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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第12期
收稿日期 ： 2014-09-22
基金项目 ：国家自然科学基金项目（31201938），武汉市科技局项目（2013020705070350-9，2013020705070350-14），武汉市农科院创新项
目（CX201309），武汉市农科院青年英才项目（YC201101）
作者简介 ：阮征，男，学士，高级兽医师，研究方向 ：动物疫病防控 ；E-mail ：paper2006@sina.cn
通讯作者 ：黄海军，男，博士，高级畜牧师，研究方向 ：动物生物技术与疫病防控 ；E-mail ：hygene@qq.com
PRRS 病毒主要受体蛋白 CD151 和 CD163 真核表达载
体的构建
阮征1，2  李杰1  刘开武2  王莲芳1  华娟1  胡小明3  刘杰1，3  黄海军1，4
（1. 武汉市畜牧兽医科学研究所，武汉 430208 ；2. 武汉市重大动物疫病防控中心，武汉 430023 ；3. 华中农业大学 猪遗传育种农业部重点
实验室 & 农业动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室，武汉 430070 ；4. 武汉市畜牧兽医局，武汉 430023）
摘 要 ： 为了进一步研究 PRRSV 与细胞受体之间的相互作用机理，通过基因工程方法从 PAM 细胞中克隆获得了 CD151 和
CD163 全长编码片段，利用 Sal I 和 Kpn I 内切酶对回收得到的 CD151（762 bp）和 CD163（3 333 bp）DNA 片段进行酶切，构建了
pIRES2-EGFP-CD151 和 pIRES2-EGFP-CD163 真核表达载体。经 PCR 和酶切鉴定后，分别提取重组质粒进行细胞转染。荧光显微
镜下可见单独转染 CD151 和 CD163 基因或 CD151/CD163 共转染的 Marc 145 细胞表达强烈的绿色荧光，Western blot 分析结果进一
步证实，CD151 和 CD163 蛋白在转染后的细胞中获得超表达。猪 CD151 和 CD163 真核表达载体的成功构建为进一步探索 CD151
和 CD163 在 PRRSV 感染细胞过程中的协同作用提供了物质基础，特别是对深入研究 PRRS 病毒的入侵及宿主识别具有重要意义。
关键词 ： 猪繁殖与呼吸综合征病毒 CD151 分子 CD163 分子 真核表达载体 细胞转染
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2014.12.032
Construction of Eukaryotic Expression Vector for the CD151 and
CD163 Receptor Proteins of Porcine Reproductive and Respiratory
Syndrome Virus
Ruan Zheng1，2 Li Jie1 Liu Kaiwu2 Wang Lianfang1 Hua Juan1 Hu Xiaoming3 Liu Jie1，3 Huang Haijun1，4
（1 .Wuhan Institute of Animal and Veterinary Science，Wuhan 430208 ；2. Wuhan Animal Disease Prevention and Control Center，Wuhan 430023 ；
3. Key Laboratory of Swine Breeding and Genetics，Ministry of Agriculture & Key Laboratory of Agricultural Animal Genetics，Breeding and
Reproduction（Huazhong Agricultural University），Ministry of Education，Wuhan 430070 ；4. Wuhan Bureau of Animal Husbandry and
Veterinary，Wuhan 430023）
Abstract: In order to study the interaction mechanism between the PRRSV and cell receptors, the CD151 and CD163 code fragments
were obtained from PAM cells by PCR. These PCR products were digested with Sal I and Kpn I, then inserted into pIRES2-EGFP vectors
separately to construct eukaryotic expression plasmid pIRES2 EGFP - CD151 or pIRES2 EGFP - CD163. These vectors were identified by the
methods of restriction enzyme digestion, PCR and sequencing. Marc 145 cells transfected with CD151 or CD163 or CD151/CD163 expressed
strong green fluorescence, which was further confirmed by western blot. The successful establishment of eukaryotic expression vectors of CD151
and CD163 provides the material foundation for the further exploring the synergistic effect of CD151 and CD163 in the process of PRRSV
infection, especially to the further study of PRRS virus invasion and the host identification.
Key words: Porcine reproductive and respiratory syndrome CD151 CD163 Eukaryotic expression vector Cell transfection
猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and
respiratory syndrome，PRRS）是猪群中流行的重要传
染病之一，病原为猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine
reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV），
2014年第12期 191阮征等：PRRS 病毒主要受体蛋白 CD151 和 CD163 真核表达载体的构建
可引起母猪的繁殖障碍（包括流产、早产、死胎、
木乃伊胎等）、仔猪成活率急剧下降和育成猪呼吸道
疾病［1-3］。PRRSV 有严格的宿主和细胞嗜性，需要
首先与细胞受体结合，通过内吞作用进人细胞内，
在胞内完成病毒的脱壳与基因组释放［4-6］。
目前发现的 PRRSV 感染相关受体有唾液酸黏
附素、硫酸乙酰肝素、CD163 分子、CD151 分子和
波形蛋白［8-11］。有关研究结果表明 PAM 细胞表面
存在唾液酸黏附素和硫酸乙酰肝素两种 PRRSV 相
关受体，在 PRRSV 感染巨噬细胞过程中主要起帮助
黏附、内化的作用［7］；而在 Marc-145 细胞中波形蛋
白起到 PRRSV 受体作用 ；CD151 能与 PRRSV 3 端
非转录区（3URT）发生结合，进而导致 PRRSV 与
细胞发生相互作用进入细胞内产生感染。通过转染
使 PRRSV 非敏感细胞 BHK-21 表达 CD151 会使该
细胞允许 PRRSV 的感染，增殖程度高达 100 倍［8］。
CD163 为 一 种 SRCR 超 家 族 的 Hapten Hemoglobin
清 道 夫 受 体， 是 130 000 的 细 胞 表 面 糖 蛋 白， 在
PRRSV 感染巨噬细胞过程中介导病毒在细胞质中的
脱衣壳和病毒基因组的释放［9-11］。
本研究通过构建猪 CD151 和 CD163 真核表达
载体，为进一步探索 CD151 和 CD163 在 PRRSV 感
染细胞过程中的协同作用提供了物质基础，特别是
对深入研究 PRRS 病毒的入侵及宿主识别具有重要
意义。
1 材料与方法
1.1 材料
大肠杆菌 DH5α 由华中农业大学猪遗传育种与
繁殖农业部重点实验室提供。猪肺泡巨噬细胞（PAM）
由华中农业大学动物科技学院胡小明博士惠赠。
限制性内切酶 EcoR I、BamH I、T4 DNA 连接酶、
Taq DNA 聚 合 酶、DNA marker、DNA Gel Extraction
Kit、Plasmid mini preps Kit 均购自华美生物工程公
司。 脂 质 体 2000 购 自 Invitrogen 公 司。pMD18-T
购 自 TaKaRa 公 司。 载 体 pIRES2-EGFP 购 自 BD
Biosciences Clontech 公司。
1.2 方法
1.2.1 引物设计与合成 根据 GenBank 报道的猪
CD151（NM_001243865.1）和 CD163（NM_213976.1）
基 因 序 列， 以 此 为 模 板， 利 用 primer premier 6 及
Oligo 6 软件进行引物设计（表 1）。引物由上海生物
工程公司合成。
表 1 猪 CD151 和 CD163 基因 cDNA 扩增的引物序列
引物名称 序列（5-3） 产物大小（bp）
CD151-F cgGTCGACATGGGCGAATTCGGCGAGAAG（+）
762
CD151-R cggGGTACCTCAGTAGTGCTCCAGCTTCAG（-）
CD163-F cgGTCGACATGGTGCTACTTGAAGACTCTG
3333
CD163-R cggGGTACCTCATTGTACTTCAGAGTGGTC
‘+’和‘-’分别表示扩增片段的上游和下游引物 ；斜体为保护性碱基 ；
下划线为限制性酶切位点
1.2.2 目的基因的 PCR 扩增 利用提取的猪 PAM
细 胞 总 RNA 反 转 录 为 cDNA 为 模 板， 表 1 中 的
CDS 全长引物进行 PCR 扩增。采用 KOD DNA 聚合
酶，PCR 反应体系为 50 μL 体系，其中包括 ddH2O
10 μL，dNTPs 8 μL（浓度为 10 mmol/L），2×Buffer
25 μL，cDNA 模板 4 μL，上下游引物分别添加 1 μL
KOD DNA 聚合酶 1 μL。PCR 反应程序 ：94℃预变
性 2 min ；98℃变性 10 s，退火 30 s，68℃延伸 40 s，
35 个循环。PCR 反应结束后，取 10 μL PCR 扩增产
物进行电泳，利用 G-BOX 凝胶成像系统观察结果。
1.2.3 目的片段的回收、酶切和纯化 按照 DNA 胶
回收试剂盒（Axygen，USA）说明书操作程序回收
目的 DNA。利用 Sal I 和 Kpn I 内切酶对回收得到
的 CD151（762 bp） 和 CD163（3 333 bp）DNA 片
段进行双酶切（20 μL 体系）：1.5T 3 μL，BSA 2 μL，
DNA 14 μL，Sal I 0.5 μL，Kpn I 0.5 μL。在 37℃恒温
箱中酶切 5 h 之后，再用 DNA 回收试剂盒进行纯化，
纯化得到的产物可用于下一步的连接。
1.2.4 载体酶切、回收和连接 利用 Sal I 和 Kpn I
内切酶对空载体 pIRES2-EGFP 进行双酶切，酶切体
系（20 μL）如下 ：体系 ：ddH2O 10 μL，1.5T 3 μL，
BSA 2 μL，DNA 4 μL（2 μg），Sal I 0.5 μL，Kpn I
0.5 μL。酶切之后，利用胶回收试剂盒对目的片段进
行回收。最后将得到的线性载体与目的基因 DNA 进
行连接（20 μL）：ddH2O 9 μL，buffer 2 μL，DNA 6 μL
（0.3 pmol），Vector 2 μL（0.03 pmol），T4 ligase 1 μL。
在 4℃连接反应过夜。
1.2.5 连接产物转化 DH5α 无菌条件下，在 100
μL 的感受态细胞中加入 10 μL 连接产物，混匀后冰
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第12期192
浴 30 min。然后 42℃水浴热击 90 s，迅速冰浴 1-2
min。每管加 400 μL LB 培养基，37℃复苏 60 min。
5 000 r/min 离心 6 min，弃上清 400 μL，剩余的涂
布至含 100 μg/mL Kan 的 LB 琼脂平板上，37℃培养
12-16 h 至单菌落出现。
1.2.6 PCR 检测阳性菌 挑取平板上的单菌落于
3 mL（ 含 100 μg/mL 的 Amp）LB 培 养 基 中，37℃
300 r/min 振摇培养过夜。取 1 μL 菌液作模板进行
PCR 检测。检测阳性后送武汉擎科测序公司进行测
序。测序结果与 GenBank 序列一致的菌液可以直接
扩大培养，提取去内毒素质粒。
1.2.7 超 纯 质 粒 提 取 采 用 Omega 公 司 Endo-free
Plasmid Mini Kit II 试剂盒提取质粒并将得到的质粒
进行双酶切，经琼脂糖凝胶电泳对酶切片段进行初
步验证。
1.2.8 细胞转染及 Western blot 分析 按照 Invitrogen
公司脂质体 2000 的使用说明书，将构建的重组质粒
pIRES2-EGFP-CD151、pIRES2-EGFP-CD163 转 染 到
6 孔板上处于对数生长期的 Marc 145 细胞，无双抗
培养基培养 48 h 后在荧光显微镜下观察荧光表达情
况，并收集细胞提取蛋白进行 Western blot 分析。
2 结果
2.1 CD151和CD163基因的PCR扩增
利 用 PCR 方 法 从 猪 PAM 细 胞 cDNA 中 扩 增
CD151 和 CD163 基因，电泳结果表明，扩增产物大
小 与 预 期 的 结 果 相 符，C151 为 762 bp，CD163 为
3 333 bp（图 1）。测序结果表明，克隆的 CD151 和
CD163 基因片段均含有该基因完整的编码区序列，
也包含信号肽序列。
2.2 pIRES2-EGFP-CD151和pIRES2-EGFP-CD163
重组质粒的鉴定
将构建的真核表达质粒用 Sal I 和 Kpn I 进行双
酶切，可以分别得到约 5.3 kb、762 bp 片段和 5.3 kb、
3 300 bp 片段（图 2），进一步证实了阳性重组质粒。
测序结果经 Blast 软件比对分析，上述结果与 NCBI
公布序列一致（含信号肽编码区），表明构建载体
成功。
2.3 细胞转染及Western blot分析结果
细胞转染 48 h 后在荧光显微镜下可以观察到明
亮的绿色荧光表达（图 3）。Western blot 结果（图 4）
表明，与对照组（未转染组）相比，稳定转染单一
受体蛋白或 CD151、CD163 共转染细胞中目的蛋白
表达水平均高于未转染细胞组，共转染组较单一转
染组同一目的蛋白表达水平略低。
3 讨论
PRRSV 侵染靶细胞的先决条件是实现与宿主细
胞的吸附，而宿主细胞表面的受体是完成这种吸附
过程必不可少的［12，13］。研究发现，CD151 分子无论
是在体外还是体内都能与 PRRSV 的 3 非编码区相
结合，猴抗 CD151 多克隆抗体可以完全阻断 PRRSV
对 MARC-145 细胞的感染［14］。同时，CD15l 分子在
PRRSV 易 感 细 胞（ 如 PAM、MARC-145、MA-104）
中广泛存在，而在 BHK、MDBK 等不敏感细胞中
不表达［14］，说明 CDl51 在 PRRSV 体外研究中扮演
着重要角色。大量研究表明，猪肺泡巨噬细胞上的
CD163 分子可以使 PRRSV 非允许细胞系 PK-15 获
得感染 PRRSV 并产生子代病毒粒子的能力。表明
1 M
762
bp bp bp bp
2000
1500
1000
750
500
250
100
2 M
762
10000
8000
6000
5000
4000
3000
2000
1000
M ：DL2000 marker ；1 ：CD151 的 PCR 扩增 ；2 ：CD163 的 PCR 扩增
图 1 目的基因 DNA 片段电泳结果
bp bp bp bp
1 32
762
4 5
6000 5300
3333
5300
4000
3000
6000
5000
1000
750
500
1 ：pIRES2-EGFP-CD151 经 Sal I 和 Kpn I 双酶切 ；2 ：DL2000 marker ；
3 ：DL 10K marker ；4 ：DL2000 marker ；5 ：pIRES2-EGFP-CD163 经 Sal
I 和 Kpn I 双酶切
图 2 重组质粒双酶切结果
2014年第12期 193阮征等：PRRS 病毒主要受体蛋白 CD151 和 CD163 真核表达载体的构建
CD163 分子不仅可以介导病毒的吸附，还可以介导
PRRSV 的复制产生子代病毒，是 PRRSV 感染 PAM
细胞必不可少的受体分子［15-17］。因此，本研究将
CD151 和 CD163 作为研究对象，进行真核表达载体
构建。
在构建载体的过程中采用 pIRES2-EGFP 双基
因表达载体，该载体带有的增强型绿色荧光蛋白
（Enhanced green fluorescent protein，EGFP） 编 码 基
因，是一种优化的突变型绿色荧光蛋白，其产生的
荧光较普通绿色荧光蛋白强 35 倍［18］，大大增强了
其报告基因的敏感度，且荧光强度及稳定性强，目
前得到广泛应用。pIRES2-EGFP 还含有 CMV 强启
动子和 SV40 poly A 加尾信号，前者可增强外源基
因的表达，后者可增强 mRNA 的稳定性及转录效
率。该载体还携带新霉素抗性基因，提供了 G418
筛选的标志，便于转染细胞的稳定筛选。本研究将
编码 CD151 和 CD163 的 cDNA 插入到表达荧光蛋白
的 pIRES2-EGFP 的多克隆位点处，通过转化、扩增
和单酶切、双酶切鉴定，成功地构建了含有 CD151
和 CD163 目 的 基 因 和 荧 光 蛋 白 报 告 基 因 的 质 粒
pIRES2-EGFP-CD151 和 pIRES2-EGFP-CD163。它的
应用可以使转染细胞同时表达目的蛋白和绿色荧光
蛋白，所以它不仅能导入外源性目的基因，而且可
利用荧光蛋白的表达对转染结果进行直观、及时地
观察和检测。
4 结论
本研究成功克隆了 PRRSV 感染细胞过程中的两
个重要的受体 CD151 和 CD163 的全长编码区域，包
含了起始密码子、终止密码子和信号肽。信号肽的
存在保证了表达产物正常分泌到胞外。在此基础上
构建的猪 CD151 和 CD163 基因真核表达载体经酶切
鉴定、序列分析完全正确，为进一步研究 PRRSV 两
个最重要的受体 CD163 和 CD151 在其感染过程中的
作用奠定了基础，有助于了解 PRRSV 侵入的过程，
揭示 PRRSV 感染靶细胞的分子机制。
参 考 文 献
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A A1
B B1
C C1
A，A1 ：脂质体∶质粒 =2∶1 ；B，B1 ：脂质体∶质粒 =1∶1 ；
C，C1 ：脂质体∶质粒 =1∶2
图 3 细胞转染
CD151
1 2 3 4
CD163
ACTIN
1 ：稳定转染 CD151 ；2 ：稳定转染 CD163 ；3 ：CD151/CD163 共转染 ；
4 ：未转染
图 4 Western blot 分析结果
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（责任编辑 李楠）