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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2016, 32(1):124-130
赤霉素（Gibberellin，简称 GA）是一个较大的
萜类化合物家族，在植物的整个生长发育周期中起
调节作用。作为一种重要的植物激素，赤霉素参与
控制多种多样的植物发育过程，包括种子萌发、茎
的伸长、根的生长、叶片伸展、表皮毛发育、花
粉管生长、花和果实的发育等［1，2］。赤霉素生物
收稿日期 ：2015-04-16
基金项目 ：青海省科技厅专项资金资助项目（2013-Z-720），现代农业产业技术体系专项资金资助项目（CARS-10）
作者简介 ：石建斌，男，博士研究生，研究方向 ：马铃薯遗传育种 ；E-mail ：shijanbin@163.com
通讯作者 ：王舰，男，研究员，博士生导师，研究方向 ：马铃薯种质资源创新与利用改良研究 ；E-mail ：wangjian2197@sohu.com
马铃薯突变体赤霉素代谢关键酶基因差异表达分析
石建斌1  杨永智1，2  王舰1，2
（1. 青海大学，西宁 810016 ；2. 青海省农林科学院 教育部青藏高原生物技术重点实验室 青海省高原作物种质资源与利用重点实验室，
西宁 810016）
摘 要 ： 为揭示马铃薯株高突变与赤霉素代谢途径关键酶基因的关系，以马铃薯株高突变株系 4P2-9 为材料，利用实时荧
光定量 PCR 方法中的相对定量 RT-PCR 建立双标准曲线，以 Actin 基因为内参基因，对高原 4 号及其株高突变材料 4P2-9 中的赤
霉素代谢相关基因的表达情况进行了检测。结果显示，4P2-9 的株高及节间数显著低于对照材料（P<0.05），节间长度显著高于
对照（P<0.05），赤霉素代谢的关键酶基因 KS、KO 和 GID1 表达量显著下调，分别为对照材料的 0.725 倍、0.657 倍和 0.890 倍 ；
GA20ox1 和 GA2ox1 基因的表达量表现为上调，分别为对照材料的 1.557 倍和 1.425 倍。结果表明，赤霉素代谢过程中关键酶基因
表达量的改变是造成 4P2-9 材料株高变化的原因之一，而 GA20ox1 和 GA2ox1 基因的表达量的上调是促使株高降低的主要因素。
关键词 ： 马铃薯 ；株高突变 ；赤霉素 ；基因表达量
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.01.021
The Differential Expression of Genes for Key Enzymes in Gibberellin
Metabolism in Potato Mutant
SHI Jian-bin1 YANG Yong-zhi1，2 WANG Jian1，2
（1. Qinghai University，Xining 810016 ；2. Qinghai Academy of Agricultural and Forestry Sciences，The Key Lab of Qinghai-Tibetan Plateau
Biotechnology of Ministry of Education，Key Laboratory of Germplasm Innovation and Utilization of Plateau Crop in Qinghai Province，
Xining 810016）
Abstract: In order to reveal the correlation between the mutation of plant height and genes of key enzymes in gibberellin（GA）
metabolic pathway, using the mutant strain 4P2-9 of potato as materials, we established double standard curve by relative quantitative RT-PCR,
and tested the expression of GA metabolism-related genes in the “Plateau 4” and its mutant “4P2-9” using Actin gene as reference gene. The
results showed that the plant height and the internode number of 4P2-9 significantly were lower than the control material（P<0.05）；however,
the internode length was significantly higher than the control（P<0.05）, moreover the expressions of gene KS, KO and GID1 for key enzymes in
GA metabolism were significantly down-regulated, and were 0.725, 0.657 and 0.890 times the control, respectively. The expressions of GA20ox1
and GA2ox1 genes were increased, and were 1.425 and 1.557 times the control, respectively. The results revealed that the expression changes of
genes for key enzymes in the GA metabolism was one reason of the variation of 4P2-9 plant height, and the up-regulation of gene GA20ox1 and
GA2ox1 expression was the main factor for the decrease of plant height.
Key words: potato ；mutation of plant-height ；GA ；gene expression
2016,32(1) 125石建斌等：马铃薯突变体赤霉素代谢关键酶基因差异表达分析
合成途径可分为 3 个阶段，参与其合成的关键酶
主要包括古巴焦磷酸合成酶（Copalyl pyrophosphate
synthase，CPS）、内 - 贝壳杉烯合成酶（Ent-kaurene
synthase，KS）、内 - 贝壳杉烯氧化酶（Ent-kaurene
oxidase，KO）、GA-20 氧化酶（GA-20 oxidase）、GA-
3 氧化酶（GA-3 oxidase）以及 GA-2 氧化酶（GA-2
oxidase）等［3］。
CPS 是调节 GA 生物合成途径一个重要的酶，
决定了 GGPP 向 GA 方向合成，同 KS 一样位于前质
体，且具有引导序列。CPS 能够催化生物合成途径
中 从牻牛 儿 焦 磷 酸（Geranylpyrophosphate，GGPP）
形成古巴焦磷酸（Copalyl pyrophosphate，CPP），为
催化环化双萜形成的第一步。KS 则催化 CPP 形成
内 - 贝壳杉烯，即为赤霉素的前身。KO 是一种位于
内质网，与膜结合的依赖细胞色素 P450 和 NADPH
的单加氧化酶，经三步反应将内 - 贝壳杉烯氧化为
内 - 贝壳杉烯酸。GA-20 氧化酶和 GA-2 氧化酶是
重要的 GA 生物合成和调控酶，为可溶性的双加氧
酶，由小的多基因家族编码，目前大约有 20-30 种
的 GA-20 氧 化 酶 基 因 被 克 隆［4］。GA-20 氧 化 酶 是
严格调控的酶，既受反馈调节，又受光周期调控。
GA-20 氧化酶底物专一性不强，其对底物的亲和力
与 C-13 位的羟基化有关，形成 GA 代谢的 2 个或多
个平行形成途径，这与植物中具有生物活性的 GAs
类型相一致［5］。GA-2 氧化酶主要作用于有生物活性
的 GA1 和 GA4，使两者在 C-2 位羟基化转变成无活
性的 GA8 和 GA34，并且维持着植物体内具有生物活
性的 GAs 和 C19-GAs 中间体之间的平衡。赤霉素受
体 GID1（Gibberellin insensitive dwarf1）是一种可溶
性蛋白，与赤霉素结合形成二聚体，将赤霉素的信
号传递给下游元件，在植物体上产生赤霉素效应［6］。
自 20 世 纪 60 年 代 起， 由 于 水 稻 sd1 基 因 和 小 麦
Rht1 基因在育种中的应用，极大地提高了世界主要
粮食作物的产量，即“绿色革命”［7，8］。最近的研
究表明主要农作物的“绿色革命”都与赤霉素密切
相关［9，10］。目前，在分子水平上研究赤霉素的表达
调控已成为植物激素研究领域中的前沿和热点［11-13］。
实时荧光定量 PCR 为目前常用检测基因表达
量的方法，具有比 Northern blot 成本低，操作简便，
省时省力，高精确度和高灵敏度等特点，能够检测
表达丰度较低的 mRNA，已经成为基因表达分析的
首选方法［14，15］。
本研究以马铃薯株高突变株系为材料，通过细
胞学观察及实时荧光定量 PCR 方法，分析突变系体
细胞特征并检测赤霉素代谢途径中关键酶基因的表
达情况，旨在为进一步了解马铃薯中赤霉素作用的
分子机理提供参考资料。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 马铃薯材料 高原 4 号来源于青海省农林科
学院生物技术中心，4P2-9 为本实验室利用 RNA 干
涉沉默马铃薯卷叶病毒筛选出的株高变异突变系。
1.1.2 仪器和试剂 iQ5 实时荧光 PCR 仪（Bio-Ra-
d），高速冷冻离心机，PCR 仪，水平凝胶电泳仪，凝
胶成像系统，电子显微镜，微量移液枪（Eppendorf）。
2×SYBR Green I Mix 购自上海生物工程公司，
0.2 mL 平盖八联管购自 Bio-Rad 公司，RNAprep Pure
植物总 RNA 提取试剂盒、Fast Quant cDNA 第一链合
成试剂盒、RNase-Free DNase I、10×buffer、dNTP、
Taq 聚合酶均购自天根生物公司。
1.2 方法
1.2.1 材料的准备 从基因库中分别取高原 4 号和
突变株系 4P2-9 的组培苗，切取带芽茎段于基本培
养基 MS 中，在本实验室的培养间培养 30 d（培养
温度为白天 25℃、夜间 21℃，光照为 14 h/d，采用
日光灯补光）。
1.2.2 马铃薯形态指标测量与细胞学观察 分别挑
取高原 4 号和 4P2-9 组培苗各 10 株测量每株组培苗
植株高度，并统计节间数。用镊子小心撕取组培苗
中部茎段表皮，用稀碘染色后制作细胞观察玻片，
并用电子显微镜观察细胞结构。
1.2.3 马铃薯总 RNA 提取与质量检测 称取马铃薯
材料叶片 0.1 g 在液氮中迅速研磨成粉末，用植物总
RNA 提取试剂盒提取马铃薯材料的总 RNA，具体步
骤按试剂盒说明书操作进行。提取的 RNA 用核酸测
定仪测定浓度和纯度，并用 1.2% 的琼脂糖凝胶电泳
检测 RNA 的完整性，-80℃保存备用。
1.2.4 RT-PCR 合成 cDNA 链 逆转录反应体系为
20 μL，在 0.2 mL RNase free 的离心管中加入 5×gDNA
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.1126
Buffer 2 μL、Total RNA 5 μL、RNase-Free ddH2O 3
μL，混匀并简短离心，置于 42℃孵育 3 min，然后
置于冰上放置 2 min。在上述体系中加入 10×Fast
RT Buffer 2 μL、RT Enzyme Mix 1 μL、FQ-RT Primer
Mix 2 μL、RNase-Free ddH2O 5 μL，充分混匀，42℃
孵育 15 min，95℃孵育 3 min，-20℃保存备用。
1.2.5 引物的设计 赤霉素代谢途径中的关键酶主
要 有 CPS1、KS、KO、GA2ox1、GA20ox1 及 赤 霉 素
受体基因 GID1，参考水稻、葡萄、番茄等植物赤霉
素代谢关键酶基因序列［16-18］，用 DNA STAR 软件分
析其同源性，在保守序列内用 Primer Premier 5 设计
特异性引物，以马铃薯内源持家基因 Actin 作为内
参基因［19］，所有引物（表 1）由上海生物工程公司
合成。
表 1 引物序列表
基因
名称
用途 引物序列（5-3） 大小 /bp
CPS qRT-PCR
F ：TGAGAATGGCCTGGAAGCTT
100
R ：CTCAGAGGCACGGTTTGGTT
KS qRT-PCR
F ：AAGCTCGATCAGCTGCCATTT
100
R ：CAATGCGGGCTTCAGACAAT
KO qRT-PCR
F ：TGGAGGAGGAAAGAGGGTGT
159
R ：ATGGGATGGAGTTTCTGACTGGTG
GA2ox1 qRT-PCR
F ：ATCACAACAAATCCATCA
100
R ：AGCACCATACATCCCATA
GA20ox1 qRT-PCR
F ：TTTTGTGGACGATGAATGGC
135
R ：GTCTTGTTGTTTACTACTGCTCTGT
GID1 qRT-PCR
F ：TCAGTGAGTCCAAGAGGGTG
110
R ：CAAGTGGCGATTGAAGGTG
Actin qRT-PCR
F ：GGTATTGTGCTGGATTCTGG
97
R ：CAGCTAGGTCCAATCGAAGA
1.2.6 相对定量 RT-PCR 分析 以高原 4 号和 4P2-9
材料的 cDNA 为模板，用各基因的特异性引物进行
PCR 扩增，并以 PCR 产物为模板进行 10 倍（100、
10-1、10-2、10-3 和 10-4）梯度稀释，用于建立各目
的基因和内参基因的标准曲线。反应中，各目的基
因分别与内参 Actin 基因两两一组，构建标准曲线
的同时扩增高原 4 号和 4P2-9 材料中相应目的基因
和内参 Actin 基因。反应体系为 20 μL，包含 10 μL
2×SYBR Green I，引物各 1 μL，cDNA 1 μL，ddH2O
7 μL。PCR 反应程序为 ：95℃ 3 min ；95℃ 10 s，退
火 20 s，72℃ 30 s，40 个循环，内参基因、外源基
因的熔解曲线的测定均是从 65℃到 95℃，每 0.2℃/5
s 测定吸光值 1 次。每个样品设 3 个重复，结果取
平均值，参照 Pfaffl 法［20］，通过目的基因与内参基
因的扩增效率（E）和 CT 值来计算目的基因的相对
表 达 量（C），C=EΔCT（ 目 的 基 因 ）/E
ΔCT
（ 内 参 基 因 ），ΔCT=
CT 目的基因 -CT 内参基因，E 扩增效率 =10
-1/r，r 为标准曲线斜
率。以此计算目的基因的相对表达量，并与株高性
状进行相关性分析。
2 结果
2.1 马铃薯株高统计及细胞学观察
分别统计马铃薯材料 4P2-9 及对照材料高原 4
号的株高和节间数，随机挑选 10 株测量，做 3 次重
复，所得数据经 DPS 统计软件统计分析，结果（表 2）
显示，对照组高原 4 号材料的平均株高为 16.00 cm，
4P2-9 材料的平均株高为 12.45 cm，较对照偏低，且
两者之间的差异达到了显著水平（P<0.05）。4P2-9
材料的平均节间数为 7.9，较对照组的 13.00 显著偏
小，且该差异也达到了显著水平（P<0.05）。4P2-9
材料的平均节长与对照组相比，达到显著差异水平
（P<0.05）。
通过对 4P2-9 材料和高原 4 号材料的细胞学观
察（图 1）发现，两者茎段细胞狭长，均呈不规则状，
细胞排列紧密且大小不一，两者在细胞排列及个体
伸长方面均无明显差别。说明 4P2-9 材料的株高突
变性状主要表现为茎段节间数的减少，其次为节间
的增长，但这种增长并非是由节间细胞拉伸造成的。
2.2 标准曲线的建立
检测提取的 RNA 经电泳完整性（图 2），并进
行反转录合成第一链，分别以合成的 cDNA 为模
板，以特异性引物进行 PCR 扩增，产物经琼脂糖凝
胶电泳检测后分别进行 10 倍梯度稀释（100、10-1、
10-2、10-3 和 10-4），以梯度稀释的 Actin 基因 PCR 产
物作为内参基因标准品，以梯度稀释的各目的基因
的 PCR 产物为外源基因标准品，以 CT 值为 Y 轴，
以模板起始浓度的对数为 X 轴，建立各目的基因及
内参基因的标准曲线，由图 3 可知，模板起始浓度
与 CT 值存在线性关系，内参基因 Actin 的扩增效率
为 110.90%，R2=0.995，各目的基因的扩增效率为
2016,32(1) 127石建斌等：马铃薯突变体赤霉素代谢关键酶基因差异表达分析
82.2%-125.6%，R2 为 0.995-0.999，所有标准曲线的
相关系数接近于 1，熔解曲线为单峰，扩增产物特
异性好，扩增曲线中的荧光值能够准确反应目的产
物的扩增。
2.3 马铃薯赤霉素代谢途径相关酶基因的表达分析
根据 Pfaffl 法分别计算了荧光定量 PCR 中马
铃 薯 材 料 高 原 4 号 和 4P2-9 的 CPS1、KS、KO、
GA2ox1、GA20ox1 和 GID1 基因的扩增效率（E）和
表达量，结果（表 3）显示，以内参基因 Actin 为标
准，CPS1、KS、KO、GA2ox1、GA20ox1 和 GID1 基
因在 4P2-9 中的相对表达量分别为 1.00、0.76、0.53、
1.02、0.87 和 0.61 ；在高原 4 号中的相对表达量分
别为 0.99、1.05、0.81、0.66、0.61 和 0.69。在材料
4P2-9 中，CPS1 和 GA20ox1 基因的表达量与内参基
因基本一致，KS、KO、GA2ox1 和 GID1 基因的表达
量较内参偏低 ；在材料高原 4 号中，除 KS 外，其它
基因的表达量较内参基因均偏低。
马 铃 薯 CPS1、KS、KO、GA2ox1、GA20ox1 和
GID1 基因在材料 4P2-9 和高原 4 号中的差异表达结
果（图 4）显示，与对照相比，各关键酶基因的相
对表达量均有不同程度的变化，其中，4P2-9 材料中
的 CPS1 基因表达量变化不大，为正常水平的 1.012
倍左右，KS、KO 和 GID1 基因表达量有不同程度的
下调，下调幅度为对照材料的 0.725 倍、0.657 倍和
0.890 倍左右 ；GA20ox1 和 GA2ox1 基因的表达量表
现为上调，上调幅度为对照材料的 1.557 倍和 1.425
图 2 RNA 检测电泳图
表 2 马铃薯材料株高性状统计
材料 株高 /cm± 标准差 节间数 / 个 ± 标准差 平均节长 /cm± 标准差
高原 4 号 16.00±2.10 13.00±2.50 1.20±0.22
4P2-9 12.45*±2.55 7.90*±1.86 1.70±0.37
注 ：* 表示差异达显著水平（P<0.05））
A B
C D
A ：4 号材料株高 ；B ：4P2-9 材料株高 ；C ：4 号材料茎段细胞排列 ；D ：4P2-9 材料茎段细胞排列
图 1 马铃薯材料组培苗株高及节间细胞观察
4ਧ 4P2-9 M
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.1128
倍左右。
3 讨论
赤霉素涉及植物生长发育的诸多方面，这必然
要求植物对体内的赤霉素水平进行精确的调控。这
种调控主要通过控制 GA 合成和代谢相关的酶基因
的表达来实现。研究表明，赤霉素在株高生长发育
过程中起着重要的调控作用［9］。Curtis 等［21，22］的
研究表明，当过量表达西葫芦 GA20- 氧化酶会产生
GA 缺失突变体表型，如植株矮化、叶色加深等，转
基因植株内源 GA 含量降低。Lee 等［23］克隆了菠菜
的 GA2- 氧化酶基因，编码含 337 个氨基酸残基组
40.00
35.00
30.00
25.00
20.00
15.00
10.00
5.00
0.00
Th
re
sh
ol
d
C
yc
le
-1 0 1 2
Log Starting Quantity
3 4 5
Actin: y=-3.085x+28.709RSq=0.995
CPS1: y=-3.097x+22.681RSq=0.995
KS: y=-3.267x+21.169RSq=0.998
KO: y=-3.525x+22.255RSq=0.998
GA20ox1: y=-2.830x+24.230RSq=0.995
GA2ox1: y=-3.838x+34.811RSq=0.999
GID1: y=-3.379x+25.422RSq=0.999
图 3 目的基因与内参基因双标准曲线的建立
表 3 马铃薯材料赤霉素代谢关键酶基因表达情况
基因
4P2-9 高原 4 号
R
E ΔCT EΔCTS EΔCTA C E ΔCT EΔCTS EΔCTA C
Actin 2.11 0.00 1.00 1.00 1.00 2.11 0.00 1.00 1.00 1.00 1.000
CPS1 2.10 0.76 1.76 1.76 1.00 2.10 4.73 33.67 34.14 0.99 1.012
KS 2.02 6.66 109.29 144.16 0.76 2.02 -1.08 0.47 0.45 1.05 0.725
KO 1.92 6.73 81.14 151.89 0.53 1.92 2.22 4.26 5.24 0.81 0.657
GA20ox1 2.26 0.35 1.33 1.30 1.02 2.26 -6.23 0.01 0.01 0.66 1.557
GA2ox1 1.82 0.99 1.81 2.09 0.87 1.82 3.41 7.74 12.75 0.61 1.425
GID1 1.98 7.57 173.90 284.32 0.61 1.98 5.77 51.00 74.19 0.69 0.890
注 ：E 扩增效率 =10
-1/r，r 为标准曲线斜率 ；ΔCT ＝ CT 目的 -CT 内参 ；C 为目的基因在材料中的相对表达量 ；R 为目的基因相对表达量的比值
1.8
1.6
1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
สഐ⴨ሩ㺘䗮䟿
Actin CPS1 KS KO GA20ox1 GA2ox1 GID1
儈৏4ਧ 4P2-9
图 4 赤霉素代谢关键酶基因在 4P2-9 和高原 4 号中的相对
表达结果
成的蛋白，能够在大肠杆菌异源表达，催化 GA9 和
GA20 转变为 GA51 和 GA29 的反应，GA2- 氧化酶维持
着植物体内具有生物活性的 GAs 和 C19-GAs 中间体
之间的平衡，过量表达 GA2- 氧化酶常会导致植株
矮化，GA 含量降低。
通过田间及组培苗株高统计发现，株高突变系
4P2-9 材料的株高显著低于对照材料，主要表现为节
间数的减少，但节间长度却有所增长。经细胞学观
察，并未发现节间细胞的拉伸，说明造成 4P2-9 材
料节间生长的原因并非为节间细胞的简单拉伸。相
对定量检测结果表明，马铃薯赤霉素代谢的关键酶
基 因 CPS1、KS、KO、GA2ox1、GA20ox1 和 GID1 在
4P2-9 材料和高原 4 号中发生变化，其中 KS 基因和
KO 基因的表达量显著下调，导致了在赤霉素代谢
后期代谢阶段 GA20ox1 基因和 GA2ox1 基因表达量
的显著上调，GA20ox1 基因和 GA2ox1 基因的过量表
达最终导致 GA 含量的降低，表现为赤霉素受体基
因 GID1 的下降［24］，最终促使 4P2-9 材料的株高变
化，GA20- 氧化酶是严格调控的酶，既受活性 GA
反馈调节，又受光周期调控，过量表达 GA20- 氧
化酶，植物通常会表现为节间伸长，叶色变淡等特
征［25，26］，表明赤霉素代谢过程中关键酶基因表达量
2016,32(1) 129石建斌等：马铃薯突变体赤霉素代谢关键酶基因差异表达分析
的改变是造成马铃薯材料株高突变的原因之一，其
中 GA20ox1 和 GA2ox1 基因的表达量的上调是促使
4P2-9 材料株高降低的主要因素。另外，GA20ox1 的
过量表达还导致了突变材料节间长度的增长，而非
简单的细胞拉伸。
当外源 T-DNA 整合进入植物基因组，会对宿
主细胞的基因组造成改变，这种变化无论是对外源
的 T-DNA 的表达还是植物基因的表达都会产生影
响［27］。RNA 干涉载体在马铃薯基因组中的随机整
合致使基因组发生了重排，这种重排包括植物基因
组整合位点的删除和重复，T-DNA 序列的删除和重
复，以及染色体上的易位和倒位［28］。特定位点基因
序列的改变导致了基因表达量的变化，包括赤霉素
代谢途径中的关键酶基因，表现为本研究材料的株
高突变。
4 结论
通过细胞学方法观察马铃薯材料 4P2-9 的株高
突变性状主要表现为茎段节间数的减少，其次为节
间的增长，且这种增长并非是由节间细胞拉伸造成
的。利用 Real-time PCR 方法对赤霉素代谢途径中
关键酶基因的相对表达量分析表明，马铃薯材料
4P2-9 的 KS 和 KO 基因表达量显著降低，GA20ox1
和 GA2ox1 基因表达量显著升高，为促使 4P2-9 材料
株高降低的主要因素。
参 考 文 献
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（责任编辑 马鑫）