全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第9期
收稿日期 : 2012-03-27
基金项目 : 国家自然科学基金项目（31072158）, 贵州省农业攻关项目［黔科合 NY 字（2009）3071］, 贵州省农业科学院研究生科研创新基
金项目［黔农科合（创新基金）2011019］
作者简介 : 周思旋 , 女 , 硕士研究生 , 研究方向 : 动物微生物与分子生物学 ; E-mail: kerrybaiye@163.com
通讯作者 : 周碧君 , 女 , 教授 , 硕士生导师 , 研究方向 : 兽医微生物与传染病 ; E-mail: as.bjzhou@gzu.edu.cn
猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive
and respiratory syndrome virus，PRRSV）属于套式病
毒目，动脉炎病毒科，动脉炎病毒属，可引起妊娠
母猪早产、流产、死胎、木乃伊胎等繁殖障碍及各
种年龄猪呼吸系统疾病，仔猪高死亡率、感染猪出
现免疫抑制等。随着我国养猪规模、饲养方式、贸
易以及防制措施等方面的变化，PRRS 的发生和流行
也随之出现了一些新的特点，2006 年夏季以来，以
高热、高发病率和高死亡率为特征的高致病 PRRS
（HP-PRRSV）在我国大部分省市相继暴发和流行，
引起了社会各界的广泛关注。2007 年 PRRS 蔓延
至 26 个省份，发病猪数达 30 万头［1］，其致病力
大，感染力强，给我国养猪业造成了巨大的经济损
失［2-4］。PRRSV 为不分节段，聚腺苷酸化、有囊膜
的单股正链 RNA 病毒［5，6］。其基因组长度约为 15
kb，含有 8 个开放阅读框（ORFs）。其基因组顺序
依次为 ：5-ORF1a-ORF1b-ORF（2-6）-ORF7-3［7］。
ORF2-7 编码 6 种结构蛋白，ORF1（包括 ORF1a 和
猪繁殖与呼吸综合征病毒 JL株 Nsp10的表达及鉴定
周思旋1 徐健2 周碧君3 文明3 王开功3
（1 贵州省畜牧兽医研究所，贵阳 550005 ；2 贵州省贵阳市农业委员会，贵阳 550081 ；3 贵州大学动物科学学院，贵阳 550025）
摘 要： 为获得猪繁殖与呼吸综合征病毒 JL株非结构蛋白 Nsp10，以克隆质粒 pMD18-T-Nsp10/JL为模板，将 Nsp10基因克
隆至原核表达载体 pET-32a，转化至大肠杆菌 BL21（DE3）中诱导表达，对不同温度和 IPTG浓度进行优化，以获得 Nsp10蛋白表
达的最佳条件，采用 SDS-PAGE检测目的蛋白的表达情况，并通过Western blotting检测其免疫活性。结果表明，Nsp10基因成功克
隆至 pET-32a，有分子量约为 43.4 kD的融合蛋白获得表达，重组蛋白于诱导 4 h后达到高峰，IPTG浓度为 0.2-1.2 mmol/L时，重
组蛋白表达量无明显差异，Western blotting证实该表达蛋白具有反应原性。
关键词： 猪繁殖与呼吸综合征病毒 Nsp10 表达
Expression and Identification for Nsp10 of Porcine Reproductive and
Respiratory Syndrome Virus JL Strain
Zhou Sixuan1 Xu Jian2 Zhou Bijun3 Wen Ming3 Wang Kaigong3
（1Guizhou Institute of Animal and Veterinary Science，Guiyang 550005；2Guiyang Agricultural Committee，Guiyang 550081；3College of
Animal Science，Guizhou University，Guiyang 550025）
Abstract: In order to gain Nsp10 of PRRSV JL strain，the Nsp10 gene was obtained from pMD18-T-Nsp10/JL and inserted into pET-
32a vector，then transformed into Escherichia coli BL21 （DE3）. The expression condition，including temperature and IPTG concentration
were optimized. The expressed product was identified by SDS-PAGE and Western blotting. The result showed that Nsp10 gene was cloned into
pET-32a successfully. SDS-PAGE confirmed that the molecule weight of induced protein was about 43.4 kD. The expression level of recombinant
protein reached a peak after 4 h under IPTG induction and was no significant difference when the concentration of IPTG was 0.2 mmol/L to 1.2
mmol/L. The result displayed a positive reaction by Western blotting analysis.
Key words: Porcine reproductive and respiratory syndrome virus Nsp10 Expression
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第9期110
ORF1b）编码的聚合蛋白裂解产生 12 个非结构蛋
白（Nsp1-12）［8］。 其 中，Nsp10 蛋 白 是 由 ORF1b
所编码，Bautista 等［9］鉴定了 Nsp10 的生化特性，
证实其具有 NTP 酶和解旋双链 RNA 的活性。本研
究通过对 HP-PRRSV 贵州分离株 JL 毒株 Nsp10 进
行序列分析表明，Nsp10 蛋白具有较好的保守性和
良好的免疫原性［10］，因此可以作为诊断抗原来检
测 PRRSV。本试验通过构建重组表达载体 pET32a-
Nsp10，将其转化大肠杆菌 BL21 （DE3），并优化表达
时间和 IPTG 浓度，在最适条件下实现高效表达，后
经 His·Bind Purification Kit 纯化表达产物，旨在为
进一步研制新型基因工程疫苗和诊断试剂奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株与载体 大肠杆菌 DH5α、BL21（DE3）
均为本实验室保存 ；原核表达载体 pET-32a，购自
美国 Novagen 公司 ；pMD18-T-Nsp10/JL 重组质粒由
本研究构建完成。
1.1.2 工具酶及各种试剂 Gel Extraction Kit、质
粒提取试剂盒购自 OMEGA 公司 ；T4 DNA 连接酶、
限制性内切酶（BamH Ⅰ和 Hind Ⅲ）均购自 MBI
Fermentas 公司 ；IPTG 购自 Sigma 公司 ；PRRSV 阳
性血清由本实验室制备保存 ；羊抗猪 IgG-HRP 购自
北京索莱宝科技有限公司 ；蛋白质 Marker 购自北
京天根生物有限公司 ；蛋白纯化试剂盒（His·Bind
Purification Kit，型号 70239-3）购自美国 Novagen 公
司 ；DAB 显色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有
限公司 ；其他均为分析纯。
1.2 方法
1.2.1 Nsp10 基因的扩增 参考 GenBank 上的 PR-
RSV BJ-4 株全基因序列（AF331831），合成一对
Nsp10 基因特异性引物，其序列如下：Nsp10-1：5-T-
AAGGATCCAGGTTCATCATCGGCCCACC-3（下划线
为 BamH Ⅰ酶切位点），Nsp10-2 ：5-ATTAAGCTTC-
AGCTGCCTGTGTGGGTCAT-3（下划线为 Hind Ⅲ 酶
切位点），预期扩增片段大小为 717 bp，由宝生物工
程有限公司合成。
PCR 反应体系 50 μL，即 10×PCR Buffer 3 μL、
MgCl2（25 mmol/L）2.5 μL、dNTP（10 mmol/L）1
μL，Nsp10-1/Nsp10-2 引 物 各 2.5 μL、Taq 酶 1 μL、
cDNA适量、去离子水补足至50 μL；PCR扩增程序为：
94℃预变性 3 min ；94℃ 1 min，56℃ 30 s，72℃ 50 s，
30 个循环 ；最后 72℃延伸 5 min。
1.2.2 Nsp10 基因原核重组表达质粒的构建及鉴
定 采用限制性内切酶 BamHⅠ和 Hind Ⅲ对目的
基因片段和载体 pET-32a 进行双酶切，产物电泳回
收。将回收纯化的目的基因与载体 pET-32a 4℃连接
过夜，转化感受态细胞 BL21，涂布于含 Amp（50
mg/L）的 LB 琼脂平板上，37℃恒温培养 12-16 h，
挑取单个阳性菌落接种于含 Amp（50 mg/L）的 LB
液体培养基中，37℃ 180 r/min 振荡培养，小量提取
质粒，经 PCR 和 Hind Ⅲ /BamHⅠ双酶切鉴定后，
将阳性质粒送宝生物工程有限公司测序鉴定。
1.2.3 Nsp10 重组质粒的原核表达及条件优化 挑
取单个阳性重组菌落接种于含 Amp（50 mg/L）的
LB 液体培养基中，37℃振荡培养过夜后，按 1 100
的比例稀释到 Amp/LB 液体培养基中，37℃振荡
培养至细菌对数生长期，加入 IPTG 至终浓度为
1 mmol/L，30℃诱导表达，并分别在诱导前、诱导后 2、
3、4、5、6 和 7 h 收集菌液，4℃ 12 000 r/min 离心
10 min，收集沉淀，溶于 2×上样缓冲液，煮沸 5-10
min，离心取上清用 SDS-PAGE 电泳进行表达产物的
检测，同时设空载体和 BL21 细胞对照。另外，将
重组菌种子液按 1 100 的比例稀释到 Amp/LB 液体
培养基中，37℃振荡培养至细菌对数生长期，分别
向 8 个试管中加入 IPTG 至终浓度为 0、0.2、0.4、0.6、
0.8、1.0 和 1.2 mmol/L，继续诱导 4 h，同上，收集
菌体沉淀，检测表达产物。
1.2.4 重组蛋白 Nsp10 的可溶性分析 按最佳条件
诱导重组菌，将诱导后的菌液经 12 000 r/min 离心
10 min，弃上清收集菌体，加入 1×Binding Buffer 重
悬菌体，经超声波裂解后离心，分别取上清和沉淀
加等量的上样缓冲液进行 SDS-PAGE 电泳，以确定
表达蛋白主要以可溶性形式还是以包涵体形式存在。
1.2.5 包涵体的洗涤及溶解 将超声波裂解后离心
的菌体沉淀再用 1×Binding Buffer 重悬，然后再用
超声波处理，离心取沉淀，重复处理利于获得更纯
的蛋白，最终用适量含 6 mol/L 尿素的 1×Binding
Buffer 悬浮沉淀，于冰上作用 1 h 以上，使包涵体彻
2012年第9期 111周思旋等 ：猪繁殖与呼吸综合征病毒 JL 株 Nsp10 的表达及鉴定
底溶解，16 000 r/min 离心 30 min，取上清和沉淀进
行 SDS-PAGE 电泳，确定包涵体的溶解情况，溶解
完全的上清经 0.45 μm 孔径的滤膜过滤备用。
1.2.6 重组蛋白 Nsp10 的纯化及复性 将过滤后的
蛋白应用 His·Bind Purification Kit 进行纯化，方法
按照说明书进行。取少量纯化后的蛋白进行 SDS-
PAGE 分析。纯化后的蛋白经梯度透析法进行除盐
复性，将纯化产物装入已处理好的透析袋内，置于
复性缓冲液中，于 4℃用磁力搅拌器进行梯度透析，
复性缓冲液中尿素浓度依次递减为 4、2 和 0 mol/L，
换液间隔时间 10-12 h。
1.2.7 重组蛋白 Nsp10 的 Western blotting 分析 表
达的重组蛋白进行SDS-PAGE后，将目的蛋白于4℃，
30 V 的条件下转印至 PVDF 膜，然后将膜放入印迹
袋中，3% 的 BSA/PBST 封闭 3 h，经 PBST 充分洗涤
后将膜与猪源 PRRSV 阳性血清（按一定的比例稀
释）于 37℃湿盒中孵育 3 h，PBST 洗涤后加入羊抗
猪 IgG-HRP 反应 4 h，最后用 DAB 显色试剂盒对转
印膜显色，出色明显条带后用蒸馏水终止显色反应，
分析结果。
2 结果
2.1 重组表达质粒的鉴定
将目的基因与表达载体 pET-32a 连接，构建
成重组表达质粒 pET-32a/Nsp10，经转化 BL21，提
取重组表达质粒，以重组表达质粒为模板，使用
Nsp10-1/Nsp10-2 引物 PCR 和双酶切鉴定，结果见图
1 和图 2。
2.2 表达产物SDS-PAGE分析
分别在诱导前和诱导后不同时间取样，用 12%
的聚丙烯凝胶进行 SDS-PAGE 电泳分析。结果（图
3）显示，重组蛋白于诱导后 4 h 后达到高峰，之后
无明显变化。另外，在 IPTG 诱导浓度分别为 0、0.4、
0.6、0.8、1.0 和 1.2 mmol/L，检测表达产物，以确
定 IPTG 最佳诱导浓度。结果（图 4）表明，IPTG
浓度为 0 mmol/L 时，几乎无特异性重组蛋白表达，
而 IPTG 浓度为 0.2-1.2 mmol/L 时，重组蛋白表达量
变化较小，因此选择 0.2 mmol/L 为表达浓度。
M. DL2000 DNA Marker；1.阴性对照；2-5. pET-32a/Nsp10
图 1 重组质粒 PCR鉴定
图 2　重组质粒酶切鉴定
M. DL2000 DNA Marker ；1,2. 经 BamHⅠ和 Hind Ⅲ双酶切产物 ；3. 阴性对照
M.低分子量蛋白质 Marker；1-7.分别经 0、2、3、4、5、6、
7 h表达产物；8. BL21(DE3)；9. BL21/pET-32a
图 3 Nsp10蛋白表达时间优化结果
2.3 重组蛋白可溶性分析结果
根据得到的最优表达条件对重组菌进行大量的
诱导表达，超声波裂解离心后分别取上清和沉淀进
行 SDS-PAGE 分析，检测目的蛋白的可溶性。结果
显示，融合表达产物在上清中几乎没有，主要以包
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第9期112
涵体的形式存在于沉淀中。
2.4 包涵体溶解情况
包涵体经含 6 mol/L 尿素的 1×Binding Buffer 溶
解 1 h 以上，16 000 r/min 离心 30 min 后沉淀很少，
说明包涵体被溶解后目的蛋白主要存在于上清中。
2.5 目的蛋白纯化结果分析
将包涵体溶解后用 His·Bind Purification Kit 中
含 Ni2 ＋的 His Bind Resin 与溶解的重组蛋白充分结
合纯化，经多次洗涤后用含 6 mol/L 尿素的 Elute
Buffer 洗脱，取洗脱液进行 SDS-PAGE 分析。结果
（图 5）显示，经 Elute Buffer 洗脱后，除去了大部分
杂蛋白，得到了较纯的目的蛋白。
2.6 重组蛋白的Western blotting鉴定
将表达的重组蛋白转移至 PVDF 膜上，与
PRRSV 阳性血清反应后，在约 43.4 kD 处出现一条
明显的特异性反应条带，结果（图 6）表明，表达
的重组蛋白可以被 PRRSV 阳性血清所识别。
M. 低分子量蛋白质 Marker；1-7. IPTG 浓度分别为 0、0.2、0.4、0.6、0.8、
1.0 和 1.2 mmol/L 诱导表达产物 ；8. BL21/pET-32a ；9. BL21(DE3)
图 4 Nsp10蛋白表达 IPTG剂量优化结果
M. 低分子量蛋白质 Marker ；1. 经纯化的 Nsp10 蛋白 ；2. 未经纯化的
表达产物 ；3. 阴性对照 ；4. BL21 对照
图 5 Nsp10蛋白的纯化结果
图 6 Nsp10蛋白的Western blotting分析
M. 低分子量蛋白质 Marker ；1. BL21/pET32a-Nsp10 ；
2. BL21/pET-32a ；3. BL21
3 讨论
本试验采用目前遗传背景清楚的大肠杆菌表达
系统及带有 His 标签的高效表达载体 pET-32a，将
猪繁殖与呼吸综合征病毒 JL 株 Nsp10 基因克隆至原
核表达载体 pET-32a 中，成功构建了 pET-32a/Nsp10
重组表达质粒，并将其转入大肠杆菌 BL21 中诱导
表达。SDS-PAGE 分析结果表明，重组蛋白大小约
43.4 kD，于诱导后 4 h 后达到高峰，IPTG 浓度为
0.2-1.2 mmol/L 时，重组蛋白表达量无明显变化，由
于 IPTG 毒性可能影响细胞生长，也容易造成包涵体
的形成［11］，因此选择最低浓度 0.2 mmol/L 作为最佳
诱导浓度。Western blotting 分析结果显示，该蛋白
能与阳性血清反应，表明其具有良好的免疫学活性，
可作为抗原用于临床血清学诊断，同时 Nsp10 蛋白
还可作为区分灭活疫苗免疫猪群和隐性感染猪群鉴
别诊断抗原。
大肠杆菌中表达的外源蛋白一般以不溶的包涵
体形式存在，包涵体的形成有利有弊，弊端在于大
量的蛋白虽然得到表达，但不具有生物学活性 ；优
越性在于不仅可获得高表达、高纯度的重组蛋白质，
还可避免细胞水解酶对重组蛋白质的破坏［12］。本试
2012年第9期 113周思旋等 ：猪繁殖与呼吸综合征病毒 JL 株 Nsp10 的表达及鉴定
验尝试多种方法以期蛋白质正确折叠获得可溶性表
达，但最终未成功。由于目的蛋白多以包涵体形式
存在，而蛋白的纯化需在变性情况下进行，因此通
过尿素对蛋白进行变性。纯化后的蛋白采用尿素梯
度法进行透析复性，将变性剂的浓度逐步降低，在
中间变性剂浓度时放 10-12 h，以促进蛋白质分子内
部的疏水区域充分地相互作用，避免平衡向聚合沉
淀方向移动，提高了复性率。虽然有些蛋白不经复
性也具有反应活性，研究表明包涵体蛋白经复性后
其活性比复性前更高［13］。利用载体上携带的 His 标
签，通过 His·Bind Purification Kit 对表达蛋白进行
纯化，结果表明，该纯化系统成功纯化了 Nsp10 蛋白，
基本去除了其他杂蛋白，从表达产量及纯化后的纯
度来看，完全可以满足后期建立诊断方法的需求，
也为本病的免疫及 PRRSV 的血清学诊断（如 ELISA
方法等）提供了抗原基础该蛋白，且可以区分灭活
苗免疫和隐性感染猪群，从而为猪繁殖与呼吸综征
的免疫防控奠定理论基础。
4 结论
本研究成功构建了表达质粒 pET-32a/Nsp10，
将此重组转入大肠杆菌 BL21 并对其表达情况进行
检测，SDS-PAGE 和 Western blotting 分析结果表明
该质粒获得成功表达，且蛋白得到较好的纯化。
参 考 文 献
［1］ 高诗敏 , 王敏功 , 邓瑞林 , 等 . 猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株
实时荧光定量 RT-PCR 检测方法的建立 . 中国兽医科学 , 2011,
41（3）：267-272.
［2］ 童光志 , 周艳君 , 郝晓芳 , 等 . 高致病性猪繁殖与呼吸综合征
病毒的分离鉴定及其分子流行病学分析 . 中国预防兽医学报 ,
2007, 29（5）：323-327.
［3］ Li Y, Wang X, Bo K, et al. Emergence of a highly pathogenic porcine
reproductive and respiratory syndrome virus in the Mid-Eastern
region of China. Vet J, 2007, 174（3）：577-584.
［4］ Zhou YJ, Hao XF, Tian ZJ, et al. Highly virulent porcine reproductive
and respiratory syndrome virus emerged in China. Transbound Emerg
Dis, 2008, 55（3-4）：152-164.
［5］ Cavanaugh D. Nidovirales ：a new order comprising Coronaviridae
and Arteriviridae. Arch Virol, 1997, 142（3）：629-633.
［6］ de Vries AAF, Horzinek MC, Rottie PJM, et al. The genome
organization of the nidovirales ：similarities and difference between
Arteri-, Toro-, and corona viruses. Semin Virol, 1997, 8（1）：
33-47.
［7］ 张永富 , 韩春华 , 林健 , 等 . 猪繁殖与呼吸综合征病毒 ORF7 基
因的表达和重组蛋白的纯化及免疫学活性分析.安徽农业科学,
2009, 37（10）：4439-4442, 4445.
［8］ Fang Y, Kim DY, Ropp S, et al. Heterogeneity in Nsp2 of European-
like porcine reproductive and respiratory syndrome viruses isolated
in the United States. Virus Res, 2004, 100（2）：229-235.
［9］ Bautista EM, Faaberg KS, Mickelson D, et al. Functional properties
of the predicted helicase of porcine reproductive and respiratory
syndrome virus. Virology, 2002, 298（2）：258-270.
［10］ 周思旋 , 周碧君 , 隆华 , 等 . 猪繁殖与呼吸综合征病毒 Nsp10
基因的克隆及序列分析 . 黑龙江畜牧兽医 , 2009（10）：10-13.
［11］ 李向茸 , 冯若飞 , 凡静静 , 等 . 脑心肌炎病毒 VP1 结构蛋白的
可溶性表达及鉴定 . 中国兽医科学 , 2011, 41（6）：557-561.
［12］ 陆长梅 , 李继影 , 陈阳 , 袁生 . Xyn 包涵体的纯化与变复性研
究 . 南京师大学报 ：自然科学版 , 2004, 27（4）：67-71.
［13］ 金喜新 . 猪细小病毒 NS1 与 VP2 基因表达重组蛋白 ELISA 方
法的建立［D］ . 郑州 ：河南农业大学 , 2005.
（责任编辑 马鑫）