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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第4期
α-淀粉酶可从淀粉分子内部切开 α-1，4 糖苷键，
生成糊精、低聚糖和单糖，广泛用于粮食加工、酿
造、纺织品工业、制药、纺织及石油开采等行业［1］，
在工业生产中占有极其重要的地位，是目前用途较
广泛的一种酶制剂［2-4］。目前，国内市场中常用的
中温和高温 α-淀粉酶的适用 pH 范围一般为 6.0-8.0，
在酸性条件下其酶活性明显降低，已不能满足一些
酸性条件下淀粉原料的深加工工艺的要求，因此，
酸性 α-淀粉酶的开发与生产势在必行。
耐酸性 α-淀粉酶是一类可以在较低 pH 值条件
收稿日期 ：2013-10-23
基金项目 ： 天津科技大学实验室开放基金项目（1204A211），国家自然科学基金资助项目（31101219），国家高技术研究发展计划（“863”
计划）项目（2013AA102106-07）
作者简介 ：王建玲，女，研究员，研究方向 ：酶与应用微生物 ；E-mail ：wjl01@tust.edu.cn
通讯作者 ：路福平，男，教授，研究方向 ：酶与应用微生物 ；E-mail ：lfp@tust.edu.cn
产耐酸性 α-淀粉酶菌株的分离、鉴定、酶学特性
研究及发酵培养基的优化
王建玲  陈志鑫  刘逸寒  路福平
（天津科技大学生物工程学院 工业发酵微生物教育部重点实验室，天津 300457）
摘 要 ： 从富含淀粉的土壤中筛选获得多株产耐酸性 α-淀粉酶的菌株，将酶活最高的一株经 16S rDNA 鉴定为枯草芽孢杆菌
（Bacillus subtilis），命名为 Bacillus subtilis A-7，其所产的耐酸性 α-淀粉酶最适温度和 pH 分别为 60℃和 4.5。通过单因素筛选及正
交试验优化发酵培养基，得到最佳配方为可溶性淀粉 2%，蛋白胨 2%，CaCl2 0.07%，Na2HPO4 0.8%，在此条件下耐酸性 α-淀粉酶
活力达到 221 U/mL，是未优化条件下的 2.3 倍。
关键词 ： 耐酸性 α-淀粉酶 16S rDNA 鉴定 枯草芽孢杆菌 最适温度 最适 pH 正交试验
Screening，Identification and Characterization of an Acid α-amylase
Producing Strain and Optimization of Its Fermentable Condition
Wang Jianling Chen Zhixin Liu Yihan Lu Fuping
（Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology，Ministry of Education，College of Biotechnology，
Tianjin University of Science& Technology，Tianjin 300457）
Abstract:  Multiple new acid α-amylase producing strains were isolated from soil which is rich in starch. A strain which has the highest
enzyme activity was identified as Bacillus subtilis A-7 through analysis of 16S rDNA gene. The optimum temperature and pH was 60℃ and 4.5.
The single factor experiments and orthogonal experiments were adopted to optimize the liquid fermentation medium. The composition of the best
medium was 2% soluble starch, 2% peptone, 0.07% CaCl2, 0.8% Na2HPO4. Under this optimal condition, the activity of acid α-amylase was 221
U/mL and 2.3-fold more than that of no optimization.
Key words:  Acid α-amylase 16S rDNA Bacillus subtilis Optimum temperature Optimum pH Orthogonal experiment
下水解淀粉的酶类，最适 pH 一般为 4.0-5.5［5，6］。
凭借其良好的耐酸性，酸性 α-淀粉酶被广泛应用于
制糖、酿造和药物生产等领域，并能有效减少加工
工艺过程中化学试剂的消耗［7］，降低副产物的形成，
减少环境污染，具有重要的经济和社会效益。国外
对耐酸性的 α-淀粉酶的研究较早，日本学者 Minoda
等［8］在 1963 年发现黑曲霉可以产酸性α-淀粉酶以来，
欧洲、美国、韩国等国家都开始对耐酸性 α-淀粉酶
进行了研究，其中得到的产耐酸性 α-淀粉酶的微生
物大多为芽孢杆菌和曲霉［9］。我国开展相关研究起
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第4期160
步较晚，刘雅琴等［10］在筛选获得的耐酸性 α-淀粉
酶产生菌基础上，对其进行发酵培养基与发酵条件
的优化，最终 α-淀粉酶活力比初始时提高了 0.65 倍，
达到 31.4 U/mL。张丽靖等［11］筛选获得了一株枯草
芽孢杆菌 B. subtulis B6，其所产耐酸性 α-淀粉酶最
适 pH 为 5.0，最适温度为 55℃，活力达到 33.4 U/mL，
且该酶对 Ca2+ 没有依赖性，Fe2+ 和 Mg2+ 抑制作用不
明显。可以看出通过筛选得到耐酸性 α-淀粉酶酶活
均不高，在具有一定耐酸能力的情况下其酶活力还
远未达到实际生产的需要，需要进一步筛选产酶能
力强的菌株并优化其产酶条件。
本研究在筛选获得耐酸性 α-淀粉酶菌株的基础
上，利用单因素及正交法对其培养基组成进行优化，
旨在实现该菌株耐酸性 α-淀粉酶的高水平生产。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 土样来源 面粉厂、酒糟、食品厂和康师傅
工厂附近水样和土样 15 余份。
1.1.2 培养基 双层筛选培养基（鉴别菌株是否产
生耐酸性 α-淀粉酶）：底层培养基 ：胰蛋白胨 1%，
酵母浸出粉 0.5%，NaCl 1%，琼脂粉 1.5%，pH 自然；
上层为淀粉半固体培养基 ：可溶性淀粉 1%，锥虫蓝
0.05%，琼脂粉 1%，pH4.5-5.0。种子培养基 ：蛋白
胨 1%、 酵 母 粉 0.5%、NaCl 1%，pH4.5-5.0。 初 始
发酵培养基 ：蛋白胨 1%、酵母粉 0.5%、NaCl 1%，
pH4.5-5.0。
1.2 方法
1.2.1 土样采集 分别从面粉厂、酒糟、食品厂、
康师傅工厂附近采集土样和水样，4℃下保藏备用。
1.2.2 菌种初筛 分别称取不同土样或水样 1 g/1
mL，放入装有 50 mL 无菌水的三角瓶中。取上清液
1 mL 于装有 9 mL 无菌水的试管内，振荡摇晃，匀
液取 1 mL 放入另一装有 9 mL 无菌水的试管内，重
复上述步骤制成不同浓度梯度的稀释液。取适当稀
释 度（10-4、10-6、10-7、10-8） 的 样 品 200 μL 涂 布
于筛选培养基，30℃倒置培养 24 h，在此基础上倒
入双层筛选培养基的上层培养基，30℃倒置培养 24
h，由于锥虫蓝和淀粉胶联可形成蓝色复合物，在淀
粉被淀粉酶水解后，蓝色褪去，在平板上直观地观
察到透明水解圈。挑选透明圈直径（H）与菌落直
径（C）之比较大者，即为初筛菌株。
1.2.3 菌种复筛 将初筛菌种接入液体发酵培养基，
30℃、200 r/min 摇床发酵 2 d，取上清测酶活，酶活
最大菌株即为筛选获得的耐酸性 α-淀粉酶生产菌。
1.2.4 酶活测定 由于筛选得到的菌株所产的 α-淀
粉酶为耐酸性 α-淀粉酶，故对国标 GB/T 24401—
2009 的测量过程稍作修改。参照 GB/T 24401—2009，
酶活力单位定义 ：1 g 固体酶粉（或 1 mL 液体酶）
在 60℃、pH4.5 条件下，1 h 液化 1 mg 可溶性淀粉
成为糊精所需要的酶量，即为 1 个酶活力单位，以
U/mL（或 U/g）表示。
X ＝ c×n
式中，X ：样品的酶活力（U/mL，或 U/g）；c ：
测试酶样的浓度（U/mL，或 U/g）；n ：样品的稀释倍
数。所得结果表示至整数。
1.2.5 菌种鉴定 常规鉴定参照文献［12］中的方
法进行。基因组 DNA 的提取参照文献［13］所述的
方法进行，采用通用引物 27F（5-AGAGTTTGATC-
CTGGCTAG-3）和 1541R（5-TACGGCTACCTTGTT-
ACGACT-3）进行 16S rDNA 的扩增。扩增体系（50
μL）：ddH2O 37 μL，10×buffer 5 μL，dNTPs（2.5
mmol/L each）5 μL，上、下游引物（20 μmol/L）各
0.75 μL，DNA 模板 1 μL，Taq DNA 聚合酶 0.5 μL ；
PCR 反应条件为 ：95℃ 5 min ；94℃ 45 s，55℃ 45 s，
72℃ 90 s，25 个循环 ；72℃ 10 min。
1.2.6 酶学性质初步研究 配置不同 pH（3.0-7.0）
柠檬酸-磷酸缓冲液，测定酶的最适反应 pH ；并在
最适 pH 下测定不同温度（30-70℃）对酶活的影响，
确定酶的最适温度。
1.2.7 发酵培养基的优化 通过单因素试验分别考
察氮源、碳源、金属离子对菌体产酶的影响，在此
基础上对碳源、氮源、CaCl2 和 NaH2PO4 4 因素作 3
水平的正交试验，得到最优培养基的配比。
2 结果
2.1 菌株的筛选
从土样和水样中筛选得到 130 株产淀粉酶菌株，
其中 12 株酶活较高（图 1，表 1），菌株 A-7 酶活最
2014年第4期 161王建玲等 ：产耐酸性 α-淀粉酶菌株的分离、鉴定、酶学特性研究及发酵培养基的优化
高，达 95 U/mL，将该菌株作为下一步试验菌株。 BLASTH 比对，得知该菌株与枯草芽孢杆菌（Bacillus
subtilis）的 16S rDNA 的序列同源性最高，达到 99%
以上，因此将该菌株归属为枯草芽孢杆菌，命名为
Bacillus subtilis A-7。
图 1 产淀粉酶菌株的水解透明圈
表 1 初筛菌株酶活比较
菌株编号 D/d 值 平均酶活力（U/mL）
A-1 1.30 -
A-2 2.01 82
A-3 1.78 74
A-4 1.42 61
A-5 1.99 82
A-6 1.21 -
A-7 2.48 95
A-8 1.57 68
A-9 1.59 67
A-10 1.77 72
A-11 1.45 60
A-12 1.44 60
“-”为未检测到酶活
2.2 菌种鉴定
筛选出来的 A-7 菌株培养后观察菌落形态，发
现菌落较大较圆，菌落边缘不规则，菌落表面较粗糙，
不透明，菌落颜色为黄褐色。菌种经革兰氏染色呈
紫色，为阳性，菌体呈杆状（图 2）。
图 2 菌种革兰氏染色结果
1500
bp
M 1
M ：1 kb DNA ladder ；1 ：PCR 产物
图 3 PCR 结果
2.4 酶学性质的初步研究
2.4.1 最适 pH 在不同 pH 值条件下，60℃测定 A-7
的活力，将酶活最高者定为 100%，结果（图 4）显
示，菌株 A-7 所产的淀粉酶的活力受酸碱度影响较
大，在偏酸的条件下酶活力较高。其最适 pH 为 4.5，
在 pH4-6 之间，相对酶活在 60% 以上。
3 4 5 6 7
0
20
40
60
80
100
⴨ሩ
䞦⍫
%
pH
图 4 pH 对 α-淀粉酶活性的影响
2.4.2 最适温度 在不同温度条件下，pH4.5 测定
α-淀粉酶的活力。结果（图 5）显示，A-7 反应的最
适温度均为 60℃，在 40-80℃之间相对酶活均较高，
40-60℃范围内酶活力随温度上升而升高，60℃时酶
活力达到最高，随后酶活力随温度上升而下降。
2.5 发酵培养基的优化
2.5.1 碳源对产酶的影响 考虑到发酵成本问题，
本实验室选用了几种常见碳源进行优化，氮源为 1%
蛋白胨，由表 2 可知，可溶性淀粉是产酶的最佳碳源，
淀粉酶的酶活达到 142 U/mL，可溶性淀粉的最佳浓
2.3 16S rDNA鉴定
16S rDNA 序列是细菌鉴定的重要指标，通过
PCR 扩增该菌株的 16S rDNA 序列，大小约为 1 500
bp（图 3），将该片段的测序结果在 NCBI 上进行
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第4期162
度试验表明，随着可溶性淀粉浓度的增加，酶活不
断提高，当浓度达到2%时，酶活最高，达到 161 U/mL，
当继续增大可溶性淀粉浓度时，淀粉酶活力反而随
之下降，所以选取 2% 可溶性淀粉为最佳碳源。
表 2 碳源对酶活的影响
碳源 酶活力（U/mL） 碳源 酶活力（U/mL）
葡萄糖 114 糊精 130
可溶性淀粉 142 薯干粉 89
玉米粉 123 蔗糖 130
2.5.2 氮源对产酶的影响 为考察有机氮源和无机
氮源对菌株产酶的影响，分别选取蛋白胨、酵母膏、
牛肉膏、玉米浆、尿素、NH4Cl 作为氮源，碳源为 2%
的可溶性淀粉，其他条件相同，结果（表 3）显示，
有机氮源比无机氮源更有利于菌株产酶，其中蛋白
胨为最优氮源，淀粉酶的酶活可达 161 U/mL，蛋白
胨的最佳浓度试验表明，当浓度为 2% 时，酶活最高，
可达 177 U/mL，蛋白胨浓度降低或升高，均抑制菌
株的产酶。因此选取 2% 蛋白胨为最佳氮源。
表 3 氮源对酶活的影响
氮源 酶活（U/mL） 氮源 酶活（U/mL）
蛋白胨 161 玉米浆 121
酵母膏 149 尿素 90
牛肉膏 131 NH4Cl 77
2.5.3 金属 Ca2+ 离子浓度对产酶的影响 据 Machius
等［14］的研究可知，添加 Ca2+ 离子可促进芽孢杆菌产
α-淀粉酶，其原因为芽孢杆菌所产的 α-淀粉酶一般
是一种金属酶，Ca2+ 离子可保持 α-淀粉酶空间结构
和活力的稳定性，故选用不同浓度的 Ca2+ 离子进行
发酵，试验结果（表 4）显示，当 Ca2+ 浓度达到 0.06%
时，淀粉酶的酶活最高，达到 190 U/mL。
表 4 Ca2+ 含量对酶活的影响
Ca2+ 浓度 酶活（U/mL） Ca2+ 浓度 酶活（U/mL）
0 177 0.06 190
0.02 184 0.08 179
0.04 188 0.10 145
2.5.4 磷酸盐对产酶的影响 磷酸盐可维持发酵培
养基 pH 的稳定，并且磷元素是细胞合成核酸的一
种必须元素，可促进细胞的生长。结果（表 5）显示，
当磷酸盐达到 0.8% 时，酶活最高，达到 225 U/mL，
降低或升高磷酸盐浓度，酶活均受到抑制。
表 5 Na2HPO4 含量对酶活的影响
Na2HPO4 浓度 酶活（U/mL） Na2HPO4 浓度 酶活（U/mL）
0 190 1.2 193
0.4 199 1.6 178
0.8 205
2.5.5 正交试验 在单因素试验的基础上，对可溶
性淀粉、蛋白胨、CaCl2 和 Na2HPO4 4 因素作 3 水平
正交试验，结果如表 6 所示。方差分析表明，可溶
性淀粉浓度对菌株产酶的影响较显著。结合极差分
析结果，4 个因素的影响程度依次为 ：可溶性淀粉
＞蛋白胨＞磷酸盐 >CaCl2，由正交分析可得出培养
基配方最优水平组合为 ：可溶性淀粉 2%，蛋白胨
2%，CaCl2 0.07%，Na2HPO4 0.8%。从理论上优化得
到的培养基是否是最佳产酶条件，还需要进一步通
过摇瓶发酵试验进行验证。验证结果表明，重组酶
活力达到 221 U/mL，此活力大于正交试验中出现的
所有结果，验证了选取该结果的正确性。因此，确
定最适发酵培养基配方为 ：可溶性淀粉 2%，蛋白胨
2%，CaCl2 0.07%，Na2HPO4 0.8%。
3 讨论
世界工业酶市场市值约为 3 亿美元，其中 α-淀
粉酶是一种重要的酶制剂，占据酶制剂市场的 25%
左右［15］。在淀粉深加工产业中，酸性 α-淀粉酶的需
求量越来越大［16］。现阶段所筛选得到产耐酸性 α-淀
粉酶的菌株主要为芽孢杆菌和曲霉，最适 pH4.5-5.5
之间，最适温度在 30-60℃之间［17］，但初始酶活力
均不高，无法满足实际生产的需要。所以仍需在自
然界中进一步筛选可耐酸、具有一定耐热能力和高
40 50 60 70 80 90
20
40
60
80
100
⴨ሩ
䞦⍫
%
⑙ᓖ℃
图 5 温度对 α-淀粉酶活性的影响
2014年第4期 163王建玲等 ：产耐酸性 α-淀粉酶菌株的分离、鉴定、酶学特性研究及发酵培养基的优化
活力的 α-淀粉酶生产菌株。近几年，尽管我国酶制
剂工业得到了长足的发展，但与国际先进水平仍存
在不小的差距，其中最主要的差距就是我国 α-淀粉
酶的品种和生产菌株比较单一，为了缩小这种差距，
利用基因工程手段改造菌株或筛选菌株的方法来扩
充 α-淀粉酶的品种和生产菌株就显得尤为重要。
4 结论
从采集到的土样中筛选出一株产耐酸性 α-淀粉
酶的菌株，经过 16S rDNA 鉴定为枯草芽孢杆菌。对
该菌株所产的 α-淀粉酶耐酸性的研究表明，该酶在
pH4.5、中等温度下能表现出比较高的酶活，并在此
基础上，分别对碳源、氮源、金属离子以及磷酸盐
对菌株产耐酸性 α-淀粉酶的影响，通过正交试验进
一步分析确定了最优发酵培养基为可溶性淀粉 2%，
蛋白胨 2%，CaCl2 0.07%，Na2HPO4 0.8%。最高酶活
达到 221 U/mL，是初始酶活的 2.3 倍。
参 考 文 献
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（责任编辑 马鑫）
表 6 培养基配方正交试验结果及其极差分析
可溶性淀粉 蛋白胨 CaCl2 Na2HPO4 酶活力（U/mL）
1 1.5（1） 1.5（1） 0.05（1） 0.6（1） 185
2 1.5（1） 2.0（2） 0.06（2） 0.8（2） 197
3 1.5（1） 2.5（3） 0.07（3） 1.0（3） 190
4 2.0（2） 1.5（1） 0.06（2） 1.0（3） 200
5 2.0（2） 2.0（2） 0.07（3） 0.6（1） 211
6 2.0（2） 2.5（3） 0.05（1） 0.8（2） 206
7 2.5（3） 1.5（1） 0.07（3） 0.8（2） 198
8 2.5（3） 2.0（2） 0.05（1） 1.0（3） 206
9 2.5（3） 2.5（3） 0.06（2） 0.6（1） 193
均值 1 190.667 194.333 199.000 196.333
均值 2 205.667 204.667 196.667 200.333
均值 3 199.000 196.333 199.667 198.667
极差 15.000 10.334 3.000 4.000