酶的比活并未提高，并且
对于氨基酸 Ala、Leu 来说，由于他们带有非极性的
侧链基团，这些非极性的侧链基团对增加酶的疏水
性起着非常重要的作用，酶的疏水性增加，底物就
更容易与其结合，促使酶活力得到改善，但是本研
究中的 D192A，E221L 和 D289L 突变酶的比活并未
得到改善，这有可能是因为这 3 个点处于活性中心，
相对比较保守，在 α-淀粉酶的进化过程中相对比较
稳定，一旦改变它，有可能导致整个酶的三维结构
A B C
D E
A ：野生 α-淀粉酶 ；B ：突变酶 D192A ；C ：突变酶 E221N ；D ：突变酶 E221L ；E ：突变酶 D289L.
碳原子、氧原子和氮原子分别用白色、红色、黑色表示 ( 颜色标识见电子版 )
图 8 野生型与突变型 α-淀粉酶活性中心的氢键结构示意图
图 9 D192 位、E221 位和 D289 位单点饱和突变能量
变化预测结果
D192A
E221N
E221L
wt D192A E221L E221N D289L diff1 diff2 diff3 diff4
D289L
-2
0 100 200 300 400
-1
0
2013年第10期 159薛蓓等 ：地芽孢杆菌 Geobacillus sp.GXS1α-淀粉酶的饱和突变及酶学性质研究
发生重大的变化，从而影响酶的酶学性质，突变酶
的酶学性质与三维空间结构之间的关系值得我们进
一步的研究探讨。
4 结论
通过定点饱和突变成功筛选到了 4 个突变酶
D192A、E221L、E221N 和 D289L。 突 变 酶 D192A
的比活都有所下降，最适温度、最适 pH 值、Tm 值
没变 ；突变酶 E221L 的比活有所升高，最适温度、
最适 pH 值没变，Tm 值升高了 2℃ ；突变酶 E221N
活力有所下降，最适 pH 值由原来的 7.0 变为 6.5，
最 适 温 度 由 原 来 的 65 ℃ 变 为 70 ℃，Tm 值 升 高 了
2.5℃ ；突变酶 D289L 的比活有较大的下降，同时
最适温度也由原来的 65℃变为 60℃，最适 pH 值不
变，Tm 值下降了 1.5℃ ；突变型 D192A、E221L 和
D289L 转化麦芽糖的浓度下降了，而突变型 E221N
转化麦芽糖的浓度稍有提高。
参 考 文 献
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［M］. Third Edition. New York ：Cold Spring Harbor Laboratory
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［2］ Bernfeld P. Amylases, α and β ［M］//Colovick SP, Kaplan NO eds.
Methods in Enzymology（Vol. 1）. New York ：Academic Press,
1955 ：149-158.
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2000.
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site mutant alpha-amylase from Bacillus subtilis comnlexed with
maltopentaose ［J］. J Mol Biol, 1998, 277（2）：393-407.
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thermostable alpha-maylase from Bacjllus lichenniformis refined at
1.7 Å resolution ［J］. Mol Cells, 1997, 7 ：251-258.
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（责任编辑 马鑫）