全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第1期
收稿日期 : 2011-05-31
基金项目 : 云南省农业科技创新工程项目（2008LA019）, 云南省自然科学基金项目（2008ZC070M）, 国家自然科学基金项目（31060343）
作者简介 : 王继华 , 男 , 硕士 , 研究方向 : 口蹄疫疫苗的研发和生产管理 ;E-mail: bsymcwjh@sina.com
通讯作者 : 信爱国 , E-mail: mvir@yahoo.com.cn; 李华春 , E-mail: li_huanchun@hotmail.com
链特异性 RT-PCR 方法检测口蹄疫病毒负链 RNA
王继华1 信爱国2 朱明旺1 苗海生2 胡骑2 廖德芳2 李乐2 李华春2
（1云南省保山疫苗厂，保山 678000 ；2云南省畜牧兽医科学院 农业部热带亚热带动物病毒学重点开放实验室
云南省热带亚热带动物病毒重点实验室，昆明 650224）
摘 要： 旨在建立一种快速、灵敏、特异的检测口蹄疫病毒在复制过程中产生的负链 RNA 的方法。根据口蹄疫病毒（foot-
and-mouth disease virus, FMDV）病毒 5- 非编码区（5-UTR）基因序列，设计了 5 条引物链特异性 RT-PCR 引物，建立检测口蹄疫
病毒负链 RNA 的链特异性 RT-PCR 方法。提取 FMD 病毒 RNA，应用设计的正向引物 T1-H1 做反转录引物，经反转录和 RNA 酶
A 消化后，再经两轮链特异性 PCR 扩增，可特异性地检测 FMDV 在复制过程中产生的负链 RNA。所建立的检测口蹄疫病毒负链
RNA 的链特异性 RT-PCR 方法是一种可靠的方法，在确定细胞培养物和动物感染 FMDV 的病毒复制和了解病毒的致病性研究中具
有应用前景。
关键词： 口蹄疫病毒 链特异性 RT-PCR 复制中间体 负链 RNA 感染
Detection of Negative-strand Foot-and-mouth Disease Virus RNA
Using a Strand-specific RT-PCR
Wang Jihua1 Xin Aiguo2 Zhu Mingwang1 Miao Haisheng2 Hu Qi2 Liao Defang2 Li Le2 Li Huachun2
（1Baoshan Vaccine Plant of Yunnan Province, Baoshan 678000; 2Ministry of Agriculture Key Laboratory for Tropical and Subtropical Animal
Virus Disease, Yunnan Tropical and Subtropical Animal Virus Disease Laboratory,
Yunnan Animal Science and Veterinary Institute, Kunming 650224）
Abstract: Rapid and sensitive detection of foot-and-mouth disease virus（FMDV）negative-strand RNA was to develop utilizing a
strand-specific reverse transcriptase PCR approach. 5 strands-specific primes were designed according to the FMDV 5-UTR gene region
sequences to develop a strand-specific RT-PCR assay for detection of FMDV negative-strand RNA. FMD virus RNA was extracted，then RNA
were reverse transcribed with forward T1-H1 primer and products were digested with RNA enzyme A. The products were amplified by two cycle
chain-specific PCR amplification. The results showed that it can be to specifically detect FMDV in the replication process negative strand RNA.
The strand-specific RT-PCR assay is a reliable method for effective detection FMDV negative-strand RNA.
Key words: Food-and-mouth disease virus Stand-specific RT-PCR Replicationn intermediate Negative-strand RNA Infectious
口蹄疫病毒（foot-and-mouth disease viurs, FMDV）
基 因 组 为 单 股 正 链 RNA， 既 是 mRNA, 又 是 负 链
RNA 合成的模板。FMDV 基因组复制时，首先由正
链 RNA 转录出一条负链 RNA，再以负链为模板合
成下一代正链 RNA。复制过程中，在 3Dpro 的催化下，
负链 RNA 可与多个新生正链 RNA 形成一个双链分
子——复制中间体（Replicative intermediate）［1］，形
成 RI 后， 开 始 新 的 正 链 RNA 的 合 成， 一 条 负 链
RNA 上可同时启动多条正链 RNA 的合成。FMDV
一个完整的病毒复制周期是从病毒感染细胞开始到
成熟子代病毒释放为止，一般需要 3-12 h［2］。复制
周期的长短因病毒株不同而异，同时受 pH、温度、
细胞类型、营养等因素的影响。负链 RNA 的出现是
FMDV 进行复制的标志，也是感染 FMDV 病毒存在
的直接证据。
链特异性逆转录聚合酶链式反应（Strand-specific
2012年第1期 131王继华等 ：链特异性 RT-PCR 方法检测口蹄疫病毒负链 RNA
reverse transcriptase polymerase chain reaction ；strand-
specific，RT-PCR）可特异性地检测病毒的正链或负
链 RNA［3-5］，可为检测 FMDV 复制的方法提供新思
路。在此理论基础上，本研究根据 FMDV 的复制过程，
在其基因组 5- 非编码区（5-UTR）保守基因序列内，
设计 5 条引物链特异性 RT-PCR 引物，建立用于检
测口蹄疫病毒负链 RNA 的链特异性 RT-PCR 方法。
并与细胞培养病毒毒价测定相比较，探索其作为确
定 FMDV 病毒复制检验方法，旨在为研究 FMD 病
毒感染性克隆转染细胞后病毒感性鉴定等提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 病 毒 株 试 验 用 口 蹄 疫 病 毒 株 Asia 1/ZB/
CHA/58（att）是 1958 年在云南保山地区分离获得
的亚洲 1 型 FMDV，后在乳兔体内传代致弱，作为
弱毒疫苗种毒株。这株弱毒株适应于 BHK-21 细胞，
由云南省热带亚热带动物病毒实验室保存。
1.1.2 主要试剂 病毒总 RNA 提取试剂、Primer-
Script 1st stand cDNA 合成试剂盒、RNA 酶 A 和 Premix
Taq PCR 预混液均购自 TaKaRa （大连）生物工程
工司。引物由上海生工生物工程技术服务有限公
司合成。
1.2 方法
1.2.1 引物设计 对 GenBank 中收录的 21 株 7 种不
同血清型的 FMDV 的 5- 非编码区（5-UTR）基因
进行同源性比对分析，并利用 Primer 5.0 软件设计引
物。引物序列位置参考 ZB/CHA/58（att）株基因组
序列（GenBank 序列号 DQ533483）。
正 向 引 物 T1-H1: 5-TTCCGATTAGAGGCGATA
GCCTGGTCTTTCCAGGTCT-3 , 其中非划线部分为
ZB/CHA/58（att）株基因组序列 676-694 nt，斜体
划线部分为标签结构，与口蹄疫病毒基因组序列既
不互补也不相同。反向引物 T2-H2:5-GACCTGGAT
AGGCTGTGTGATACCTATTCAGGCGTAGAAGCTT-3，
其中非划线部分与 ZB/CHA/58（att）株基因组序列
1 031-1 051 nt 互补，斜体划线部分为另一个标签
结构。
正 向 引 物 T1: 5-TTCCGATTAGAGGCGATA-3
（与引物 T1-H1 中的标签结构序列一致）；反向引物
T2 ：5-GACCTGGATAGGCTGTGTGATA-3 （ 与 引 物
T2-H2 中 的 标 签 结 构 序 列 一 致 ）。 正 向 引 物 T3:
5-CCTCCTTGGTAACAAGGACCC-3 （ZB/CHA/58
（att）株基因组序列 800-820 nt）。
1.2.2 链特异性 RT-PCR 检测 FMDV 负链 RNA 将
Asia 1/ZB/CHA/58（att）株病毒悬液接种于长成致
密单层的 BHK-21 细胞上，在病毒复制高峰期收毒，
提取 RNA，进行逆转录反应，逆转录结果进行两轮
PCR 扩增。
1.2.2.1 逆转录反应 使用PrimerScript 1st stand cDNA
合成试剂盒进行逆转录反应。操作步骤严格按照说
明书进行。0.2 mL 离心管中加入口蹄疫病毒 RNA
样品 10.0 μL，使用引物 T1-H1 进行逆转录。程序
为 50℃逆转录 30 min ；95℃灭活逆转录酶 15 min ；
在各反应管中加入 RNA 酶 A（10 U/μL）37℃反应
60 min ；-20℃保存备用。
1.2.2.2 第一轮 PCR 采用 Premix Taq 反应液进行
PCR 扩增。在第一轮 PCR 中，使用引物 T2-H2 与
T1，预期 PCR 产物长度为 415 bp ；在 0.2 mL PCR
反应管中加入 Premix Taq 12.5 μL，dH2O 10.5 μL 逆
转录产物 1.0 μL，引物 T2-H2 和 T1 各 0.5 μL 进行第
一轮 PCR。程序为 95℃预热 2 min，94℃变性 30 s，
55℃退火 30 s，72℃延伸 1 min，共 40 次循环 ；最
后 72℃延伸 5 min 后 4℃保存。经含染料的 1.5％的
琼脂糖电泳分离，紫外灯下观察扩增结果并拍照。
1.2.2.3 第 二 轮 PCR 在 第 二 轮 PCR 中， 使 用 引
物 H3 与 T3，预期 PCR 产物长度为 272 bp。0.2 mL
PCR 反 应 管 中 加 入 10 倍 稀 释 的 第 一 轮 PCR 产 物
1.0 μL 作为扩增模板，条件同第一轮 PCR 反应，反
应 30 次循环。
1.2.3 RT-PCR 检 测 FMDV 正 链 RNA 提 取 RNA，
采用引物 T2-H2 进行逆转录反应，用引物 H3 和 T2
进行 PCR 扩增，条件同检测负链 RNA 的链特异性
RT-PCR 的第一轮 PCR 反应。预计扩增大小 272 bp。
1.2.4 链特异性 RT-PCR 方法检测样品 应用所建
立的方法对云南省保山疫苗厂疫苗生产过程中不同
时间段取样的病毒生长液进行检测，分别观察细胞
病变效应（CPE）、测定其半数感染量（TCID50）并
与链特异性 RT-PCR 法的结果进行比较。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第1期132
2 结果
2.1 链特异性RT-PCR方法检测病毒负链RNA结果
FMDV Asia 1/ZB/CHA/58（att）接种 BHK-21 细
胞后，产生 CPE 后收获病毒，提取 RNA，RNA 提
取物经 T1-H1 反转录后，进行 PCR 扩增，得到阳性
扩增条带，第一轮 PCR 条带大小在 415 bp 左右，第
二轮 PCR 后条带大小在 272 bp 左右（图 1），与设
计的片段大小一致 ；以正常的 BHK-21 细胞培养物
提取 RNA 为阴性对照，无扩增条带。
M.100 bp DNA Marker ；1. 第一轮 PCR 扩增产物 ；
2. 第二轮 PCR 扩增产物
图 1 FMD 病毒负链 RNA 检测结果
M.DL2000 DNA Marker ；1-4.PCR 扩增产物
图 2 FMD 病毒正链 RNA 检测结果
2.3 链特异性RT-PCR方法的敏感性
FMDV Asia 1/ZB/CHA/58（att） 接 种 BHK-21
细 胞 后， 产 生 CPE 后 收 获 病 毒（TCID50 为
10-4.5/50 μL），按 10-1 倍比稀释，提取 RNA，采用链
特异性 RT-PCR 方法对病毒原液、10-1、10-2、10-3 进
行检测，第一轮 PCR 可检测到 10-1，第二轮 PCR 可
检测到 10-3，见图 3。
M. DL2000 bp DNA Marker；1. 病毒原液；2.
10-1 稀释 ；3. 10-2 稀释 ；4. 10-3 稀释
图 3 FMD 病毒负链 RNA 敏感性检测结果
2.4 链特异性RT-PCR方法检测样品结果
采用所建立的链特异性 RT-PCR 方法对保山疫
苗厂生产的 FMDV 疫苗样品进行检测。以灭菌 PBS
为阴性对照，结果见图 4，链特异性 RT-PCR 方法
可以检测出病毒负链 RNA 的复制。
进一步，对口蹄疫病毒 Asia-1 型疫苗生产毒
株（Asia 1/JS）接毒后不同时间段观察细胞病变效
应（CPE），测定培养液中病毒毒价（TCID50）和
用链特异性 RT-PCR 检测病毒负链 RNA 的复制情
况，以灭菌 PBS 为阴性对照，结果见表 1。链特异
性 RT-PCR 方法可以检测在 5 h 即可检测出病毒负
链 RNA 的复制。
3 讨论
口蹄疫病毒属于小 RNA 病毒科成员，小 RNA
病毒 RNA 复制的第一步是终止正链 RNA 的翻译，
合成负链 RNA 分子，所合成的负链 RNA 作为模板
合成正链 RNA 基因组，包装在病毒粒子中，或者作
为病毒蛋白的合成模板，以非依赖帽子结构翻译机
制指导病毒蛋白的合成，负链 RNA 的合成会产生双
链 RNA 分子（即复制型 RNA，RF）［6］。脊髓灰质
炎病毒感染的细胞内，单个的负链 RNA 可作为模板
2.2 RT-PCR检测正链RNA结果
提取 RNA，采用引物 T2-H2 进行逆转录反应，
用引物 H3 和 T2 进行 PCR 扩增，条件同检测负链
RNA 的链特异性 RT-PCR 的第一轮 PCR 反应，结果
扩增大小 272 bp（图 2）。与设计的片段大小一致 ；
以正常的 BHK-21 细胞培养物提取 RNA 为阴性对照，
无扩增条带。
2012年第1期 133王继华等 ：链特异性 RT-PCR 方法检测口蹄疫病毒负链 RNA
细胞产生 90% 的 CPE 时收毒止，负链 RNA 检测结
果与 CPE 的观察和 TCID50 的测定结果一致，但该方
法仅能从检测负链 RNA 的角度，初步说明 FMD 病
毒的复制情况，在研究病毒是否存在和持续感染定
性研究具有应用前景，若能定量研究病毒负链 RNA
与正链 RNA，则能清楚地说明病毒复制效率，在研
究病毒的复制及生产实践应该将具有更大应用价值。
Horsington ［8］和 Huang 等 ［9］将链特异性 RT-PCR 与
实时荧光定量技术相结合进行 FMDV 复制的定量研
究，也为本方法的进一步改进提供了科学线索。
4 结论
本研究建立了一种快速、灵敏、特异的检测口
蹄疫病毒在复制过程中产生的负链 RNA 的方法。该
方法可特异性地检测 FMDV 在复制过程中产生的
负链 RNA，在确定 FMDV 的复制检测，例如确定
FMDV 全长 cDNA 克隆分子转染宿主细胞进行病毒
拯救试验中具有应用价值。
参 考 文 献
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时间 （h） TCID50（50 μL /well） CPE 特异性 RT-PCR1 2 3
5 3.25 3 3.25 - +
7 3.75 3.25 3.00 +/- +
9 3.75 3.75 3.25 + +
11 3.75 4.00 3.75 + +
13 4.00 4.25 4.00 + +
16 4.25 4.50 4.25 + +
表 1 FMD 疫苗株 Asia 1/JS 株不同时间培养液中病毒含
量 TCID50、CPE 及链特异性 RT-PCR 检测结果
合成多个的正链 RNA，形成部分 RF，正链与负链
RNA 的比例大概为 50 1［7］，负链与正链的比率是
评价病毒复制效率的有效方法。FMDV 负链 RNA 的
出现时病毒复制的标志，负链 RNA 可作为复制中间
体直接反映正链 RNA 病毒复制水平。检测 FMDV 负
链 RNA，对探索 FMDV 的致病机理，解释病毒对组
织细胞的亲嗜性、疾病表型起因和持续感染机制等
科学问题和指导疫苗生产实践具有实际意义。
本 研 究 建 立 链 特 异 性 RT-PCR 方 法， 经 两 轮
PCR 扩增，可以初步检测 FMDV 在接种后的复制情
况。例如，第二轮 PCR 结果与直接检测正链 RNA
的结果一致，说明该方法可特异性地检测出病毒的
负链 RNA。特别地，链特异性 RT-PCR 时，RT 反
应后必须采用 RNA 酶 A 消化总 RNA，以消除后续
PCR 反应的非特异性扩增。该方法可从 10-3 稀释
的病毒原液（TCID50 为 10-4.5/50 μL）中检测出负链
RNA，其中第一轮 PCR 的扩增效率较差，第二轮后
扩增呈阳性结果，与直接检测正链 RNA 的敏感性一
致（结果未显示）。应用该方法对 Asia-1 型疫苗制备
过程中不同时间点采用结果进行检测，与接种后观
察 CPE 和测定毒价对比，在接种 5 h 即可检测出病
毒负链，病毒复制高峰期大概维持 3 － 4 h，致 16 h
A. 第一轮 PCR 结果 ; B. 第二轮 PCR 结果 ; M. DL2000 bp DNA Marker ；1-10. 疫苗样品
图 4 FMD 疫苗样品负链 RNA 检测结果
（下转第 144 页）
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第1期144
出现的区域，在 OmpH 蛋白第 26-30 区段（QDGTK）、
44-49 区段（ EKNERG ）、87-94 区段（TVKEGPSQ）、
179-185 区段（QAPRDGR）、282-288 区段（ATTRDRS）
和 310-315 区段。
参 考 文 献
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（上接第 133 页）