全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·研究报告· 2008年第 6期
收稿日期：2008-07-28
基金项目：国家支撑计划项目（2006BAD06A06）
作者简介：张昱（1983-），男，甘肃省静宁县人，在读硕士研究生，从事动物病毒免疫学与分子生物学研究
通讯作者：王永录，Tel：0931-8343796，E-mail：wyonglu@yahoo.com.cn
口蹄疫是由口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus，FMDV）引起的一种急性、烈性、高度传染性、可快
速远距离传播的动物疾病。口蹄疫的暴发会带来严重的经济损失，疫区乃至整个国家的畜产品出口都会受
到限制甚至封锁，这使得口蹄疫成为家畜疾病中的头号“经济病” [1]。 FMDV 属于微 RNA 病毒科，口疮病毒
属。其基因组为单股正链 RNA，它既是转录中的 mRNA，又是负链合成的模板，长度约为 8 500 个核苷酸 [2]。
FMDV 蛋白衣壳由 60 个亚单位构成，每个亚单位由 4 个结构蛋白组成，蛋白衣壳表面由 VP1，VP2 和 VP3
构成，而 VP4 是隐藏在衣壳内部。 与大多数病毒一样，FMDV 的吸附和侵入依赖于敏感细胞膜上的病毒特
口蹄疫病毒株 AF72 VP1的结构构建与 B细胞表位预测
张昱 王永录 张永光 潘丽 方玉珍 刘力宽 蒋守田
吕建亮 张中旺 张淑刚 李正丰 杜进鑫
（中国农业科学院兰州兽医研究所 家畜疫病病原生物学国家重点实验室 农业部畜禽病毒学重点开放实验室，兰州 730046）
摘 要： 以口蹄疫病毒株AF72 RNA为模板，反转录并扩增目的基因，PCR纯化产物与pGEM-T easy载体连接
并转化JM109菌株，用凝胶电泳、PCR和EcoRⅠ酶切法鉴定为阳性的重组质粒进行测序。比对测序结果确定AF72 VP1
的核苷酸序列，利用同源建模的方法建立AF72 VP1结构蛋白的3D结构，在此基础上，综合亲水性、可塑 、抗原指数以
及表面可能性等参数预测AF72 VP1结构蛋白的B细胞抗原表位。结果显示，VP1结构蛋白呈现较规则的空间构象，其中
5~11、24~30、43~47、82~87、132~147和196~203氨基酸区段是AF72 VP1结构蛋白可能的B细胞抗原表位区域，该结果将
为进一步的FMDV多表位疫苗研究提供很有价值的参考信息。
关键词： 口蹄疫病毒 VP1结构蛋白 3D结构 B细胞表位
Construction of VP1 and Prediction of B Cell Epitopes
from FMDV AF72
Zhang Yu Wang Yonglu Zhang Yongguang Pan Li Fang Yuzhen Liu Likuan Jiang Shoutian
Lv Jianliang Zhang Zhongwang Zhang Shugang Li Zhengfeng Du Jinxin
（Key Laboratory of Animal Virology of Agriculture，State Key Laboratory of Veterinary Etiological Biology，Lanzhou
Veterinary Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Lanzhou 730046）
Abstract： Foot-and-mouth disease virus strain AF72 RNAs were used as templates for RT-PCR to amplify th
target gene. The purified PCR products were cloned into pGEM-T easy Vectors a d transformed intoE.col JM109.
The positive recombinant plasmids which have been identified by electrophoresis，PCR andEcoRⅠcleavage respectively，
were sequenced. The nucleotide sequence were confirmed by comparing with the full-length sequence of the other
reference strains. By homology modeling，the 3D model of AF72 VP1 structure protein was obtained. Then several
parameters，including hydrophilicity，flexibility，antigenic index and surface probability were integrated，and B-cell epitopes in
VP1 were predicted. The result showed the conformation of AF72 VP1 was regular，and B-cell epi opes in VP1 prob bly
existed in the following regions，including 5aa~11aa，24aa~30aa，43aa~47aa，82aa~87aa，132aa~147aa and 196aa~203aa. This
result offers valuable information for further research of FMDV multi-epit pe vaccine.
Key words： FMDV VP1 structure protein 3D model B-cell epitope
2008年第 6期
异性受体，而且这些特异性受体决定了 FMDV 的细胞嗜性。 VP1 暴露于病毒粒子的表面，是诱导产生中和
抗体的主要成分，在免疫应答中发挥重要作用。 突出于 FMDV 粒子表面，有一柔性 loop 结构，被称为“G-H
环”，是与特定细胞受体结合的主要配体，并且是机体抗击 FMDV 侵染的中和抗体作用位点 [3]。
B 细胞表位位于抗原分子表面，能诱导 B 细胞产生特异性抗体，从而激发机体的体液免疫效应。 目前
已经有多种预测 B 细胞表位的方案，这些预测方案与蛋白质高级结构的预测相结合将有助于提高 B 细胞
表位预测的准确性 [4]。 为了了解 VP1 3D 结构和表面特性，分析预测 FMDV AF72 VP1 结构蛋白上的 B 细胞
表位，此项研究在同源模建的基础上，联合运用多种预测蛋白抗原表位的算法，对 FMDV AF72 VP1 蛋白的
B 细胞抗原表位进行预测分析，为进一步研究多表位疫苗提供参考依据。
1 材料和方法
1.1 病毒、载体、转化菌和试剂
FMDV AF72 株由国家口蹄疫参考实验室毒种保藏中心提供，RNeasy Mini Kit 购自 Qiagen 公司，pGEM-
T easy 载体和 T4 连接酶购自 Promega 公司，E.coli JM109 转化菌、RNA PCR Kit （AMV）Ver.3.0、EcoRⅠ酶 、
LA Taq、DNA 纯化试剂盒和小型质粒提取试剂盒购自大连宝生物公司，其他试剂均为进口和国产分析纯。
1.2 引物设计
根据 GenBank 中其他的 FMDV A 型病毒株 VP1 基因序列设计一对引物，用于 FMDV AF72 VP1 基因扩
增，引物由大连宝生物公司合成。
上游引物：5′-CACAAATGTACAGGGATGGGT-3′
下游引物：5′-GACATGTCCTCCTGCATCT-3′
1.3 RNA 的提取
所有试剂和器皿均经 0.1%的 DEPC（焦碳酸二乙酯）水溶液去 RNase 处理，含有 FMDV AF72 病毒株的
BHK21 细胞毒经反复冻融后，参考 RNeasy Mini Kit 操作说明提取病毒总 RNA。
1.4 RT-PCR
参考大连宝生物公司 RNA PCR Kit（AMV）Ver.3.0 说明书操作。
1.5 基因的克隆与鉴定
将上述 PCR 产物按照 DNA 纯化试剂盒说明书进行纯化， 按照 pGEM-T easy 载体试剂盒说明书进行
PCR 纯化产物与载体的连接，转化感受态细胞 E.coli JM109，均匀涂布于含有 Amp、X-gal 和 IPTG 的 LB 琼
脂平板上，挑取白色单菌落。 按照小型质粒提取试剂盒说明书提取质粒，进行 1%琼脂糖凝胶电泳、PCR 和
EcoRⅠ酶切鉴定，并将初步鉴定为阳性的重组质粒样品送大连宝生物公司测序。
1.6 序列分析
重组质粒序列测定后 ， 用 DNAstar 软件将 AF72 的 VP1 测序结果和 AJ131666、AY593763、AY593764、
AY593772（GenBank 均已公布全基因组）的 VP1 基因序列进行比对，从而确定 AF72 VP1 结构蛋白的核苷酸
和氨基酸推导序列。
1.7 AF72 VP1 结构蛋白的 3D 结构模拟
在蛋白质数据库（PDB）中搜索 AF72 VP1 的同源蛋白序列，选择同源性较高的蛋白序列作为同源建模
的模板序列。 根据同源建模的思路 [4]，运用 Swiss-pdb Viewer 蛋白质分析软件模拟 FMDV AF72 VP1 结构蛋
白的 3D 结构。
1.8 AF72 VP1 结构蛋白 B 细胞抗原表位的参数分析
应用 DNAstar 软件的 protean 模块， 分别按照 Kyte-Doolittle 方案、Karplus-Schulz 方案、Jameson-Wolf 方
案和 Emini 方案，分析 AF72 VP1 结构蛋白的亲水性、可塑性、抗原指数和表面可能性。
1.9 AF72 VP1 结构蛋白 B 细胞抗原表位的综合分析
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在 3D 结构的基础之上，综合亲水性、可塑性、抗原指数和表面可能性分析的结果，最终预测 AF72 VP1
结构蛋白上的 B 细胞抗原表位。
2 结果
2.1 VP1 基因 RT-PCR 和克隆结果
1%琼脂糖凝胶电泳显示 PCR 扩增产物约 750bp，与目的片段长度一致（图 1）。从培养 JM109 转化菌的
培养基中挑取单克隆，扩增培养后提取质粒，经 1%琼脂糖凝胶电泳、PCR 和 EcoRⅠ酶切鉴定，目的片段长
约 750bp，证明所克隆的为预期的 VP1 基因（图 2）。
图 2 阴性质粒和重组质粒 EcoRⅠ酶切电泳图
图 1 VP1 基因 PCR 扩增电泳图 1：DL12000 Marker；2：Negative control；3：Digested products by
EcoRⅠof positive recombinant plasmids；4：DL2000 Marker1：DL2000 Marker;2,3：PCR product of VP1
2.2 VP1 蛋白酶核苷酸序列和氨基酸推导序列
VP1 基因序列全长 639 个核苷酸，编码 213 个氨基酸组成的多肽链（图 3）。
核苷酸序列
ACCACCACGACCGGGGAGTCCGCAGACCCTGTCACCACCACTGTTGAGAACTACGGTGGTGAGACACAAGTCCAA
AGACGCCAGCACACCAATGTCGGCTTCATAATGGACAGATTTGTGAAAATACCCAGTCAGAGTCCTACACATGTC
ATTGACCTCATGCAAACTCACCAACACGGGTTGGTGGGTGCCCTGCTGCGTGCAGCCACGTACTACTTCTCCGACT
TGGAGATTGTGGTGCGTCACGATGACAACTTGACCTGGGTACCCAATGGAGCACCTGAGACAGCCCTTCACAACA
CGAGCAACCCCACTGCATACCACAAGGGGCCTTTCACGAGGCTCGCACTCCCCTACACCGCGCCACACCGCGTGC
TGGCGACAGTGTACAACGGGACAACCAAGTACTCCACAGGTAATGCAGGCAGACGGGGTGATCTAGGGTCTCTTG
CGGCGAGGGTCGCCGCACAGCTTCCCGCTTCTTTCAACTTCGGTGCGATTCGAGCCACTGTCATCCACGAGCTCCT
CGTGCGCGTGAAGCGCGCCGAACTCTACTGCCCCAGGCCACTGCTGGCGGTGAAGGTGACGTCGCAAGACAGAC
ACAAACAGAGGATCATTGCACCTGCAAAGCAACTCCTG
氨基酸序列
TTTTGESADPVTTTVENYGGETQVQRRQHTNVGFIMDRFVKIPSQSPTHVIDLMQTHQHGLVGALLRAATYYFSDLE
IVVRHDDNLTWVPNGAPETALHNTSNPTAYHKGPFTRLALPYTAPHRVLATVYNGTTKYSTGNAGRRGDLGSLAAR
VAAQLPASFNFGAIRATVIHELLVRVKRAELYCPRPLLAVKVTSQDRHKQRIIAPAKQLL
2.3 VP1 结构蛋白 3D 结构的建立
在蛋白质数据库中搜索 AF72 VP1 结构蛋白的同源序列，查询结果显示 PDB 代号为 1ZBA 的 FMDV 的
VP1 氨基酸序列与 AF72 蛋白的 VP1 氨基酸推导序列同源性高达 86%，故以 1ZBA 作为同源建模的模板序
列。 根据同源建模的方法，运用 Swiss-pdb Viewer 蛋白质分析软件模拟得到 AF72 VP1 结构蛋白的 3D 模型
和表面模型（图 4 和图 5）。由图 4 可知，在 VP1 结构蛋白的空间结构中，存在 3 个典型的 β 折叠桶结构（图
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4 中“2”所示），这也是 β-折叠在 VP1 结构蛋白的 3D 结构中主要的存在方式，埋藏在蛋白结构内侧的 β-折
叠由连续的疏水残基组成，而一侧暴露的 β-折叠则以亲水-疏水的两残基重复模式出现，结合图 5 可知，以
β 折叠桶为主体的空间结构呈现较规则的几何构象，这也利于 VP1 在构成病毒粒子基本单元（原粒）的过
程中更好地发挥作用。 在空间结构中，还存在较少量的 α-螺旋（图 4 中“1”所示），且都处于 3 个 β 折叠桶
之间，在处于蛋白外侧的 α-螺旋中存在大量的亲水性氨基酸（比如谷氨酸），和一侧暴露的 β-折叠中亲水
性残基共同构成整个蛋白的亲水性表面。 除此之外，大量的无规则卷曲的存在，增加了蛋白的表面柔性，
VP1 位于病毒粒子表面，这些具有柔性的无规则卷曲在蛋白的其他结构没有明显改变时，会采取不同的构
象，表现为物理上的可动性和生化上的多功能性，这在很大程度上增加了病毒的抗原性。
图 5 AF72 VP1 结构蛋白表面图 4 AF72 VP1 结构蛋白的 3D 模型
2.4 AF72 VP1 结构蛋白的亲水性
Kyte-Doolittle 法预测结果见图 6， 由图可知，AF72 VP1 结构蛋白的亲水性区域呈分散分布， 亲水性较
高的集中区域主要有 1~32，80~113，130~147，180~186，195~207，这些区域都基本位于蛋白表面，主要由亲
水性氨基酸构成。
图 7 AF72 VP1 结构蛋白可塑性分析
2.5 AF72 VP1 结构蛋白的可塑性
Karplus-Schulz 预测结果见图 7， 可塑性较高的集中区域主要有 5~30，41~48，90~96，100~105，109~
113，131~148，195~204，这些区域具有一定的柔性。 尤其是一些区域，包括 5~30，131~148，195~204 含有较
多甘氨酸、丝氨酸等柔性氨基酸而具有极高的柔韧性，在空间结构中表现为物理上的灵活性，形成 B 细胞
抗原表位的可能性较大，易于与抗体进行嵌合。
图 6 AF72 VP1 结构蛋白亲水性分析
2.6 AF72 VP1 结构蛋白的抗原指数
Jameson-Wolf 法预测结果如图 8，结果显示 2~11，15~32，38~48，80~87，90~98，137~149，178~187，196~
206 等氨基酸区段的抗原指数较高（≥0），形成抗原表位的可能性大。
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2.7 AF72 VP1 结构蛋白的表面可能性
Emini 方法预测结果如图 9， 在 VP1 结构蛋白中，23~30，43~46，82~85，100~112，132~138，196~203 等
氨基酸区段的表面可能性较大（≥1），即这些区段极有可能位于蛋白表面，且易被溶剂分子接触。
图 8 AF72 VP1 结构蛋白抗原指数分析
图 9 AF72 VP1 结构蛋白表面可能性分析
2.8 AF72 VP1 结构蛋白的 B 细胞抗原表位
在分析 AF72 VP1 结构蛋白 3D 结构的基础之上 ， 综合以上 Hydrophilicity、Flexibility、Antigenic Index、
Surface Probability 等参数，最终预测 5~11、24~30、43~47、82~87、132~147、196~203 氨基酸区段是 AF72 VP1
结构蛋白可能的 B 细胞抗原表位区域。
3 讨论
尽管 X 射线晶体学方法是研究蛋白质结构最准确而有效的方法， 由于对样品的需要量大、 纯度要求
高、被测定的蛋白质的分子量一般不超过 20kD 等原因，其使用也受到一定程度的限制 [5]。 同源建模法是现
如今蛋白质三维结构预测的主要方法。 对蛋白质数据库（PDB）分析可以得到这样的结论：任何一对蛋白
质，如果两者的序列同源性超过 30%（序列比对长度大于 80 个氨基酸），则它们具有相似的三维结构，即 2
个蛋白质的基本折叠相同，只是在非螺旋和非折叠区域的一些细节部分有所不同；蛋白质结构比蛋白质的
序列更保守， 如果 2 个蛋白质的氨基酸残基序列同源性达到 50%， 那么约有 90%的 α 碳原子的位置偏差
不超过 3A，这是同源建模方法在结果预测方面成功的保证 [6]。 本试验运用该方法对 VP1 结构蛋白的空间
结构进行预测分析，得知 VP1 的空间结构呈现较规则的几何构象，这也是结构蛋白基本构象的共性之一。
所谓表位（epitope），又称为抗原决定簇，是指免疫细胞能识别的抗原分子上的一个特定部位 ，代表抗
原分子上的一个免疫活性区，可以同相应的受体结合。 在免疫应答中，B 细胞识别蛋白抗原时，是以其表面
的 B 细胞受体（BCR）与蛋白抗原表位结合，从而诱导高度特异性的体液免疫，产生免疫应答。 因此要设计
理想的表位疫苗，应尽量减少与免疫反应无关的成分，以减少疫苗的不良反应，利用生物信息学的技术方
法可以对目的蛋白质上的 B 细胞表位进行预测分析。目前，已被认可的并具有较好预测效果的方法主要有
亲水性方案，可塑性方案，抗原性方案，表面可能性方案，二级结构预测以及电荷分布方案 [7]。 一般认为，作
为 B 细胞蛋白抗原的表位应位于或移动于蛋白表面，有利于与 B 细胞受体或抗体结合。 另外，表位要有一
定的柔韧性，因为抗原与抗体的结合是一个嵌合过程，在 AF72 VP1 蛋白中大量的柔性区域的存在，利于形
成 B 细胞抗原表位，与其受体或抗体结合。 试验前，综合运用生物信息软件和互联网服务器对有关蛋白的
优势抗原表位进行分析、处理和预测，可以增强试验的目的性，提高试验的成功率，运用多参数分析与综合
表位分析较之单参数预测，成功率更高 [8]。
作为 B 细胞蛋白表位首先应位于蛋白表面或容易移动于蛋白表面，有利于与 B 细胞受体或抗体结合，
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此外，柔性区域在 B 细胞表位与其受体或抗体的识别结合过程中发挥着重要作用。 VP1 抗原能引起免疫应
答的抗原表位主要位于结构松散区，疏水核心区域由于空间位阻，成为其抗原表位的几率较小。 本研究突
破只根据核苷酸和氨基酸序列进行 B 细胞抗原表位预测的局限，采用同源模建的方法来分析 AF72 VP1 的
3D 结构，为 AF72 VP1 抗原表位的分析提供了更为直观的分子模型，增加 B 细胞抗原表位预测的可靠性，
为口蹄疫多表位疫苗的研究提供参考依据。
参考文献
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