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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第12期
青天葵来源于兰科芋兰属多年生宿根草本植物
毛 唇 芋 兰［Nervilia fordii（Hance）Schltr.］ 的 叶 或
全草，具有润肺止咳、清热解毒、散瘀止痛之功效，
临床上多用于小儿呼吸道疾病［1］。由于人类无序开
发及自身生长条件苛刻，青天葵野生资源已渐枯竭，
青天葵也已被列入了《中国南部石灰岩稀有濒危植
物名录》和《濒危动植物物种国际贸易公约》［2-4］。
收稿日期 : 2012-05-22
基金项目 : 教育部博士点基金联合资助项目（200805720004）, 教育部留学回国人员科研项目［教外司留（2009）1001］
作者简介 : 黄琼林 , 男 , 博士研究生 , 研究方向 : 创新中药研究与开发 ; E-mail: perfecthql@163.com
通讯作者 : 何瑞 , 女 , 研究员 , 研究方向 : 中药资源保护与可持续利用 ; E-mail: vip.ruihe@gzucm.edu .cn
陈蔚文 , 男 , 教授 , 研究方向 : 创新中药研究与开发 ; E-mail: chenww@gzucm.edu.cn
基于条形码 ITS2 序列的青天葵及其混伪品分子鉴别
黄琼林  马新业  何瑞  詹若挺  陈蔚文
（广州中医药大学中药资源科学与工程研究中心 岭南中药资源教育部重点实验室，广州 510006）
摘 要 ： 通过分析青天葵及其常见混伪品的 ITS2 序列，建立青天葵新型真伪鉴别方法。采用植物基因组 DNA 提取试剂盒
提取青天葵及其混伪品的叶片 DNA，一对通用引物 PCR 扩增 ITS2 基因片段并直接双向测序。采用 DNAMAN、ClustalX 软件拼接
比对序列，MEGA4.0 软件构建 NJ 树，Schultz 等建立的数据库和网站预测 ITS2 序列的二级结构。结果显示，获得的 12 条 ITS2 序
列的长度范围为 203-242 bp，GC 含量范围为 53.1%-71.8%。所有样品 ITS2 序列比对后的长度为 249 bp，其中存在 226 个变异位点。
青天葵种间 K2P 遗传距离（1.125）远大于种内 K2P 遗传距离（0.004）。基于 ITS2 的序列的 NJ 树和二级结构均能直观地区分青天
葵及其混伪品。
关键词 ： 青天葵 ITS2 混伪品 分子鉴别
Molecular Identification of Nervilia fordii（Hance）Schltr. and Its
Adulterants Based on lTS2 DNA Barcodes
Huang Qionglin Ma Xinye He Rui Zhan Ruoting Chen Weiwen
（Research Center of Chinese Herbal Resource Science and Engeering，Key Laboratory of Chinese Medicinal Resource from Lingnan，Guangzhou
University of Chinese Medicine，Ministry of Education，Guangzhou 510006）
Abstract:  It was to establish a novel identification method for Nervilia fordii and its adulterants through ITS2 sequence analysis. Total
DNA was extracted from fresh leaves, and ITS2 region was amplified and sequenced with a pair of universal primers. The sequences were
assembled and aligned by DNAMAN and CLUSTALX, and NJ tree was constracted using MEGA 4.0. Secondary structures of ITS2 sequences
were predicated in the database built by Schultz et al. Significant differences were observed in the ITS2 sequences between Nervilia fordii and
its adulterants. The interspecific genetic distance was far more than the intraspecific disatance. Both NJ tree and secondary structure based on
ITS2 sequences can distinguish Nervilia fordii and its adulterants intuitively. ITS2 is an effective biomarker to identify Nervilia fordii and its
adulterants.
Key words:  Nervilia fordii（Hance） Schltr. ITS2 adulterant Molecular identification
在经济利益的驱使下，市场上出现了众多青天葵
的混伪品，主要有同属植物毛叶芋兰［Nervilia pli-
cata（Andr.）Schltr.］、车前科植物车前草［Plantago
asiatica L］、旋花科植物红薯［Ipomoea batatas（L.）
Poir］、 伞 形 科 植 物 积 雪 草［Centella asiatica（L.）
Urb.］、天南星科植物犁头尖［Typhonium diaricatum
（L.）Dence］、堇菜科植物紫花地丁（Viola yedoensis
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第12期174
Makino）、 马 兜 铃 科 植 物 华 细 辛（Asarum siboldii
Miq.）等［5］。鉴于青天葵掺伪造假情况严重，有必
要采用简便、准确的方法对青天葵及其混伪品进行
鉴别研究，为青天葵的资源保护和临床用药安全提
供依据和保障。
DNA 条形码（DNA barcoding）由加拿大分类学
家 Hebert［6］于 2003 年首次提出，是利用一段较短
的标准 DNA 片段快速准确地进行物种鉴别的方法。
第二转录间隔区（internal transcriped space 2，ITS2）
因其两端具有保守区便于通用引物的设计、序列长
度适中和容易扩增、变异位点充足等优点，被选作
为药用植物的通用 DNA 条形码［7］，并应用于威灵
仙［8］、大黄［9］、党参［10］等多种中药的真伪鉴别。
本研究分析青天葵及其混伪品的 ITS2 序列，旨
在为青天葵的准确鉴定提供分子依据。
1 材料与方法
1.1 材料
样品信息见表 1，包括试验样品和来自 GenBank
下载序列。试验样品经广州中医药大学中药资源科
学与工程研究中心詹若挺研究员鉴定，取其新鲜叶
片置 -70℃超低温冰箱保存备用，凭证标本保存于广
州中医药大学中药资源科学与工程研究中心。
植物基因组 DNA 提取试剂盒购自北京天根生
物科技公司 ；PCR 试剂、Ex Taq DNA 聚合酶、DNA
Markers 购自大连宝生物工程公司 ；引物合成和测序
由北京六合华大基因科技股份有限公司广州分公司
完成。
表 1 试验样品及序列信息
材料 拉丁学名 来源 GenBank 登录号
青天葵 Nervilia Fordii（Hance）Schltr. 本实验室培育 JX011630
青天葵 Nervilia Fordii（Hance）Schltr. 本实验室培育 JX011631
毛叶芋兰 Nervilia plicat（Andr.）Schltr. GenBank AF324179
车前草 Plantago asiatica L. 广州中医药大学 JQ916063
车前草 Plantago asiatica L. 广东省平远县 JQ916064
积雪草 Centella asiatiaca（L.）Urb. GenBank GQ434697
积雪草 Centella asiatiaca（L.）Urb. GenBank GQ434698
红薯叶 Ipomoea batatas（L.）Poir 广州中医药大学 JQ916065
红薯叶 Ipomoea batatas（L.）Poir 广州大学城 JQ916066
犁头尖 Typhonium diaricatum（L.）Dence GenBank AY863058
紫花地丁 Viola yedoensis Makino GenBank JF421554
华细辛 Asarum siboldii Miq. GenBank FJ428641
1.2 方法
1.2.1 DNA 提取 参照植物基因组 DNA 提取试剂
盒说明书提取总 DNA。将 DNA 溶液稀释至浓度为
25 ng/μL，分装并置 -20℃保存。
1.2.2 PCR 扩增与测序 扩增引物正向为 5-GCGA-
TACTTGGTGTGAAT-3，反向为 5-GACGCTTCTCCA-
GACTACAAT-3［7］。PCR 反应体系： 总体积为 100 μL，
其中 10×Ex Taq buffer 10 μL、dNTP（10 mmol/L）6.0
μL、正反向引物（10 μmol/L）各 2.0 μL、模板 DNA
适 量、Ex Taq DNA 聚 合 酶（2.5 U/μL）1.0 μL， 用
灭菌蒸馏水补足体积。PCR 反应程序 ：94℃ 2 min ；
94℃ 0.5 min，52℃ 0.5 min，72℃ 1.0 min，35 个循
环 ；72℃ 5 min。PCR 产物以 1％琼脂糖凝胶电泳检
测，纯化后送样测序。
1.2.3 序列分析 应用 CodonCode Aligner 2.06 软件
评估序列质量 ；DNAMAN 软件进行序列拼接 ；基于
隐马尔可夫模型的 HMM 注释方法去除所有序列两
端 的 5.8S 和 26S 区， 然 后 进 行 Blastn（Nucleoteide
Blast）比对，获得 ITS2 序列并提交 GenBank。采用
CLUSTALX 软件比对序列，基于 Kimura 2-Parameter
双参数模型和 Neighbor-Joining 邻接法，运用 MEGA-
4.0 分析遗传距离并构建系统发育树（1 000 次重复
bootstrap 检验各分支的支持率）。应用 Schultz 等［11］
建立的网站（http ：//its2. bioapps.biozentrum.uni-wuer
2012年第12期 175黄琼林等 ：基于条形码 ITS2 序列的青天葵及其混伪品分子鉴别
zburg.de/）和数据库（http：//pseudoview er .inha.ac.kr/
WSPV_quickSender.asp?seq=&str=）预测 ITS2 序列的
二级结构。
2 结果
2.1 序列差异分析
所 获 12 条 ITS2 序 列 长 度 范 围 为 203-242 bp，
GC 含量范围为 53.1%-71.8%。青天葵与混伪品的
ITS2 序列在长度或 GC 含量上均有所区别（表 2）。
所有样品 ITS2 序列比对后的长度为 253 bp，其中
存在 226 个变异位点，信息位点为 205 个。青天葵
的两条序列存在 1 处变异，为 148 bp 的 C-G 变异
（图 1）。
表 2 青天葵及其混伪品 ITS2 序列长度和 GC 含量
材料 拉丁学名 GenBank 登录号 序列长度（bp） GC 含量（%）
青天葵 Nervilia fordii（Hance）Schltr. JX011630 242 65.7
青天葵 Nervilia fordii（Hance）Schltr. JX011631 242 65.7
毛叶芋兰 Nervilia plicat（Andr.）Schltr. AF324179 242 66.9
车前草 Plantago asiatica L. JQ916063 203 54.7
车前草 Plantago asiatica L. JQ916064 203 54.7
积雪草 Centella asiatiaca（L.）Urb. GQ434697 234 71.8
积雪草 Centella asiatiaca（L.）Urb. GQ434698 234 71.8
红薯叶 Ipomoea batatas（L.）Poir JQ916065 223 70.0
红薯叶 Ipomoea batatas（L.）Poir JQ916066 223 70.0
犁头尖 Typhonium diaricatum（L.）Dence AY863058 230 53.9
紫花地丁 Viola yedoensis Makino JF421554 226 62.4
华细辛 Asarum siboldii Miq. FJ428641 211 53.1
2.2 遗传距离分析
基于 Kimura 2-Parameter 模型的遗传距离结果
如表 3。青天葵 K2P 种内距离为 0.004 ；与毛叶芋兰
（AF324179）K2P 种间距离最小，为 0.154，与红薯
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
1 Nervili fordii JX011630
2 Nervili fordii JX011631 0.004
3 Nervili plicat AF324179 0.154 0.159
4 Plantago asiatica JQ916063 0.798 0.793 0.864
5 Plantago asiatica JQ916064 0.798 0.793 0.864 0.000
6 Centella asiatiaca GQ434697 1.402 1.402 1.442 2.022 2.022
7 Centella asiatiaca GQ434698 1.402 1.402 1.442 2.022 2.022 0.000
8 Ipomoea batatas JQ916065 1.522 1.522 1.427 2.107 2.107 0.321 0.321
9 Ipomoea batatas JQ916066 1.569 1.569 1.469 2.275 2.275 0.329 0.329 0.005
10 Typhonium diaricatum AY863058 1.205 1.208 1.343 2.093 2.093 0.721 0.721 0.814 0.832
11 Viola yedoensis JF421554 1.283 1.283 1.267 1.659 1.659 0.703 0.703 0.650 0.663 0.571
12 Asarum siboldii FJ428641 1.406 1.403 1.452 1.427 1.427 0.781 0.781 0.716 0.729 0.868 0.839
（JQ916065）K2P 种间距离最大，为 1.569。青天葵
的种间平均 K2P 遗传距离（1.125）远远大于种内平
均 K2P 遗传距离（0.004），表明在 ITS2 序列中有足
够的差异鉴别青天葵以及混伪品。
表 3 青天葵及其混伪品的 K2P 遗传距离
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第12期176
图 1 青天葵及其混伪品 ITS2 序列的变异位点
2012年第12期 177黄琼林等 ：基于条形码 ITS2 序列的青天葵及其混伪品分子鉴别
2.3 聚类分析
基于 ITS2 序列构建的青天葵及其混伪品 NJ 聚
类树，如图 2 所示，所有样品分为聚为两大支，青
天葵的不同个体聚在一起，自展支持率达 86%，具
有明显的单系性，然后再与同属的毛叶芋兰先聚为
一支，最后与车前草聚为一大支 ；紫花地丁与犁头
尖先聚为一支，积雪草与红薯先聚成一支，然后两
者聚在一起，最后与细辛聚成另一大支。
100
100
100
100
83
86
63
62
99
Centella asiatiaca GQ434697
Centella asiatiaca GQ434698
Ipomoea batatas JQ916065
Ipomoea batatas JQ916066
Typhonium diaricatum AY863058
Viola yedoensis JF421554
Asarum siboldii FJ428641
Plantago asiatica JQ916063
Plantago asiatica JQ916064
Nervilia plic at AF324179
Nervilia fordii JX011630
Nervilia fordii JX011631
图 2 基于 ITS2 序列构建的青天葵及其混伪品的 NJ 聚类树
bootstrap 1 000 次重复，枝上数值仅显示自展支持率≥ 60%
2.4 ITS2序列二级结构比较
青天葵和遗传距离最近的毛叶芋兰 Helix Ⅱ，Ⅳ
相同 ；Helix Ⅰ，Ⅲ存在差异，毛叶芋兰在 Helix Ⅰ
基部、Helix Ⅲ近末端和近基部均较青天葵多出 1 或
2 个小茎环。而青天葵与其他混伪品茎环在数量、
大小与位置以及 4 个螺旋区之间的反转角度等方面
都明显的差异（图 3）。
3 讨论
前人对于青天葵及其混伪品的鉴别，主要是采
取性状鉴别、显微鉴别、粉末鉴别［12-14］等传统方
法，以及分子标记如 RAPD［15］等。传统鉴别方法的
鉴定标识在生物学上均为物种的遗传表现型，受到
植物的发育阶段、生长环境、加工炮制等因素的影
响，具有较大的变异性及可塑性，难免存在主观性
强、重复性和稳定性差等缺点。RAPD 等 DNA 分子
标记方法则是基于重复序列随机引物 PCR 扩增的鉴
别技术，虽然避免了传统方法的主观误差，但也存
在着对 DNA 质量要求高、需要综合十几甚至几十
条引物才能鉴定、PCR 体系稳定性差、PCR 产物无
法定性等不足。与其他方法相比，DNA 条形码具有
如下的优点 ：直接利用 DNA 序列进行物种的鉴定，
具有独一无二的重复性和准确性 ；在不同物种之间
具有可比性，具有通用性 ；只需一对引物进行鉴
别，简单快捷。本研究利用一对通用引物扩增青天
葵及其混伪品的条形码 ITS2 片段，寻找它们序列中
存在的差异位点，能快速准确地鉴别它们。获得的
ITS2 序列长度较短，也大大降低了 DNA 提取、PCR
扩增和测序的难度，有利于发生降解的药材样品的
序列获取。
刘心纯［16］认为可称毛叶芋兰为毛叶青天葵，
但在药材上不能将两者混合统称青天葵，至少要在
规格上区分。毛叶芋兰与青天葵极相似，性状上主
要区别为前者有毛，而后者无毛，但这一特征在加
工后药材干品中常难以确定。朱华等［17］利用两者
不同极性溶剂（石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和蒸馏
水）提取液在紫外吸收峰数目和位置上的差异进行
鉴别。本研究发现，青天葵与毛叶芋兰 ITS2 序列存
在 17 处碱基变异，二级结构 Helix Ⅰ、Ⅲ也存在茎
环数量的差异，说明两者在基因组上存在着鉴别依
据，这对有效地鉴别加工后的药材干品起到一定的
积极意义。
4 结论
利用 DNA 条形码技术分析青天葵及其混伪品的
ITS2 序列，发现序列中存在着丰富的鉴别位点。基
于 ITS2 序列构建的聚类树和二级结构均能直观地鉴
别青天葵及其混伪品。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第12期178
青天葵Nervilia Fordii (Hance) Schltr.（JX011630） 毛叶芋兰Nervilia plicat (Andr.) Schltr.（AF324179）
车前草Plantago asiatica L.（JQ916063）
积雪草Centella asiatiaca (L.) Urb.（GQ434698） 红薯Ipomoea batatas (L.) Poir（JQ916065） 犁头尖Typhonium diaricatum (L.) Dence（AY863058）
紫花地丁Viola yedoensis Makino(JF421554) 华细辛Asarum siboldii Miq.(FJ428641)
ĉ
Ċ
ċ
Č
图 3 青天葵及其混伪品 ITS2 二级结构比较
2012年第12期 179黄琼林等 ：基于条形码 ITS2 序列的青天葵及其混伪品分子鉴别
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（责任编辑 李楠）