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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第6期
收稿日期 : 2011-11-03
基金项目 : 深圳市科技计划项目（JC200903180710A）
作者简介 : 柴化建 , 男 , 硕士研究生 , 研究方向 : 微生物生理 ; E-mail: robinchj@126.com
通讯作者 : 赵海泉 , 副教授 , 研究方向 : 生物技术应用 ; E-mail: swjs12@ahau.edu.cn
植原体免疫主导膜蛋白 Imp基因原核表达
载体构建及表达
柴化建1 赵海泉1 张丽君2 罗焕亮3
（1 安徽农业大学生命科学学院，合肥 230036 ；2 深圳市职业技术学院，深圳 518055 ；3 深圳出入境检验检疫局，深圳 518045）
摘 要： 旨在构建植原体免疫主导膜蛋白 Imp基因原核表达载体，并进行初步表达。以重组克隆质粒 pMD18-T-Imp为模板，
PCR扩增 Imp基因片段。构建表达载体 pET-28a（+）-Imp，转化宿主菌 E. coli BL21（DE3）。筛选阳性克隆，提取重组质粒作 PCR鉴
定、酶切鉴定及 IPTG诱导表达鉴定。PCR及双酶切结果显示，重组质粒 pET-28a（+） -Imp构建成功。经 IPTG诱导 BL21（pET-28a
（+）-Imp）表达约 20 kD的蛋白，与预期的携带 6 ×His-Tag的目的蛋白（19.5 kD）大小相符，主要以包涵体形式存在。结果显示，
构建的表达载体 pET-28a（+）-Imp在 E. coli BL21（DE3）中能够达一定量表达，为进一步纯化 Imp蛋白奠定基础。
关键词： 植原体 免疫主导膜蛋白 原核表达
Construction of Immunodominant Membrane Protein Gene
Prokaryotic Expression Vectors to Phytoplasma and Its Expression
Chai Huajian1 Zhao Haiquan1 Zhang Lijun2 Luo Huanliang3
（1College of Life Science, Anhui Agricultural University, Hefei 230036；2Shenzhen Polytechnic, Shenzhen 518055；
3Shenzhen Extry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Shenzhen 518045）
Abstract: To construct expression vector of phytoplasma immunodominant membrane protein gene （Imp）, and to induce expression in
E. coli BL21（DE3）. The gene of Imp was amplified by PCR from the recombinant colony vector pMD18-T-Imp. The Imp gene was inserted
into plasmid pET-28a （+）, the recombinant plasmid pET-28a（+） -Imp was transformed into E. coli BL21（DE3）. The recombinant plasmid
was extracted and purified, and was analyzed by PCR and restricted enzyme assay. Recombinant protein was expression being induced by IPTG,
and was identified by SDS-PAGE. PCR and double enzyme digestion assay confirmed that the recombinant plasmid pET-28a（+）-Imp was
constructed successfully. By IPTG inducing, the recombinant protein was obtained in E. coli BL21（DE3）. SDS-PAGE analysis indicated the
fusion protein Imp with 6×His-Tag was about 20 kD, mainly expressed in the inclusion body. The recombinant expression vector pET-28a（+）-
Imp was able to express of Imp in E. coli BL21 （DE3）, lays a foundation for further research on producing purification of Imp．
Key words: Phytoplasma Immunodominant membrane protein Prokaryotic expression
植原体（phytoplasma）是一种存在于植物韧皮
部筛管细胞中类似植物病原细菌的单细胞原核生
物［1］。植原体对植物危害严重，可引起植物黄化、
小叶、皱叶及丛枝等，因其侵染性强，危害寄主广
泛，目前尚无根治方法，易造成严重的经济损失［2］。
由于植原体不能够体外培养，难以获得大量高纯度
的植原体，制约了植原体检测防控、致病机制及流
行性等研究［3］。因致病植原体无细胞壁，所以植原
体可能通过分泌膜蛋白直接接触寄主而致病。以此
推测植原体膜蛋白在寄主与植原体相互作用过程中
起着重要的作用。现在对于植原体膜蛋白的研究主
要集中于植原体的免疫膜蛋白和 Sec（蛋白转运系
统）膜蛋白［4，6］。其中免疫膜蛋白（immunodominant
membrane proteins，IDPs）是大多数植原体总细胞膜
2012年第6期 107柴化建等 ：植原体免疫主导膜蛋白 Imp 基因原核表达载体构建及表达
蛋白的主要部分［7， 8］。通过基因对比分析，免疫膜
蛋白 IDPs 可分成 3 种类型 ：（1）免疫主导膜蛋白
（immunodominant membrane protein，Imp）；（2）免疫
主导膜蛋白 A（immunodominant membrane protein A，
IdpA）；（3）免疫抗原膜蛋白（antigenic membrane
protein，Amp）。其中免疫主导膜蛋白（immunodom-
inant membrane protein，Imp）是其中重要的一种［7， 8］。
Imp 分子量大约为 19 kD 大小，分子结构由膜内侧
N 端、疏水跨膜的 α-螺旋片段、膜外亲水的 C 端
3 部分组成 ［9］ 。原核表达免疫膜蛋白 Imp，其基因
编码蛋白的跨膜结构区可能对其原核表达有一定影
响［10］。若以包涵体形式在原核细胞尤其在大肠杆菌
中能够高效表达外源基因，易于毒性蛋白和膜蛋白
的表达［11］。通过对植原体膜蛋白 Imp 基因进行特异
性扩增，设计构建合适的原核表达载体，原核表达
带有 6×His-Tag 的目的蛋白，以纯化获得大量高纯
度的植原体免疫膜蛋白 Imp，用于免疫获得相应的
特异性抗原抗体，以制备特异性高通量检测的蛋白
质芯片，对植原体致病机理及检测研究有着重要的
理论与实践意义。本研究在前期研究的基础上构建
Imp 原核表达载体，并获得初步诱导表达结果，旨
在为后续诱导纯化 Imp 及制备抗 Imp 单克隆抗体奠
定基础。
1 材料与方法
1.1　材料
1.1.1 菌株与载体 大肠杆菌 E. coli BI21（DE3）、
原核表达载体 pET-28a（+）、重组克隆质粒 pMD18-
T-Imp 均由本实验室构建保存。
1.1.2 酶类及主要试剂 限制性内切酶 Nde I 和 Xho
I 购于 NEB 公司 ；PCR Master Mix、T4 DNA 连接酶
购于大连宝生公司 ；DNA Marker、小规模质粒提取
试剂盒、琼脂糖胶 DNA 纯化回收试剂盒均购自北京
索莱宝公司 ；BugBuster Master Mix 预混蛋白抽提试
剂购自 Novagen 公司。其他试剂均为国产或进口分
析纯。
1.2 方法
1.2.1 引物设计 从 GenBank 中检索到已公布的植
原体免疫主导膜蛋白基因 Imp 序列，进行引物对
设计，根据表达载体 pET-28a（+）特性，上游引物引
入酶切位点 Nde I，下游引物引入酶切位点 Xho I。
上游引物 F1：F5-acCATATGGAAGGTAAGCAGCAA-
ATAACGA-3，下游引物 R1：R5-cgGAGCTCATCCA
TCTCCAGTGCGGTCTCAATC-3，引物由上海生工生
物公司合成。
1.2.2 Imp 基因 PCR 扩增及产物回收纯化 以重组
克隆质粒 pMD18-T-Imp 为模板，利用常规 PCR 扩
增反应进行。反应体系 50 μL ：DNA 模板 2 μL，引
物 F1、R1 各 1 μL，Prime MIX DNA 聚合酶 25 μL，
ddH2O 21 μL。PCR 扩增程序 ：95℃预变性 5 min ；
94℃变性 2 min，50℃退火 1 min，72℃延伸 2 min，
共 30 个循环 ；然后 72℃延伸 10 min，4℃保温。
PCR 产物用 1% 琼脂糖凝胶电泳鉴定，并用 DNA 胶
回收试剂盒纯化 PCR 产物。
1.2.3 原核表达载体的构建与鉴定 将纯化的 PCR
产物与原核表达载体 pET-28a（+）分别用 Nde I、
Xho I 双酶切。酶切体系 25 μL ：pET-28a（+）/PCR
回收产物 15 μL，10×H Buffer 2 μL，Nde I（10 U/μL）、
Xho I（10 U/μL）各 1 μL，ddH2O 5 μL。回收经 T4
DNA 连接酶 16℃水浴连接 12-16 h。转化至 CaCl2
法制备的 BL21（DE3）感受态细胞。从转化平板（含
Kan 40 μg/mL）上随机挑选几个转化子菌落，37℃振
荡培养提取重组质粒，通过双酶切和 PCR 扩增的方
法检测重组子，命名为 pET-28a（+） -Imp（图 1）。
图 1 融合蛋白原核表达载体构建示意图
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第6期108
1.2.4 重组菌 E. coli BL21（pET-28a（+）-Imp）的
诱导表达及鉴定 挑取经鉴定的阳性单克隆，接
入 10 mL LB（含 Kan 40 μg/mL）液体培养基中，于
37℃、200 r/min 过夜培养。按 1% 的接种量，转接
至装有 50 mL LB 培养基中，培养至 OD600 为 0.5-0.6
左右，加入 IPTG 至终浓度为 0.4 mmol/L，37℃继续
培养 4 h。离心收集菌体，用 PBS 重悬。取 75 μL 重
悬液与 25 μL 4× 蛋白上样缓冲液混合，液沸水煮
5 min，上样量 10 μL。进行 SDS-PAGE 分析，浓缩
胶浓度 4%，分离胶浓度 9%。
1.2.5 目的蛋白可溶性分析 取 100 mL 诱导培养
液，6 000 r/min，10 min，4℃ 收 集 细 胞。 用 5 mL
BugBuster Master Mix 蛋白抽提试剂室温下振荡重悬
沉淀，孵育 30 min 裂解菌体。然后 4℃，12 000 r/min
离心 20 min，收集上清液，作为可溶性蛋白。沉淀
用与蛋白抽提试剂等体积的 PBS 重悬，作为包涵体。
以 80 μg/mL 的牛血清白蛋白（BSA）溶液为参照，
到表达载体 pET-28a（+）中。
2.3 诱导表达及鉴定
挑取阳性克隆，诱导表达。原核表达质粒 pET-
28a（+）-Imp 转化至 E. coli BL21（DE3），在 IPTG
诱导后，表达 Imp 融合蛋白，经 9% SDS-PAGE 分析
鉴定（图 5），可见分子量约为 20 kD，与预期的携
带 6×His-Tag 的目的蛋白（19.5 kD）大小相符。
2.4 目的蛋白可溶性分析
对可溶性蛋白与包涵体分离，并进行 SDS-
M. DNA Marker；1. pMD18-T PCR 产物；
2. pMD18-T-Imp PCR 产物
图 2 Imp基因 PCR产物琼脂糖电泳
与上清、包涵体悬液进行 SDS-PAGE 电泳检测凝胶
扫描，通过 Gene Tools 半定量分析可溶性蛋白与包
涵体比例及含量。
2 结果
2.1 植原体膜蛋白基因Imp的PCR扩增
以重组克隆 pMD18-T-Imp 为模板 PCR 扩增，
PCR 产物经 1% 琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果（图 2）
显示，PCR 产物在 500 bp 左右处有明显条带，与目
的基因 Imp（507 bp）片段大小一致。
2.2 表达载体pET-28a（+）-Imp的构建和鉴定
以 Nde I 和 Xho I 双酶切重组表达质粒 pET-28a
（+）-Imp，并以重组质粒为模板 PCR。通过 1% 琼
脂糖凝胶电泳鉴定酶切与 PCR，结果（图 3）显示，
酶切得到约 5 369 bp 的 pET-28a（+）线性片段和约
507 bp 的插入片段。PCR 电泳（图 4）显示从重组
质粒上扩增到插入基因，说明 Imp 基因已成功插入
M. DNA Marker ；1.pET-28a（+）-Imp ；
2. pET-28a（+）
图 3 pET-28a（+）-Imp 酶切鉴定
M. DNA Marker；1. pET-28a（+）-Imp；
2. pET-28a（+）
图 4 pET-28a（+）-Imp PCR鉴定
PAGE 电泳检测，结果显示构建于 pET-28a（+）原
核表达载体中的植原体免疫主导膜蛋白（Imp）基因，
在宿主菌 E. coli BL21（DE3）中诱导表达，目的蛋
白主要以包涵体形式存在。凝胶扫描后，以已知量
的 BSA 为参照，通过 Gene Tools 半定量分析，包涵
体的含量占总融合蛋白的 70% 以上，且背景蛋白表
达量受到限制（图 6）。
3 讨论
虽然在植原体免疫膜蛋白结构信息学方面的研
2012年第6期 109柴化建等 ：植原体免疫主导膜蛋白 Imp 基因原核表达载体构建及表达
使重组蛋白表达量增大，且表达必须受调节基因严
格调控。并要求能在一定菌体浓度下开始诱导表达，
外源蛋白过量表达，尤其细胞毒性蛋白会严重抑制
菌体生长从而降低蛋白总表达量［12］。pET-28a（+）
质粒载体，受噬菌体 T7 强转录及翻译信号控制 ；E.
coli BL21（DE3）宿主细胞提供 T7 RNA 聚合酶进行
诱导调控。T7 RNA聚合酶机制十分有效并具选择性，
目的蛋白通常可以占到细胞总蛋白的 50% 以上，目
的蛋白聚集成不溶的没有生物活性的包涵体。形成
包涵体较有利于纯化，而且毒性蛋白主要以无活性
的包涵体形式表达，将减小目的蛋白表达对宿主菌
的生长抑制。试验结果表明，利用 E. coli BL21（DE3）
菌株作为宿主菌，pET-28a（+）作为表达载体，Imp
的表达可以达到理想表达量。
4 结论
利用原核表达系统是获取大量植原体免疫膜蛋
白的一条有效途径。通过对重组植原体免疫主导膜
蛋白 Imp 原核表达的研究，发现植原体膜蛋白 Imp
的原核表达对宿主大肠杆菌产生一定影响。但是通
过选择合适的表达载体及宿主菌，进行有效的诱导
调控，可减少外源蛋白表达对宿主的影响，以获取
大量免疫主导膜蛋白。本试验中目的蛋白主要以包
涵体形式存在，包涵体含量占到总融合蛋白的 70%
以上，植原体免疫主导膜蛋白得到一定量的表达。
参 考 文 献
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诱导 ；3，4. E. coli BL21（DE3）（pET-28a（+））诱导 / 未诱导
图 5 Imp在 BL21（DE3）中的表达
M. 蛋白质 Marker ；1. 包涵体 ；2. 可溶性蛋白 ；BSA. 牛血清白蛋白
图 6 目的蛋白可溶性分析
究已有一定进展，但是并不足以解释其功能机制［4］。
由于植原体不可体外培养的特性，使得获得大量高
纯度的植原体免疫膜蛋白变得困难，继而限制了高
效价抗植原体特异性单克隆抗体的制备及植原体膜
蛋白功能机制的研究。因此，需要建立一个有效的
表达系统获取目的蛋白并进行研究。据报道免疫膜
蛋白（Imp）的跨膜区可能影响其在大肠杆菌中的
表达，但影响机制目前尚不清楚。只有切除 N 端
和 C 端跨膜区的 Imp 基因的序列才能得到了大量表
达［10］。2002 年，Barbara 等［6］研究到植原体免疫抗
原膜蛋白基因Amp对大肠杆菌细胞有毒性。2008年，
Arashida 等［11］在大肠杆菌中表达了日本八仙花变
叶病植原体的免疫抗原膜蛋白基因，得到了抗 JHP-
Amp 的抗体。由此证明在原核生物体中表达具有毒
性的蛋白或膜蛋白，表达载体的构建及宿主菌的选
择是实现高效表达的关键步骤。
对与毒性蛋白或膜蛋白的表达，毒性蛋白或膜
蛋白的原核表达载体，启动子要有很强的启动性，
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第6期110
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（责任编辑 马鑫）
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