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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第2期
收稿日期 : 2011-07-21
作者简介 : 杨彬 , 博士 , 副研究员 , 研究方向 : 动物分子疫苗 ;E-mail:beibinyang@126.com
牛 α-IFN 及 FMDV P12A3C 双表达载体的构建及其
在 BHK-21 细胞中的表达
杨彬 兰喜 李宝玉 殷相平 李学瑞 柳纪省
（中国农业科学院兰州兽医研究所 家畜疫病病原生物学国家重点实验室 农业部畜禽病毒学重点开放实验室，兰州 730046）

摘 要 : 从口蹄疫病毒 Asia I/Jiangsu 毒株的细胞毒中提取总 RNA，通过 RT-PCR 方法分别获得 FMDV 的 P12A 及 3C 基因 ；
同时以 pMD18-T-α-IFN 质粒为模板，PCR 扩增得到 α-IFN 基因。将 α-IFN 基因及 FMDV P12A 及 3C 基因连接至双启动子表达载体
pBudCE4.1 上，构建成双效表达质粒 pBudCE4.1-α-IFN-P12A3C，经电泳、PCR、双酶切和 DNA 测序鉴定表明双效质粒载体构建成功。
用此重组质粒转染 BHK-21 细胞后并对其表达情况进行检测，表明该双表达质粒在 BHK-21 细胞中能够成功表达。以此重组质粒免
疫乳鼠后 12 h, 按 100 TCID50/0.1 mL 的量进行攻毒，结果发现该质粒能够抑制病毒的增殖，对乳鼠有一定的保护作用。结果表明成
功构建了牛 α-IFN 及 FMDV P12A3C 组合基因双表达载体，为进一步研究口蹄疫基因疫苗提供前期基础。
关键词 : 口蹄疫病毒 P12A 基因 3C 基因 α-干扰素 pBudCE4.1 载体
Construction of a Coexpression Vector Containing Genes of P12A3C of
FMDV and α-IFN and Its Expression in vitro
Yang Bin Lan Xi Li Baoyu Yin Xiangping Li Xuerui Liu Jixing
（Key Laboratory of Animal Virology of Ministry of Agriculture，State Key Laboratory of Veterinary Etiological Biology，
Lanzhou Veterinary Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Lanzhou 730046）
Abstract: The gene cassette-P1-2A, 3C of FMDV was acquired by RT-PCR, and the fragment of IFN-α was amplified by PCR. Genes
encoding the bovine α-IFN and the P12A-3C of FMDV Asia I/Jiangsu 2005 and were cloned into the MCS of pBudCE4.1 expression vector under
CMV promoter and EF1a promoter, respectively. The bi-functional recombinant plasmid was identified by restriction analysis and PCR. It was
proved by DNA sequencing that the acquired recombinant pBudCE4.1-α-IFN-P12A3C contains the bovine α-IFN and the P12A-3C of FMDV.
The recombinant plasmid was transfected into the BHK-21 cell using lipoid 2000, and the analysis revealed the recombinant plasmid could
expressed in BHK-21 cells. The recombinant plasmids were administered to mice intramuscular injection. All of mice were challenged with
100 TCID50/0.1 mL FMDV Asia I/Jiangsu 2005 after injection 12 h. Vaccination of mice with recombinated expression plasmids were protected
against the challenge of a virulent virus. This study demonstrates that the delivery of FMDV antigens via bicistronic vectors is feasible. Further
experimentation with bicistronic delivery systems is required for the optimization and refinement of DNA vaccines to effectively prime protective
immune responses against foot-and-mouth disease （FMD）.
Key words: FMDV P12A3C gene α-IFN pBudCE4.1 vector
口蹄疫（foot-and-mouth disease，FMD）是由口
蹄疫病毒（FMDV）引起的偶蹄动物的一种高度接
触性传染病，口蹄疫的爆发流行常常给该国的经济
造成巨大的损失，因此，世界各国都非常重视口蹄
疫的防制［1］。目前主要应用口蹄疫病毒灭活疫苗来
防制口蹄疫，但由于灭活苗存在许多不足之处，急
需研究出新型的基因工程疫苗来防制口蹄疫的流行。
其中，核酸疫苗由于便于制备、储存与运输，可诱
生细胞免疫和体液免疫且维持时间长而倍受关注，
但目前还未见广泛应用于生产实践的口蹄疫基因疫
苗，需进一步进行研究［2］。而基因工程干扰素可作
用于机体细胞内的干扰素受体 , 经信号传导等一系
2012年第2期 81杨彬等 ：牛 α-IFN 及 FMDV P12A3C 双表达载体的构建及其在 BHK-21 细胞中的表达
列的生物化学过程，启动基因合成抗病毒蛋白，抑
制病毒多肽链的合成 , 阻断了病毒的繁殖 , 使病毒不
能在机体内生长、繁殖 , 从而起到抗病毒的作用［3,4］。
因此，本试验旨在构建能够同时表达牛 α-IFN 基
因及口蹄疫病毒 P12A3C 基因的双表达载体，为进
一步提高 FMD 基因疫苗的免疫效力，研制新型的
FMD 基因疫苗奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
口蹄疫毒株为兰州兽医研究所传染病室保存的
FMDV Asia I/Jiangsu/2005 毒株、BHK-21 细胞及大肠
杆菌（E.coli）JM109 菌株为本室保存 ；RNA 提取试
剂盒为 QIAGEN 公司产品，反转录酶、Premix Taq
DNA 聚合酶、Xba Ⅰ、EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ、Not Ⅰ及
Bgl II 等限制性内切酶、DNA 回收试剂盒、克隆载
体 pMD18-T 及连接试剂盒等均购自宝生物工程（大
连）有限公司。转染试剂 LipofectamineTM 2000 购自
Invitrogen 公司 ；双顺反子表达载体 pBudCE4.1 购自
Biotech 公司。pMD18-T-α-IFN 质粒由本实验室保存。
1.2 方法
1.2.1 引 物 的 设 计 及 合 成 参 考 FMDV China99、
OM Ⅲ及 Asia I/Jiangsu 毒株等毒株的基因组序列，
用 DNAStar、Oligo 6.0 等 软 件， 针 对 FMDV 设 计
P12A 及 3C 片 段 引 物 ；根 据 GenBank 中 登 录 号 为
NM 001017411 的基因序列设计 α-IFN 基因的扩增引
物。引物由宝生物工程（大连）有限公司合成。引
物的序列如表 1 所示。
oligo d（T）反转录得到 cDNA，用上述引物对分别
扩增得到 P12A 及 3C 片段，扩增程序 ：94℃ 5 min ；
98℃ 10 s，68℃ 1-3 min，30 个循环 ；72℃延伸 8
min。同时以 pMD18-T-α-IFN 质粒为模板，以引物
对 IFN-a1 及 IFN-a2 进 行 PCR 扩 增 得 到 α-IFN 基
因。电泳检测后回收目的基因，用 T4 DNA 连接酶
与 pMD18-T 连接，连接产物按常规法转化大肠埃希
氏菌 JM109 细胞后，挑取单个菌落培养后提取质粒，
进行酶切及 PCR 鉴定，将初步鉴定为阳性的重组质
粒 pMD18-T-P12A、pMD18-T-3C 及 pMD18-T-α-IFN
送去测序，经 Blast 比较后验证序列正确，则可进行
下一步的双元表达载体的构建工作。
1.2.3 重组双表达载体的构建及鉴定［5］ 对重组
质 粒 pMD18-T-P12A、pMD18-T-3C 分 别 用 Not Ⅰ/
EcoR Ⅰ及 EcoR Ⅰ/Bgl Ⅱ双切后，将 FMDV 的 P12A
及 3C 分 步 串 连 到 pBudCE4.1 载 体 的 EF1a 启 动 子
下游，转化感受态细胞后挑斑，小量提取质粒后
经 PCR 及酶切鉴定正确后测序。随后分别从重组质
粒 pMD18-T-α-IFN 及 表 达 载 体 pBudCE4.1-P12A3C
上用 Xba Ⅰ及 BamH Ⅰ双酶切得到带粘性末端的
目的基因 α-IFN 及表达载体，用 T4 DNA 连接酶将
α-IFN 连接到 pBudCE4.1-P12A 载体的 CMV 启动子
下游，转化 JM109 感受态细胞，挑斑后提取重组质
粒 pBudCE4.1-α-IFN，经 PCR 及酶切鉴定正确后 , 送
构建成的双元表达载体 pBudCE4.1-α-IFN-P12A3C 进
行 DNA 测序，利用 Blast 软件进行序列同源性的比
较分析。
1.2.4 重组表达质粒在真核细胞中的表达［6, 7］
1.2.4.1 转染质粒的制备 按照超纯质粒 DNA 制
备试剂盒的操作步骤 , 提取质粒 pBudCE4.1-α-IFN-
P12A3C。经琼脂糖凝胶电泳检测后鉴定质粒正确，
分光光度计确定 DNA 的含量及纯度。
1.2.4.2 细胞转染 BHK-21 细胞 用含 6% 小牛血清
的 MEM 培养液在 37℃、5% CO2 的培养箱中培养，
待细胞长满时挑取生长状况良好的细胞经胰酶消化 ,
血细胞记数板记数后接种于 6 孔细胞培养板，用不
含抗生素的完全培养液 37℃培养过夜，待细胞融合
达 50%-80% 时，在 LipofectamineTM 2000 介导下进行
转染，转染 4 h 后补加含 5% 血清无抗生素的 MEM
以维持细胞的正常生长。细胞对照孔内加入含相同
引物 序列（5-3） 酶切位点
IFN-a1 GCTCTAGACCATGGCCCCAGCCTGGTCCTTACC Xba I
IFN-a2 GCGGATCCTCAGTCCTTTCTCCTGAAACTCTC BamHⅠ
P1 ATAGCGGCCGCACCATG GGAGCCGGGCAATCCAGTC Not I
P2 CGCGAATTCTGACATGTCCTCCTGCATCTGGTTG EcoR I
3C1 GCGGAATTCAAGAAGCCTGTCGCTTTGAAAGT EcoR I
3C2 ATAAGATCTCTACtcgtggtgtggttcggggTC Bgl II
表 1 引物序列
1.2.2 基因片段的获得 从本室保存的 Asia I/Jian-
gsu 毒株细胞毒中提取 RNA，方法参见 QIAGEN 的
RNeasy mini Spin-Columns Kit 操作步骤。以所提取
的总 RNA 为模板，利用 RT-PCR 法获取基因 ：用
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第2期82
浓度 LipofectamineTM 2000 的 MEM 培养液。
1.2.4.3 夹 心 ELISA 检 测 抗 原 用 重 组 质 粒 pBud
CE4.1-α-IFN-P12A3C 转染 BHK-21 细胞 24 h 及 48 h
时收取细胞，0.01 mol/L PBS 液（pH7.4）洗涤后胰
酶消化，离心弃上清，细胞沉淀裂解并离心，上清
用于 ELISA 检测。96 孔酶标板用 FMDV 兔阳性血
清（1 1 000）包埋，4℃过夜，马血清封闭后，将
FMDV 抗原、转染双表达质粒的细胞裂解液及未转
染的空白对照细胞裂解液以 2 倍梯度稀释，每个稀
释度设两复孔，37℃ 温育 1 h 后，洗涤后加入口蹄
疫豚鼠阳性抗血清（1 800），37℃ 作用 1 h，洗涤
后加入 HRP-兔抗豚鼠 IgG（1 2 000），37℃ 作用 1 h，
加入底物 OPD-H2O2 于 37℃ 作用 15 min，用终止液
结束反应，于 492 nm 处测定 OD 值。
1.2.5 乳鼠攻毒试验 按照 100 μg/ 只给 3-4 日龄的
乳鼠背部肌射该双表重组质粒 12 h 后，用 100 LD50
的量背部皮下接种口蹄疫病毒 Asia I/Jiangsu 毒株
0.1 mL , 观察 10 d，看该双表达质粒对乳鼠是否有保
护作用。设对照组，即未免疫攻毒组，每组 10 只乳鼠。
2　结果
2.1　PCR扩增产物电泳结果
扩增的 α-IFN 基因和 FMDV P12A 及 3C 基因电
泳结果表明，获得了与预期大小一致的约 570 bp（图
1），2 235 bp 和 690 bp 的特异性条带（图 2）。
图 3 重组子 pBudCE4.1-α-IFN-P12A3C 的 PCR 及
酶切鉴定结果
图 2　P12A 及 3C 基因的 PCR 扩增图 1　α-IFN 基因的 PCR 扩增
1.DL2000 DNA Marker ；2.α-IFN 基因 PCR 产物 1,2.3C 基因 ；3.DL2000 DNA Marker ；4,5.P12A 基因
2.2 双元表达载体pBudCE4.1-α-IFN-P12A3C的构
建及鉴定
对 得 到 的 FMDV 的 P12A 及 3C 双 酶 切 后 连
接 到 pBudCE4.1 载 体 的 EF1a 启 动 子 下 游 后， 提
取重组质粒，用 Not Ⅰ+EcoR Ⅰ切 P12A 基因，用
EcoR Ⅰ+Bgl II 切 3C 基因，同时进行 PCR 鉴定，均
得到了大小为 2 235 bp 和 690 bp 的特异性条带（图
3），并经 DNA 测序分析，表明 FMDV 的 P12A 及 3C
已正确连接到 pBudCE4.1 载体的 EF1a 启动子下游。
随后将 α-IFN 从 T 载体上切下后连接到 pBudCE4.1
载 体 的 CMV 启 动 子 下 游， 提 取 质 粒 经 Xba Ⅰ 及
BamH Ⅰ双酶切，切出了约 570 bp 的特异性条带，
PCR 也扩增出了相同的目的带（图 3），经 DNA 测
序分析，表明牛 α-IFN 已正确连接到 pBudCE4.1 载
体的 CMV 启动子下游。
2.3　FMDV P12A，3C及α-IFN基因的序列分析
2.3.1 FMDV P12A，3C 基 因 的 序 列 及 同 源 性 分
析 DNA 测序结果经 Blast 分析表明，所测的 FMDV
JS 毒株的 P12A 基因全长 2 325 bp，编码 775 个氨
基 酸， 与 GenBank 中 的 JS 株 P12A 基 因 同 源 性 达
99.5%，氨基酸序列同源性为 100%。所测基因仅在
1.DL2000 DNA Marker ；2.8.pBudCE4.1-α-IFN-P12A3C ；3. pBudCE4.1-α-IFN-
P12A3C 经 Xba I +BamH I 双酶切；4. 扩增的 P12A；5.pBudCE4.1-α-IFN-P12A3C
经 Not I+EcoR I 双 酶 切 ；6.3C 基 因 ；7.pBudCE4.1-α-IFN-P12A3C 经 EcoR
I+Bgl II 双酶切 ；9. 空质粒对照 ；10.λ -EcoT14 Marker
2012年第2期 83杨彬等 ：牛 α-IFN 及 FMDV P12A3C 双表达载体的构建及其在 BHK-21 细胞中的表达
第 18 位及 138 位碱基发生了变异，但关键抗原位
点及关键的毒力位点未发生变异。而所测的 3C 基
因 长 690 bp， 编 码 230 个 氨 基 酸， 与 登 录 的 Asia
I/Jiangsu/CHA/2005 毒株 3C 基因的序列及氨基酸同
源性均达 100%。说明目的基因 P12A 及 3C 已正确
插入双表达载体中。
2.3.2　α-IFN 基因序列　α-IFN 基因测序结果表明，
α-IFN 基 因 长 为 570 bp， 编 码 190 个 氨 基 酸， 将
所测序列与 GenBank 中的登录号为 NM001017411
的 α-IFN 基 因 序 列 进 行 比 较， 核 苷 酸 同 源 性 为
98.9%， 氨 基 酸 同 源 性 为 99.6%。 说 明 目 的 基 因
α-IFN 已正确插入双表达载体中，表明已成功构建
了双表达质粒。
2.4 重组质粒在BHK-21细胞中的表达
重 组 质 粒 pBudCE4.1P-α-IFN-P 12A3C 转 染 细
胞 48 h 后经双抗体夹心 ELISA 检测抗原表明，经
转染的 BHK-21 细胞裂解液 OD 值随倍比稀释度的
增加而逐渐降低，这一变化特点与 FMDV 抗原 OD
值变化相似，说明经转染的 BHK-21 细胞中有目的
蛋白产生，而未转染的细胞其 OD 值随倍比稀释度
的增加无规律变化，说明细胞中无特异蛋白产生，
如图 4 所示。
3　讨论
安全有效的疫苗是成功防制乃至最终消灭口蹄
疫的有效途径。口蹄疫弱毒疫苗和灭活疫苗等传统
疫苗都具有良好的免疫原性，在口蹄疫的防制中发
挥了重要的作用，但由于其具有热不稳定性、仅诱
导血清型特异性免疫反应、保护期短以及由于疫苗
中可能存在未完全灭活病毒或病毒逃逸而引起的安
全性问题等缺点，急需开发出一种更安全、有效的
新型口蹄疫疫苗［8］。随着生物工程技术及免疫学的
迅速发展，口蹄疫基因工程疫苗包括亚单位疫苗、
合成肽疫苗、基因缺失疫苗、活载体疫苗、抗独特
型疫苗、基因疫苗等研究均已取得了很大进展。其中，
核酸疫苗由于疫苗抗原可能在靶细胞内以天然的方
式合成、加工并呈递给免疫系统，克服了减毒活疫
苗可能返祖或变异的缺点 ；可同时引起体液免疫和
细胞免疫，保护力强 ；对不同亚型的病原体有交叉
抵抗作用 ；基因疫苗操作简单，生产迅速、质量易
于控制和评价，可避免生产过程中病原的污染，且
成本较低、稳定、便于保存和运输等诸多优点，而
成为新型基因工程疫苗研究的热点［9］。
α-IFN 素是一种具有广谱抗病毒、抗肿瘤、调
节免疫和促进细胞凋亡等多种生物学活性的细胞因
子，它并不直接杀伤或抑制病毒，而主要是通过细
胞表面受体作用使细胞产生抗病毒蛋白，从而抑制
病毒的复制；同时还可增强自然杀伤细胞（NK 细胞）、
巨噬细胞和 T 淋巴细胞的活力，从而起到免疫调节
作用，并增强抗病毒能力［10,11］。α-IFN 由于可同时
攻毒后时间
（h）
组别
质粒免疫 +V 组 PBS+V 对照组 常规灭活疫苗 +V 组
48 10 2 6
59 8 1 3
72 7 0 2
84 7 0 2
96 7 0 0
108 6 0 0
120 6 0 0
144 6 0 0
168 5 0 0
192 5 0 0
图 4 夹心 ELISA 检测 BHK-21 细胞中 P12A 蛋白的
表达情况
2.5 乳鼠攻毒试验结果
按照 100 μg/只给 3-4 日龄的乳鼠背部肌注射该
双表表达重组质粒 12 h 后，用 20-100 LD50 的量背
部皮下接种口蹄疫病毒 Asia I/Jiangsu 毒株 0.1 mL，
观察 10 d，结果（表 2）显示，该双表达质粒对乳
鼠的保护率达到了 50% 以上。
表 2 乳鼠攻毒辣试验结果（攻毒后时间及存活数）
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第2期84
起到免疫增强和抗病毒效应，故在病毒病的治疗和
预防中具有重要的作用［12］。近年来，美国梅岛动物
病研究所（Plum Island Animal Disease Center）研究
人员将猪或牛的干扰素 IFN-α 及 IFN-β 基因重组进
病毒载体中 , 使动物抗 FMDV 抗体水平及相应的攻
毒保护率得到大大的提高［13］。同时，由于 FMDV 结
构蛋白 P1 基因由 VP4、VP2、VP3、VP1 组成，含
有 FMDV 主要抗原位点，并在 3C 等蛋白酶的裂解
下组装成成熟的病毒粒子。同时研究表明，在两个
融合蛋白之间引入 FMDV 中的 18 个氨基酸的短肽
2A 作为两个蛋白之间的 linker，能使 2A 起到多聚
蛋白内部核糖体自身裂解的作用，成功地避免了多
聚蛋白的分裂对蛋白酶的依赖［14］，同时确保不同免
疫原能保持各自独立的生物学特性。因此，本试验
将牛的 α-IFN 基因和 FMDV 的 P12A3C 基因表达盒
分别克隆入核酸表达载体 pBudCE4.1 的 CMV 启动
子及人的 EF-1α 的下游，成功构建了共表达 FMDV
P12A3C 基因和 α-IFN 基因的真核表达载体，并将其
转染 BHK-21 细胞，在真核细胞中的表达情况，进
一步的大动物免疫试验正在进行中。
4 结论
本 研 究 成 功 构 建 了 双 表 达 质 粒 pBudCE4.1-α-
IFN-P12A3C，用此重组质粒转染 BHK-21 细胞后对其
表达情况进行检测，间接 ELISA 结果表明该双表达
质粒在 BHK-21 细胞中能够成功表达。以此重组质
粒免疫乳鼠后12 h,按100 TCID50 /0.1 mL量进行攻毒，
结果发现该双效质粒能够抑制病毒的增殖，对乳鼠
有一定的保护作用。
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（责任编辑 李楠）