全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第8期
谷胱甘肽（GSH）是广泛存在于自然界的一种
小分子三肽巯基化合物［1］，具有抗氧化，解毒和提
高免疫力的功能，被广泛应用于食品，医药和化妆
品行业［2，3］。目前酵母发酵法是 GSH 生产最具有
发展潜力的方法之一。通过控制发酵条件，改善溶
氧［4］，pH［5］或采用补料分批发酵［6］来增加细胞密
度和提高 GSH 的生产已有报道。发酵培养基中添
加氨基酸或相关的氨基酸前体也有利于提高细胞内
GSH 的含量［7-10］。采用基因工程技术构建出具有高
谷胱甘肽合成能力的菌株来提高 GSH 生产的方法历
收稿日期 ：2013-02-12
基金项目 ：南昌大学食品科学与技术国家重点实验室自由探索课题（201113）
作者简介 ：陈加利，女，硕士，研究方向 ：功能食品发酵 ；E-mail ：ahhblscjl@163.com
通讯作者 ：段学辉，男，教授，研究方向 ：生物技术 ；E-mail ：xhduan@ncu.edu.cn
重组酿酒酵母合成谷胱甘肽的研究
陈加利  吴量  王娟  段学辉
（南昌大学食品科学与技术国家重点实验室 生命科学与食品工程学院，南昌 330047）
摘 要 ： 利用 PCR 方法以酿酒酵母 Saccharomyces cerevisiae S288c 基因组 DNA 为模板，PCR 扩增 γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶
（GSH1）及谷胱甘肽合成酶（GSH2）基因，以乙醇脱氢酶（ADH1）启动子进行表达，并以 Kanr 基因和 Hygr 基因作为筛选标记，
构建了两个重组表达质粒 YEplace181AK-GSH1 和 YEplace181AH-GSH2。采用电击法将这两个质粒分别和同时转入工业酿酒酵母菌
株 Saccharomyces cerevisiae TS013，在含有 G418 或（和）Hygromycin 的平板上筛选阳性克隆 S.TS013/GSH1、S.TS013/GSH2 和 S.TS013/
GSH1+GSH2。重组菌进行摇瓶发酵，采用四氧嘧啶法测定培养细胞合成谷胱甘肽含量。结果显示，不同转化子重组菌的胞内谷胱
甘肽产量比宿主菌分别提高了 44.11%、29.79% 和 56.47%。
关键词 ： γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶 谷胱甘肽合成酶 谷胱甘肽 酿酒酵母
Glutathione Biosynthesis by Engineered Saccharomyces cerevisiae
Chen Jiali Wu Liang Wang Juan Duan Xuehui
（State Key Laboratory of Food Science and Technology，School of Life Science and Food Engineering，
Nanchang University，Nanchang 330047）
Abstract:  The GSH1 and GSH2 genes were amplified from the extracted total DNA of Saccharomyces cerevisiae S288c by PCR
and expressed under the control of alcohol dehydrogenase（ADH1）promoter. With Kanr or Hygr as the selective markers, two expression
vectors YEplace181AK-GSH1 and YEplace181AH-GSH2 were constructed. The recombinant plasmids were transformed into an industry
strain Saccharomyces cerevisiae TS013 respectively and simultaneously by electroporation, and three recombinant strains S.TS013/GSH1,
S.TS013/GSH2 and S.TS013/GSH1+GSH2 were generated by screening on YPD plates supplemented with G418 or（and）Hygromycin. The
transformants were cultured in fermentation media, afterwards intracellular GSH content was detected by the method of ALLOXAN. Compared
with the content of control strain, the glutathione content of recombinant strains increased by 44.11%, 29.79% 和 56.47%, respectively.
Key words:  γ-Glutamylcysteine synthetase GSH synthetase Glutathione Saccharomyces cerevisiae
来受到关注。Ohtake 等［11］尝试在酵母中表达 E. coli
B 的 GSH1 基因，将 GSH1 基因的全部编码片段与 S.
cerevisiae 98 的一个启动子融合，结果显示，转化体
的 GSH1 活性和 GSH 的胞内含量分别提高了约 100
倍 和 3 倍。Christine 等［12］ 将 含 有 E. coli 中 GSH1
和 GSH2 基因的质粒 pINEIII 转化到 S. cerevisiae 中，
GSH 在胞内的积累质量分数达到 1.8%，明显提高
了 酵 母 菌 合 成 GSH 的 能 力。Fan 等［13］ 克 隆 了 酿
酒酵母 GSH1 基因并将其导入 S. cerevisiae YSF-31，
重组菌株的 GSH 含量是宿主菌的 1.5 倍。饶志明
2013年第8期 161陈加利等 ：重组酿酒酵母合成谷胱甘肽的研究
等［14］克隆了酿酒酵母 GSH1 基因，将其整合到巴
斯德毕赤氏酵母中，构建了重组菌 P. pastoris x-33
（pGAPZA-GSH1），重组酵母的 GSH1 酶活力达到宿
主菌的 3 倍。
生物体内的 GSH 合成有两步关键酶促反应［15］：
谷氨酸、半胱氨酸在 γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶催化
下合成 γ-谷氨酰半胱氨酸，然后在谷胱甘肽合成酶
作用下，γ-谷氨酰半胱氨酸和甘氨酸合成谷胱甘肽。
其中第一步反应为限速反应，众多研究者关注 GSH1
基因对酵母菌 GSH 生产能力的影响。本研究利用
PCR 方法从 S. cerevisiae S288c 基因组 DNA 中获得合
成 GSH 的两个酶基因 GSH1 和 GSH2，将它们分别
和同时导入工业酿酒酵母 S. cerevisiae TS013，通过
重组菌和出发菌分别发酵培养和细胞内合成 GSH 分
析比较，考察 GSH1 和 GSH2 两个酶基因对酵母合成
GSH 的影响。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株和质粒 酿酒酵母 Saccharomyces cerevis-
iae S288c，Saccharomyces cerevisiae TS013 及 大 肠 杆
菌 E. coli DH5α 为本实验室保存。YEplace181A 为带
ADH1 启动子的表达载体，pFA6a-kanMX6 和 pYM20
分别带有 Kanr 基因和 Hygr 基因，均为南昌大学黄
国 俊 教 授 实 验 室 惠 赠。YEplace181AK-GSH1 带 有
GSH1 和 Kanr 基因，YEplace181AH-GSH2 带有 GSH2
和 Hygr 基因，为本研究构建。
1.1.2 主要试剂 Taq DNA 聚合酶，限制性内切酶
Pst I、Sal I、Sma I、BamH I、EcoR I 和 Kpn I，T4 DNA
连接酶，DNA Marker，G418，Hygromycin 等购自 Ta-
KaRa（大连）公司 ；DNA 纯化试剂盒，质粒提取试
剂盒与凝胶回收试剂盒购自 Tiangen（北京）公司 ；
PCR 引物由 Invitrogen 公司合成。
1.1.3 培养基 LB 培养基（g/L）：氯化钠 10，酵母
浸粉 5，蛋白胨 10，pH7.0，121℃灭菌 15 min，用于 E.
coli 菌株的培养。
LB 选择培养基（g/L）：氯化钠 10，酵母浸粉 5，
蛋白胨 10，pH7.0，121℃灭菌 15 min，冷却后加入
Amp，使其终浓度为 60 μg/mL，用于 E. coli 转化子
的培养。
YPD 培养基（g/L）：葡萄糖 20，酵母浸粉 10，
蛋白胨 20，121℃灭菌 15 min，用于酵母菌的培养。
YPD 选 择 培 养 基（g/L）：葡 萄 糖 20， 酵 母 浸
粉 10，蛋白胨 20，121℃灭菌 15 min，冷却后加入
G418 和 Hyg，使其终浓度分别为 150 μg/mL 和 125
μg/mL，用于酵母菌转化子的筛选。
发酵培养基（g/L）：葡萄糖 35，酵母粉 10，硫
酸铵 2.0，KH2PO4 1.5，MgSO4·7H2O 0.5，肌醇 0.1。
121℃灭菌 15 min，用于酿酒酵母的 GSH 发酵。
1.2 方法
1.2.1 引物设计和 PCR 扩增
1.2.1.1 GSH1 基因的扩增 根据 GenBank 上公布的
GSH1 基因序列，设计引物。GSH1-F ：GGACGTCGA-
CATGGGACTCTTAGCTTTGGGCAC（Sal I）；GSH1-
R ：GTGACCCGGGATCTTTATATTCTTGTTCCTCGT-
GGC（Sma I）。 以 Saccharomyces cerevisiae S288c 基
因组 DNA 为模板进行 PCR 扩增。PCR 反应条件为 ：
95℃ 3min ；95℃ 30 s，67℃ 30 s，72℃ 5.25 min，2
个循环 ；95℃ 30 s，66℃ 30 s，72℃ 5.25 min，3 个
循环；95℃ 30 s，65℃ 30 s，72℃ 5.25 min，4 个循环；
95℃ 30 s，72℃ 5.25 min，30 个循环 ；72℃ 5 min。
1.2.1.2 GSH2 基 因 的 扩 增 根 据 GenBank 上 公 布
的 GSH2 基因序列，设计引物。GSH2-F ：GAGACTG
CAGGCACTACTCCTATAAAATATGGCACA（Pst I）；
GSH2-R ：CCAGGGATCCGCAAGACCAAGATGAATTT
CTAAACG（BamH I）。 以 Saccharomyces cerevisiae S-
288c 基因组 DNA 为模板进行 PCR 扩增，反应条件：
95℃ 3 min ；95℃ 30 s，68℃ 30 s，72℃ 4.5 min，2
个循环 ；95℃ 30 s，67℃ 30 s，72℃ 4.5 min，3 个
循环；95℃ 30 s，66℃ 30 s，72℃ 4.5 min，4 个循环；
95℃ 30 s，72℃ 4.5 min，30 个循环 ；72℃ 5 min。
1.2.1.3 Kanr 基因的扩增 根据 pFA6a-kanMX6 载体
序列，设计引物 ：Kanr-F ：GTGTCCCGGGAGATCTG-
TTTAGCTTGCCTCGTCC（Sma I）；Kanr-R ：GTCGG-
AATTCTTTAAACTGGATGGCGGCGTT（EcoR I）。
PCR 反应条件 ：95℃ 3 min ；95℃ 30 s，63℃ 30 s，
72℃ 3 min，2 个循环 ；95℃ 30 s，62℃ 30 s，72℃
3 min，3 个循环 ；95℃ 30 s，61℃ 30 s，72℃ 3 min，
4 个循环 ；95℃ 30 s，72℃ 3 min，30 个循环 ；72℃
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第8期162
5 min。
1.2.1.4 Hygr 基因的扩增 根据 pYM20 载体序列，
设 计 引 物 ：Hygr-F ：GTGCGGATCCAGATCTGTTTA-
GCTTGCCTCGTCC（BamH I）；Hygr-R ：CGTTCCCG-
GGGTTAAAGCCTTCGAGCGTCCCA（Sma I）。PCR 反
应条件为 ：95℃ 3 min ；95℃ 30 s，66℃ 30 s，72℃
4 min，2 个循环 ；95℃ 30 s，65℃ 30 s，72℃ 4 min，
3 个循环；95℃ 30 s，64℃ 30 s，72℃ 4 min，4 个循环；
95℃ 30 s，72℃ 2 min，30 个循环 ；72℃ 4 min。
1.2.2 重组表达质粒 YEplace181AK-GSH1 和 YEpla-
ce181AH-GSH2 的构建 PCR 扩增后的 Kanr 片段用
Sma I/EcoR I 双 酶 切， 与 同 样 酶 切 的 YEplace181A
连接构成质粒 YEplace181AK，然后经过 Sal I/Sma
I 双酶切的 GSH1 片段与同样酶切的 YEplace181AK
连接构成质粒 YEplace181AK-GSH1。GSH2 片 段 用
Pst I/BamH I 双 酶 切， 插 入 到 YEplace181A 的 Pst
I/BamH I 酶切位点构成 YEplace181A-GSH2，然后与
经过 BamH I/Sma I 双酶切的 Hygr 片段连接构成质
粒 YEplace181AH-GSH2。利用 DNA 纯化试剂盒回
收纯化双酶切产物。将纯化后的 DNA 片段和载体用
T4 DNA 连接酶 16℃连接过夜。连接产物转化 E. coli
DH5α 感受态细胞，在 LB 选择培养基上培养，挑取
单菌落，进行菌落 PCR［16］及提取质粒酶切［17］鉴定
筛选阳性克隆。
1.2.3 S.cerevisiae TS013 的转化和质粒的稳定性 采
用电击法（2.5 kV，25 μF，200 X，4.8 ms），将质粒
YEplace181AK-GSH1 和 YEplace181AH-GSH2 分别和
同时转入 S. cerevisiae TS013 感受态细胞，转化子在
1 mol/L 山梨醇中静止孵育 1 h，然后在 YPD 培养基
中震荡培养 4 h，分别在含有 150 μg/mL G418、125
μg/mL Hyg 和 150 μg/mL G418+125 μg/mL Hyg 的 YPD
平板上筛选转化子。筛出的转化子在更高浓度的抗
生素平板进行复筛。
为了检测质粒的稳定性，将构建的工程酵母
菌株在 YPD 平板上连续 传 代 10 次。 每 一 代 菌 株
在 28℃培养 36 h，第 10 代的菌株在 28℃培养 2 d
后，随即选取 50 个单菌落转移到 0.5 mL 无菌水中
室温饥饿 4 h。取一环细胞悬液接种在分别含有 150
μg/mL G418、125 μg/mL Hyg 和 150 μg/mL G418+125
μg/mL Hyg 的 YPD 平板上 28℃培养 2 d。
1.2.4 生物量的测定 取 10 mL 的发酵液，5 000
r/min 离心 10 min。弃上清，去离子洗涤菌体 2 次，
置于烘箱中，85℃烘干至恒重。
1.2.5 谷胱甘肽含量分析 采用四氧嘧啶法［18］测
定 GSH。取 5 mL 发酵后的菌体离心后清洗两次，加
5 mL 的去离子水，100℃煮沸 5 min，迅速置于冰上
冷却 3 min。细胞悬液经 8 000 r/min 离心 5 min 后，
上清液用于测定胞内 GSH 含量。发酵液中总 GSH
含量测定为直接取 5 mL 发酵液 100℃煮沸 5 min，
迅速置于冰上冷却 3 min，8 000 r/min 离心 5 min，
分离上清用于测定。
1.2.6 统计分析 数据处理与分析采用 SPSS19.0 的
单因素方差分析，分别以 P<0.05、P<0.01 为差异显
著性与极显著判断标准，并用 LSD 法进行多重比较。
结果以平均值 ± 标准差表示。
2 结果
2.1 GSH1、GSH2、Kanr和Hygr基因的克隆
以 Saccharomyces cerevisiae S288c 染 色 体 DNA，
pFA6a-kanMX6，pYM20 为模板利用上述引物进行基
因扩增，扩增后的片段经 1% 琼脂糖凝胶电泳检测
分别在约 2.5、2.2、1.4 和 1.7 kb 处有明显的条带（图
1），即 GSH1、GSH2、Kanr 和 Hygr 基因，与预期结
果一致。
2.2 酵母菌重组表达质粒的构建
根据方法 1.2.2 构建表达载体，构建的表达载体
图谱如图 2 所示。YEplace181AK 经 Smal I 和 EcoR I
双酶切出现 6.5 kb 和 1.5 kb 两条谱带，YEplace181-
AK-GSH1 经 EcoR I 单酶切出现 7.9 kb 和 2.5 kb 两条
谱带，YEplace181A-GSH2 经 Pst I 和 BamH I 双酶切
出现 6.4 kb 和 2 kb 两条谱带，YEplace181AH-GSH2
经 Kpn I 单酶切出现 3 kb 和 7 kb 两条谱带。结果（图
3）表明重组载体的连接成功。
2.3 S. cerevisiae TS013的转化及转化子验证
采用电转法转化酿酒酵母细胞。因为 S. cerevis-
iae TS013 在 含 有 150 μg/mL G418 和 125 μg/mL Hyg
的平板上不能生长，所以用含有 150 μg/mL G418 的
YPD 筛选 S.TS013/GSH1，用含有 125 μg/mL Hyg 的
YPD 筛选 S.TS013/GSH2，用含有 150 μg/mL G418 和
125 μg/mL Hyg 的 YPD 筛选 S.TS013/GSH1+GSH2。每
2013年第8期 163陈加利等 ：重组酿酒酵母合成谷胱甘肽的研究
个菌株选取 5 个转化子在含有更高抗生素浓度 175
μg/mL G418，150 μg/mL Hyg 和 175 μg/mL G418+150
μg/mL Hyg 的平板复筛，快速长出的菌落菌株用于进
一步的分析。
基因工程菌在无筛选压力下连续培养 10 代，统
计生长在含有 G418 或（和）Hyg 的 YPD 平板上的
菌落数，结果表明重组菌仍有 90% 的菌株含有质粒。
2.4 重组菌株的生长生物量
随机挑选重组菌株 S.TS013/GSH1、S.TS013/GS-
H2 和 S.TS013/GSH1+GSH2 的一个转化子与宿主菌
株 S.TS013 在 50 mL 的 YPD 中培养 24 h，以 10% 的
接种量接种到相同体积的发酵培养基中，30℃，200
r/min 培养 48 h。测定各个菌株的干重（图 4），转
入质粒的 S.TS013/GSH1、S.TS013/GSH2 和 S.TS013/
GSH1+GSH2 重组菌的细胞量比亲本菌株分别减少
6.16%、6.53% 和 10.75%，重组质粒的导入对菌株
的生长和生物量均有不同程度的影响，但是影响并
不明显。
3000
bp
M 1
2500
2500
bp
M 2
2000
2000
bp
M 3
1000
1500
2000
bp
M 4
1500
M ：1kb DNA 分子量标准 ；1 ：GSH1 基因 ；2 ：GSH2 基因 ；3 ：Kanr 基因 ；4 ：Hygr 基因
图 1 PCR 法扩增 GSH1、GSH2、Kanr 和 Hygr 基因
10.4 kb
YEplace181AK-GSH1
PBR322Amp
Leu 2
EcoR I
Kan
Sma I
GSH1
Ori
1
Hind III
ADHI
Sal I
Pst I
A
10.3 kb
YEplace181AH-GSH2
PBR322
Amp
Leu 2
Sma I
Hyg
BamH I
GSH2Ori
1
Hind III ADHI
Sal 2
Pst I
B
图 2 YEplace181AK-GSH1（A）和 YEplace181AH-GSH2（B）重组载体的示意图
8000
bp
M 1
6000
1500
8000
bp
M 2
6000
2500
8000
bp
M 3
2000
6000
8000
bp
M 4
6000
3000
M ：1kb DNA 分 子 量 标 准 ；1 ：YEplace181AK 的 Smal I/EcoR I 双 酶 切 ；2 ：YEplace181AK-GSH1 的 EcoR I 单 酶 切 ；3 ：YEplace181A-
GSH2 的 Pst I/BamH I 双酶切 ；4 ：YEplace181AH-GSH2 的 Kpn I 单酶切
图 3 重组质粒的酶切分析
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第8期164
因的拷贝数均能提高酵母 GSH 合成能力，其中单独
增加 GSH1 基因的拷贝数比单独增加 GSH2 基因的拷
贝数更能提高胞内 GSH 的含量。当 GSH1 和 GSH2
基因拷贝数均增加时，胞内 GSH 的含量最高。
8
8.5
9
9.5
10
10.5
11
㧼փ
ᒢ䟽
g/L
)
S.TS013 S.TS013/
GSH1
S.TS013/
GSH2
S.TS013/
GSH1+GSH2
㧼Ṛ
图 4 各个菌株生物量的比较
2.5 GSH1和GSH2基因对酿酒酵母合成谷胱甘肽的
影响
在相同的条件下培养重组菌株和出发菌株，分
别收集菌体，提取蛋白后进行 SDS-PAGE 检测，在
检测结果中目的蛋白大小为 78 kD（GSH1）和 56
kD（GSH2）左右，重组菌株与对照菌株均有较深条
带，蛋白条带无明显差异，故对重组菌发酵合成谷
胱甘肽的产物量进行检测，以判断目的基因的活性
表达情况。
发酵终止时，测定酵母细胞内和发酵液中总的
GSH 的含量，从图 5 中可以看出，S.TS013/GSH1、
S.TS013/GSH2、S.TS013/GSH1+GSH2 的发酵液中总
的 GSH 含量比宿主菌分别提高了 22.56%、12.82%
和 26.30%。由图中数据分析得出，S.TS013/GSH1+
GSH2 较 对 照 菌 和 S.TS013/GSH2 有 极 显 著 提 高
（P<0.01），较 S.TS013/GSH1 略有提高，但差异不明
显（P>0.05）。S.TS013/GSH2 较对照菌株和 S.TS013/
GSH1 有极显著提高（P<0.01）。S.TS013/GS-H1 较对
照组有极显著差异（P<0.01）。
从图 6 可以看到，S.TS013/GSH1、S.TS013/GSH2
和 S.TS013/GSH1+GSH2 胞内 GSH 含量比亲本菌株
S.TS013 分别提高了 44.11%、29.79% 和 56.47%。细
胞外的 GSH 含量相差不大（数据未给出）。由图
6 中 数 据 分 析 得 出，S.TS013/GSH1、S.TS013/GSH2
和 S.TS013/GSH1+GSH2 较 对 照 菌 均 有 极 显 著 差
异（P<0.01）。S.TS013/GSH1、S.TS013/GSH2 和
S.TS013/GSH1+GSH2 各个菌株之间均有极显著差异
（P<0.01）。结果表明，增加 GSH1 或（和）GSH2 基
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
㧼Ṛ
ਁ䞥
⏢ѝ
ᙫG
SH
ਜ਼䟿
mg
/L

S.TS013 S.TS013/
GSH1
S.TS013/
GSH2
S.TS013/
GSH1+GSH2
0
2
4
6
8
10
12
14
16
㧼Ṛ
㜎޵
G
SH
ਜ਼䟿
mg
/L

S.TS013 S.TS013/
GSH1
S.TS013/
GSH2
S.TS013/
GSH1+GSH2
图 5 工程菌和受体菌发酵液中 GSH 含量的比较
图 6 工程菌和受体菌胞内 GSH 含量的比较
3 讨论
GSH 是一种功能性小分子肽，在医药、食品和
化妆品行业应用日益增加。发酵法和生物酶催化法
合成 GSH 已成为 GSH 生产研究的主流。采用基因
重组技术构建 GSH 合成酶高表达工程菌为 GSH 的
生产研究开辟了新途径。
本试验以酿酒酵母基因组 DNA 为模板 PCR 扩
增 出 GSH1 和 GSH2 基 因， 结 合 抗 生 素 抗 性 作 为
筛选标记构建适合转入工业酿酒酵母的重组质粒
YEplace181AK-GSH1 和 YEplace181AH-GSH2，选择
分别导入和同时导入两个重组质粒，并在强启动子
2013年第8期 165陈加利等 ：重组酿酒酵母合成谷胱甘肽的研究
ADH1 的启动下进行表达来考察 GSH1 和 GSH2 基因
对酿酒酵母合成 GSH 的影响。结果发现，单独转
入 GSH1 基因或 GSH2 基因的工程菌株比宿主菌株的
GSH 合成能力分别提高了 44.11% 和 29.79%，表明
GSH1 是合成 GSH 的关建酶 ；同时转入 GSH1 基因
和 GSH2 基因的工程菌株，其细胞内合成 GSH 的含
量比宿主菌株提高了 56.47%，增强效果明显 ；表明
基因重组技术有可能为谷胱甘肽生产选育出高产菌
株。相比 Fan 等［13］研究，本试验结果略低，可能
是菌种、发酵条件和培养基的组成造成的差异，下
一步工作计划是优化发酵体系以提高 GSH 含量。
4 结论
通过单独转入 GSH1 基因、GSH2 基因或同时
转入 GSH1 基因和 GSH2 基因来考察其在酿酒酵母
S.TS013 的表达。相较于宿主菌，转入质粒的 S.TS-
013/GSH1、S.TS013/GSH2 和 S.TS013/GSH1+GSH2
工程菌株的生物量没有明显差异，胞内 GSH 含量
分别达到 12.48、11.24 和 13.55 g/L，相比宿主菌分
别提高了 44.11%，29.79% 和 56.47%。GSH1、GSH2
基因的导入均可以极显著地提高胞内 GSH 的含量
（P<0.01）。
参 考 文 献
［1］ Meister A, Andersen ME. Glutathione［J］. Ann Rev Biochem,
1983, 52 ：711-760.
［2］ Li Y, Wei G, Chen J. Glutathione ：a review on biotechnological
production［J］. Appl Microbiol Biotechnol, 2004, 66（3）：233-
242.
［3］ Yoshida K, Hariki T, Inoue H, et al. External skin preparation for
whitening ：JP, 2002284664［P］. 2002.
［4］ Liang GB, Du GC, Chen J. A novel strategy of enhanced glutathione
production in high cell density cultivation of Candida utilis—
cysteine addition combined with dissolved oxygen controlling［J］.
Enzyme Microb Technol, 2008, 42（3）：284-289.
［5］ Tong QY, Wang GC, Du GC, et al. Effect of feeding method on
production of glutathione by Saccharomyces cerevisiae［J］. J Ind
Microbiol, 2003, 33（1）：19-22.
［6］ Alfafara CG, Miura K, Shimizu H, et al. Fuzzy control of ethanol
concentration and its application to maximum glutathione production
in yeast fedbatch culture［J］. Biotechnol Bioeng, 1993, 41（4）：
493-501.
［7］ Alfafara CG, Kanda A, Shioi T, et al. Effect of amino acids on
glutathione production by Saccharomyces cerevisiae［J］. Appl
Microbiol Biotechnol, 1992, 36（4）：538-540.
［8］ Alfafara CG, Miura K, Shimizu H, et al. Cysteine addition strategy
for maximum glutathione production in fed-batch culture of
Saccharomyces cerevisiae［J］. Appl Microbiol Biotechnol, 1992, 37
（2）：141-146.
［9］ Wen SH, Zhang T, Tan TW. Utilization of amino acids to enhance
glutathione production in Saccharomyces cerevisiae［J］. Enzyme
and Microbial Technology, 2004, 35（6-7）：501-507.
［10］ Wen SH, Zhang T, Tan TW. Optimization of the amino acid compo-
sition in glutathione fermentation［J］. Process Biochemistry,
2005, 40（11）：3474-3479.
［11］ Ohtake Y, Watanabe K, Tezuka H, et al. The expression of the
γ-glutamylcysteine synthetase gene of Escherichia coli B in
Saccharomyces cerevisiae［J］. Agric Biol Chem, 1988, 52（11）：
2753-2762.
［12］ Christine LH, Ulf S. Recombinant yeast for manufacture of
glutathione ：Euro, 300168［P］. 1989.
［13］ Fan XY, He XP, Guo XN, et al. Increasing glutathione formation by
functional expression of the γ-glutamylcysteine synthetase gene in
Saccharomyces cerevisiae［J］. Biotechnology Letters, 2004, 26（5）：
415-417.
［14］ 艾丽静 , 饶志明 , 诸葛健 , 等 . GSH1 基因的克隆及其在巴斯德
毕赤氏酵母中的表达［J］. 应用与环境生物学报 , 2007, 13（2）：
257-260.
［15］ Meister A. Glutathione metabolism and its selective modifica-
tion［J］. J Biol Chem, 1988, 263（33）：17205-17208.
［16］ 陈书霞 , 王晓武 , 房玉林 . 单菌落 PCR 法直接快速鉴定重组
克隆［J］. 微生物学通报 , 2006, 33（3）：52-56.
［17］ Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular Cloning ：A
Laboratory Manual［M］. 2nd ed. New York ：Cold Spring Harbor
Laboratory Press, 1989.
［18］ Li TK. The glutathione and thiol content of mammalian spermatozoa
and seminal plasma［J］. Biol Reprod, 1975, 12（5）：641-646.
（责任编辑 马鑫）