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研究报告

生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 8期
检测猪繁殖与呼吸综合征病毒 RT
PCR的建立及应用
赵朴  郑玉姝  贾贝贝  刘俊伟  陈金山  姚四新  赵坤
李任峰  王三虎  刘兴友  赵恒章
(河南科技学院动物科学学院,新乡 453003)
  摘  要:  根据 GenBank上 PRRSV的保守序列, 设计 1对引物 , 建立了 PRRSV的 RT
PCR方法。试验结果表明, 该
RT
PCR方法敏感、特异,适于临床样品检测,为 PRRSV的临床诊断和流行病学调查奠定了基础。
关键词:  猪繁殖与呼吸综合征病毒 RT
PCR 临床诊断 流行病学调查
Establishment of RT
PCR for Detection of Porcine Reproductive and
Respiratory Syndrome Virus and Its Application
Zhao Pu Zheng Yushu Jia Beibe i L iu Junw ei Chen Jinshan Yao Sixin
Zhao Kun L iRenfeng W ang Sanhu L iu X ingyou ZhaoH engzhang
(D epartment of Animal Science and T echnology, H enan Institute of Science and T echnology, X inxiang 453003)
  Abstrac:t  A ccording to the conserved sequence o f PRRSV published in GenBank, a pa ir of prim ers for am plification PRRSV
spec ified fragm ent was designed and a PCR assay for detec tion PCV
2 was estab lished. The results show ed that the PCR w as sensitiv e
and spec ific, and use fu l to de tect the c lin ic sam ples. It is the foundation fo r c linical d iagnosis and epidem io log ic survey of PRRSV.
Key words:  Porc ine reproductive and respiratory syndrom e v irus RT
PCR C lin ica l diagnosis Ep idem io log ic survey
收稿日期: 2010
03
17
作者简介:赵朴,讲师,硕士,研究方向:分子病毒学与免疫学; E
m ai:l zhpu2008@ 163. com
猪繁殖与呼吸综合征 ( porcine reproductive and
resp iratory syndrome, PRRS)由 PRRS病毒 ( PRRSV )
引起, 以母猪流产、死产和产木乃伊胎及新生仔猪和
保育猪呼吸困难为主要特征 [ 1]。在体内, PRRSV感
染主要位于肺和淋巴器官的巨噬细胞 [ 2] , 并破坏巨
噬细胞。通过引起病猪免疫抑制 [ 3] , PRRSV在病猪
体内造成持续性感染及其它病原体的继发感染,导
致母猪繁殖障碍和仔猪的呼吸困难和死亡, 给养猪
业造成重大经济损失。
目前, PRRS几乎遍布了所有养猪国家 [ 4
6] , 控
制 PRRS是维护养猪业健康发展的重要保障。
PRRS缺乏特征性的临床症状和病理变化, 以及继
发感染造成病情更加复杂化, 使得难于正确诊断
PRRS,而传统的实验室诊断方法如病毒分离、免疫
荧光法和免疫组化法, 不仅操作繁琐, 耗时费力,而
且敏感性较差,因此建立特异、敏感、快速诊断 PRRS
的方法对控制 PRRSV感染具有重要意义。PCR具有
良好的敏感性和特异性, 已应用于多种病原体的检
测。本研究利用 DNAstar比较出国内外美洲型
PRRSV毒株 ORF7的保守序列, 并以其作为参照序
列利用 O ligo6. 0设计 1对引物,建立检测 PRRSV的
RT
PCR方法,并验证该方法的敏感性和特异性, 以
期为猪群中 PRRSV感染的流行病学调查及诊断提
供切实可行的方法。
1 材料与方法
1. 1 材料
1. 1. 1 病料 猪肺采自新乡、焦作、鹤壁和安阳等
地猪场, 病猪主要表现为体温升高、消瘦、呼吸困
难等。
1. 1. 2 试剂和毒株 M
MLV反转录酶、RNA酶抑
制剂、Trizo l RNA提取试剂盒、Taq DNA 聚合酶、
dNTPs、DL2000 DNA M arker、pMD18
T载体及 DNA
2010年第 8期 赵朴等:检测猪繁殖与呼吸综合征病毒 RT
PCR的建立及应用
小量胶回收试剂盒购自 TaKaR a公司; 猪圆环病毒 2
型 ( porcine circov irus type 2, PCV
2)和 H3N2猪流感
病毒 ( sw ine influenza v irus, SIV )由本室分离鉴定和
保存, PRRSV为勃林格美洲型 PRRSV弱毒疫苗。
1. 1. 3 引物 根据 GenBank中国内外美洲型 PRRSV
毒株核苷酸的保守序列,利用 O ligo60设计 1对特异
性引物,产物长度为 275 bp,由上海生工生物技术服务
有限公司合成。上游引物 P1: 5
GGTCAGCCAGTC

TATGAC
3 , 下游引物 P2: 5
GTCAAACTAAACTCCA

CACTC
3 。
1. 2 方法
1. 2. 1 病毒 RNA的提取  用灭菌超纯水将 PRRSV
疫苗稀释至 105TC ID50 /mL,按 T rizo lRNA提取试剂盒
说明书提取稀释病毒液 RNA。
1. 2. 2 cDNA的制备 取 RNA悬液 3
L与 1
L
( 20 pmo l)O ligo( dT) 18混匀后置于 70! 水浴中5m in,
冰浴 10m in,再依次加入 5 ∀反转录酶缓冲液 4
L,
0. 1mo l/L DTT 2
L, 2. 5mol /L dNTPs 4
L, RNA酶
抑制剂 1
L( 20U ), M
MLV反转录酶 1
L( 10 U ),
DEPC水补足 20
L, 42! 水浴 1 h, 95! 作用 5m in灭
活反转录酶,直接用于 PCR或 4! 保存备用。
1. 2. 3 PCR扩增 10 ∀Taq DNA聚合酶缓冲液 2

L、cDNA 2
L, 2. 5 mmo l dNTPs 1
L, 10 pmo l上、
下游引物各 0. 2
L, Taq DNA聚合酶 0. 2
L后,灭
菌去离子水补足 20
L, 反应条件是 95! 3 m in,
94! 1 m in, 52! 1 m in, 72! 45 s, 35个循环, 最后
72! 延伸 10m in。取 5
L PCR产物在 1%琼脂糖
凝胶上电泳,检查扩增结果。
1. 2. 4 特异性试验 按参考文献 [ 7]制备 SIV cD

NA,以 1. 2. 3方法对 SIV和 PRRSV cDNA及 PCV
2
DNA进行 PCR扩增; 并用 DNA小量胶回收试剂盒
纯化约 275 bp的片段,与 pMD18
T载体连接, 转化
DH5感受态细胞, 涂布含 Amp、X
ga l和 IPTG的
LB平板, 37! 培养 14- 16 h,挑取单个白色菌落,培
养后小量碱裂解法制备质粒 DNA, PCR鉴定后, 送
上海生工生物技术服务有限公司进行序列测定,并
利用 NCBI BLAST对测序结果进行分析。
1. 2. 5 敏感性试验 将 105TC ID50 /mL的 PRRSV,
10倍比进行稀释 ( 10
1 - 10
5 ) , 并按上述方法提取
病毒 RNA、制备 cDNA、PCR扩增和电泳检测, 按阳
性反应条带模板的病毒最高稀释倍数,计算检测到
PRRSV的最低 TC ID50 /mL。
1. 2. 6 临床样品的检测 取 1. 1. 1中采集的猪肺,
匀浆, 用灭菌 PBS稀释 5倍, 反复冻融 3次, 4!
12 000 r/m in离心 10m in,收集上清液,并按上述方法提
取总 RNA、制备 cDNA和 PCR扩增,取 2
L cDNA作
为模版进行 PCR扩增,检测病料中是否含有 PRRSV。
2 结果
2. 1 PRRSV病毒液的 PCR扩增
利用 PRRSV保守序列设计引物, 提取稀释
PRRSVRNA,以 O ligo( dT ) 18为引物反转录后, 进行
PCR扩增, 产物经 1%琼脂糖凝胶电泳检测,扩增片
段约为 275 bp左右,与预期片段大小一致, 而 PK15
细胞阴性对照则没有扩增 (图 1)。
1. Marker DL2000; 2. PK15细胞阴性对照;
3.病毒液 RT
PCR产物
图 1 PRR SV的 RT
PCR结果
2. 2 特异性试验
以 PCV2 DNA和 PK15细胞、SIV及 PRRSV cD

NA为模板,进行 PCR扩增,产物经 1%琼脂糖凝胶
电泳检测。结果 (图 2)表明, 只有 PRRSV cDNA扩
增出约 275bp的目的片段, 而 PK15细胞、S IV及
PRRSV cDNA扩增结果均为阴性;将 PCR鉴定阳性
的重组质粒送上海生工生物技术服务有限公司测
序,并在 NCB IBLAST中分析测序结果,表明所测序
列与国内外多株 PRRSV基因的同源性#99% ,说明
所扩增基因片段为 PRRSV特异性的。
2. 3 敏感性试验
根据电泳检测结果 (图 3) , 可计算出该 RT

PCR方法最低能检测 2. 5 TC ID50 /mL的 PRRSV。
2. 4 临床样品检测
对疑似 PRRS病料匀浆、冻融、离心后取上清液
提取总 RNA, 反转录后取 2
L作为模版进行 PCR
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生物技术通报 B iotechnology  Bulletin 2010年第 8期
扩增, PCR产物电泳检测,部分病料的 RT
PCR结果
见图 4,疑似病料阳性率为 78% ( 106 /136)。
   1. M arker DL2000; 2. PK15 cDNA扩增产物; 3. PCV
2
扩增产物; 4. S IV cDNA扩增产物; 5. PRRSV cDNA
扩增产物
图 2 特异性试验结果
1.M arker DL2000; 2
610
1 - 10
5稀释病毒 RT
PCR产物
图 3 敏感性试验结果
1.M arker DL2000; 2
10.疑似病料 RT
PCR产物
图 4 临床疑似病料检测结果
3 讨论
PRRSV属于动脉炎病毒科动脉炎病毒属, 是有
囊膜的单股正链 RNA病毒 [ 1] , 通过调节和破坏感染
猪免疫系统 [ 2, 3] ,引起怀孕母猪后期发生流产、产死
胎和木乃伊胎;幼龄仔猪发生呼吸系统疾病和大量
死亡, 给养猪业造成重大经济损失。
准确、快速地诊断 PRRS是控制 PRRSV在猪群
中流行的重要环节,然而而传统的实验室诊断方法
如病毒分离、免疫荧光法和免疫组化法,不仅操作繁
琐, 耗时费力, 而且对于已经灭活、自溶的样品无能
为力。PCR技术检测的是样品中病原体核酸, 即使
对病原体灭活样品和自溶样品, 也具有良好的敏感
性和特异性, 已应用于多种病原体的检测。由于
PRRSV的基因多变性,引物的错配易导致假阴性结
果, 因此本研究首先选择 PRRSV美洲型毒株的保守
基因 ORF7[ 8] , 并通过 DNA star 比较出国内外
PRRSV ORF7的保守序列, 以其为参照序列设计引
物, 建立检测 PRRSV的 RT
PCR,敏感性、特异性和
临床样品检测结果表明,该方法具有较好的特异性,
能最低检测到 2. 5 TC ID50 /mL的 PRRSV,并可对临
床病料中的 PRRSV 进行检测, 为控制猪群中
PRRSV感染奠定了基础。利用该 RT
PCR方法, 对
采自新乡、焦作、鹤壁和安阳等地猪场, 表现为发热、
呼吸困难病猪的 136份病料进行了检测, 结果表明
PRRSV感染阳性率达 78% ,说明 PRRSV感染在呼
吸困难病猪中相当普遍,值得重视。
参 考 文 献
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