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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第8期
2，3-丁二醇是一 种重要的化工原料，广泛用于
食品、化妆品、药物、塑料、卫生保健和能源等领
域［1］。2，3-丁二醇脱水形成的甲乙酮是有效的燃料
添加剂，并且其自身具有极高的燃烧值（27 198 J/g），
优于甲醇（22 081 J/g）和乙醇（29 005 J/g），因此
有望成为新能源的替代品［2，3］，但其化学合成工艺
繁琐、污染严重，不符合绿色化工和低碳环保的要求。
微生物法生产 2，3-丁二醇是一种新型工业发展模式，
收稿日期 ：2014-01-23
作者简介 ：郭文逸，女，硕士研究生，研究方向 ：工业微生物育种 ；E-mail: guowenyi000@163.com
通讯作者 ：杨洪江，男，博士，教授，研究方向 ：工业微生物育种 ；E-mail: hongjiangyang@tust.edu.cn
地衣芽孢杆菌高产 2，3-丁二醇菌株的选育和发酵研究
郭文逸 孙庆惠 宋丽娜 高松松 杨洪江
（天津科技大学生物工程学院 工业微生物教育部重点实验室 天津市工业微生物重点实验室，天津 300457）
摘 要 ： 目前 2，3-丁二醇生产菌株大部分为致病菌，对人类健康和环境具有一定威胁。从牛奶样品中分离到 1 株产 2，3-丁
二醇的芽孢杆菌 127-7，分析其 16S rRNA 基因序列，确定该菌株为地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）。进一步对菌株 127-7 进
行紫外诱变，筛选耐受高浓度葡萄糖和高产乙偶姻的菌株。摇瓶发酵结果显示，突变株 BL41 的 2，3-丁二醇产量较出发菌株 127-7
提高了 41.1%。对发酵副产物分析发现，不控制发酵液 pH 可以显著降低乳酸产量，2，3-丁二醇产量在 72 h 达到 81.4 g/L。进一步
调整补糖策略，维持最低残糖浓度为 30 g/L，菌株 BL41 产 2，3-丁二醇 83.4 g/L，最高产率为 1.9 g/L·h，发酵时间缩短至 46 h。结
果表明，地衣芽胞杆菌 BL41 可以作为候选菌株，用于工业规模 2，3-丁二醇的生产。
关键词 ： 地衣芽孢杆菌 2，3-丁二醇 紫外诱变 耐受葡萄糖
Breeding and Fermentation Characterization of Mutants of Bacillus
licheniformis for 2，3-Butanediol Production
Guo Wenyi Sun Qinghui Song Lina Gao Songsong Yang Hongjiang
（Key Laboratory of Industrial Microbiology，Ministry of Education，College of Biotechnology，Tianjin University of Science &
Technology，Tianjin 300457）
Abstract: Currently, most isolated 2,3-butanediol producing strains are pathogens and they cause certain risks to public health and
environments. In this work, Bacillus sp. 127-7 was isolated for 2,3-butanediol（BD）production from raw milk samples. It was identified as
Bacillus licheniformis by analyzing its 16S rRNA gene sequence. By UV-mutagenesis, mutants that could endure high glucose concentrations
and produce relatively high amounts of acetoin were isolated for further analysis. In shake-flask fermentations, 2,3-BD production was
increased by 41.1% in mutant strain BL41 compared with the parent strain 127-7. Additionally, BL41 yielded much less amounts of lactate
acid in the cultures without acidity control and 2,3-BD reached 81.4 g/L in the fed-batch fermentation. Moreover, the minimal residual glucose
concentration was incre ased to 30 g/L in the culture, the fermentation time was significantly reduced to 46 h with 83.4 g/L 2,3-BD. The highest
productivity is up to 1.9 g/L·h. The results showed that B. licheniformis BL41 may be used as a candidate strain for industrial production of
2,3-butanediol.
Key words: Bacillus licheniformis 2，3-butanediol UV-mutagenesis Glucose tolerance
对缓解我国目前的资源、能源及环境危机具有重要
作用［4，5］。
目前，常见的生产 2，3-丁二醇的菌种为肺炎克
雷 伯 氏 菌（Klebsiella pneumoniae）， 产 酸 克 雷 伯 氏
菌（Klebsiella oxytoca）， 产 气 肠 杆 菌（Enterobacter
aerogenes）， 粘 质 沙 雷 氏 菌（Serratia marcescens），
阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae），地衣芽孢杆菌
（Bacillus licheniformis）， 解 淀 粉 芽 孢 杆 菌（Bacillus
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第8期160
amyloliquefaciens），多粘类芽孢杆菌（Bacillus poly-
myxa）等［3］。其中以产酸克雷伯氏菌的研究较多，
然而其为致病菌，对环境安全构成一定威胁［5］。
本研究首先分离产 2，3-丁二醇的芽孢杆菌，然
后进行紫外诱变，筛选到一株高产 2，3-丁二醇的突
变株，并进行发酵条件的优化，旨在进一步提高微
生物法生产 2，3-丁二醇的水平，筛选到更适于工业
化生产的菌株。
1 材料与方法
1.1 材料
LB 培养基（g/L）：酵母粉 5，蛋白胨 10，氯化
钠 10，pH7.0。肌酸筛选培养基（g/L）：底层包括葡
萄糖 10，蛋白胨 10，玉米浆 5，硫酸锰 0.05，丙酮
酸钠 5，氯化钠 5，琼脂 20 ；上层培养基在底层培
养基的基础上补加 0.5%（W/V）的肌酸 3 mL 和 7.5%
（W/V）的甲萘酚 3 mL，肌酸和甲萘酚在培养基灭
菌后冷却至 50℃左右时加入，用于筛选产乙偶姻菌
株。葡萄糖筛选培养基（g/L）：酵母粉 5，蛋白胨
10，氯化钠 10，琼脂 1.5，葡萄糖分别为 170、180、
190、200、210、220、230、240 和 250，pH7.0， 用
于筛选耐高糖菌株。MR-VP 培养基（g/L）：蛋白胨
7，葡萄糖 5，磷酸氢二钾 5，pH7.0，用于紫外诱变
后，筛选高产乙偶姻菌株。种子培养基（g/L）：葡
萄糖 40，酵母粉 10，硫酸铵 1，K2HPO4 1，pH7.0。
发酵培养基（g/L）：葡萄糖 100，酵母粉 5，蛋白胨
12，MnSO4 0.025，K2HPO4 3，硫酸镁 0.2，乙酸钠 5，
pH7.0。除特殊说明，所有培养均在 37℃条件下进行。
1.2 方法
1.2.1 产 2，3-丁二醇芽孢杆菌的筛选 将牛奶样品
80℃保温 20 min，系列稀释后涂布在 LB 平板上，分
离芽孢杆菌。将分离的单菌落点接在肌酸筛选平板
的下层培养基上，培养 48 h 后，倒入上层培养基，
约 30 min 后观察菌落颜色［6，7］。用接种针小心剥去
上层培养基，挑选红色较深的菌落［8］，发酵培养 72 h，
利用气相色谱法，分析上清液中 2，3-丁二醇含量。
1.2.2 分 离 菌 株 的 分 子 鉴 定 提 取 菌 株 基 因 组
DNA［9］， 以 此 作 为 模 板， 利 用 通 用 引 物 27F 和
1492R， 扩 增 分 离 菌 株 的 16S rRNA 基 因 片 段［10］。
PCR 产物经纯化后进行序列测定，将所得 DNA 序列
通过 BLAST 检索，在 GenBank 的已知序列中进行同
源性分析，确定与分离菌株同源程度最高的序列。
1.2.3 紫外诱变筛选高产 2，3-丁二醇菌株 过夜培
养分离菌株，菌液稀释后分别涂布在葡萄糖浓度为
0-250 g/L 的 LB 平板上，各浓度 3 个平行，确定分
离菌株葡萄糖耐受浓度。将分离菌株进行紫外诱变，
诱变后菌液稀释涂布于葡萄糖筛选平板上，黑布包
裹培养 24 h。选取直径较大的菌株接种到 MR-VP 培
养基中，分别取 18 h 和 36 h 的发酵液，通过肌酸比
色法计算乙偶姻产量［11］。筛选乙偶姻产量高的菌株
进行发酵培养，利用气相色谱法测定 48 h 和 72 h 发
酵液中 2，3-丁二醇产量，筛选 2，3-丁二醇高产菌株。
1.2.4 pH 对 2，3-丁二醇产量的影响 调节培养基
酸碱度，分析发酵液 pH 与乳酸产量的关系。根据
酸碱度，将培养基分为 3 组 ：第 1 组发酵液初始 pH
值为 7.0，发酵过程中不控制 pH 值 ；第 2 组发酵液
pH 值维持在 6.0 ；第 3 组发酵液 pH 值维持在 7.0，
发酵过程中每隔 3 h，利用盐酸或氢氧化钠，调节发
酵液的 pH 不变。试验在摇瓶中进行，两级种子培
养后，转接于 30 mL 发酵培养基，150 r/min 培养 30 h。
根据上述试验结果，在 5 L 发酵罐中进行分批
补料发酵，装液量为 3 L，接种量为 5%，通气量为
2 vvm。高搅拌转速利于细胞的生长，然而 2，3-丁二
醇发酵是微好氧过程，不利于 2，3-丁二醇的积累［12］，
因此采用两步搅拌转速法，前期为 400 r/min，14 h
后降低转速，为 200 r/min［13］。通过补加一定量的葡
萄糖，使残糖浓度维持在 15 g/L 左右。
1.2.5 残糖浓度对 2，3-丁二醇发酵的影响 底物浓
度对发酵过程具有显著影响，提高发酵液中残糖水
平，维持葡萄糖浓度为 20-30 g/L 时，可能有利于生
成 2，3-丁二醇［14］。为了确认这一猜测，在 5 L 发酵
罐上进行分批补料发酵，其它条件不变，残糖浓度
维持在 30 g/L，分析 2，3-丁二醇发酵水平的变化。
1.2.6 分析检测方法 使用紫外分光光度计测定
OD600。将发酵液过滤后稀释 100 倍，采用生物传
感分析仪 SBA-40C 测定葡萄糖、乳酸浓度。采用
Aglient 7890A 气相色谱仪检测 2，3-丁二醇浓度，其
中 柱 子 型 号 ：HP-INNOWax1909IN-213， 色 谱 条
件 ：起始柱温 95℃保留 2 min ；然后以 6℃/min 升到
150℃，保留 0 min ；最后 100℃/min 升到 220℃，保
2014年第8期 161郭文逸等 ：地衣芽孢杆菌高产 2，3-丁二醇菌株的选育和发酵研究
留 2 min；氮气、氢气和空气流速分别是 2、30 和 300
mL/min。进样口和氢气火焰检测器的温度是 260℃。
2 结果
2.1 产2,3-丁二醇的菌株筛选及鉴定
将 LB 平板上形成的菌落点接在肌酸平板上进
行分析，12 个菌落红色较深。将其发酵 48 h，测
量 2，3-BD 产量。结果（表 1）显示，菌株 127-7 产
2，3-丁二醇水平较高，为 48.2 g/L。利用 PCR 方法
扩增该菌株 16S rRNA 基因，测序后利用 NCBI 网站
的 BLAST 软件进行比对，发现菌株 127-7 与多株 B.
licheniformis 菌株高度同源，达到 99%-100%，因此
确定菌株 127-7 为地衣芽胞杆菌。将 16S rRNA 序列
上传至 GenBank，获得序列号为 KF935264。
表 1 分离菌株的 2，3-丁二醇产量
菌株 2，3-丁二醇（g/L） 菌株 2，3-丁二醇（g/L）
2-10 24.2 214 21.0
28-1 2.3 1014 9.2
85-2 12.1 1015 47.7
92-4 21.9 912 26.2
36-s 1.7 913 17.7
127-7 48.2 516 15.9
2.2 紫外诱变筛选高产2,3-丁二醇菌株
出发菌株 127-7 在葡萄糖浓度为 250 g/L 的 LB
平板上无菌落长出，此浓度作为筛选葡萄糖耐受菌
株的条件。绘制菌株 127-7 的紫外致死曲线，紫外
诱变时间为 30 s，致死率达到 87.1%。采用该条件，
对菌株 127-7 进行诱变，涂布在含有 250 g/L 葡萄糖
的筛选平板上，共得到 2 406 株突变子。
挑选菌落直径较大（>1.5 mm）的突变子 105
株，进行肌酸比色试验，分别取发酵 18 h 和 36 h 的
发酵液进行测定，分析乙偶姻含量。选取 10 株乙偶
姻含量高的菌株，进一步分析 2，3-丁二醇的产量。
48 h 发酵结果（图 1）显示，突变子 BL41、BL18、
BL16、BL37、BL35 和 BL21，它们 2，3-丁二醇产量
均高于出发菌株 127-7，占所挑选菌株的 60.0%。其
中，BL41 的 2，3-丁二醇产量比出发菌株高 41.1%，
转化率达到理论值的 60.5%。
2.3 pH对2,3-丁二醇产量的影响
乳酸是 2，3-丁二醇发酵过程中主要的副产物，
127-7* BL16 BL17 BL18 BL21 BL35 BL37 BL41 BL62 BL94 BL105
0
20
402
,3
-бҼ䞷ሩӗ䟿 % 6080100120140
以菌株 127-7 产 2，3-丁二醇产量设定为 100%
图 1 高产 2，3-丁二醇突变株筛选
为了分析培养基酸碱度与菌株 BL41 产乳酸水平的
关系，进行了摇瓶试验。结果（表 2）显示，将发
酵过程 pH 始终控制在 7.0 时，生成大量乳酸（21.0
g/L）；pH 始终在 6.0 时，乳酸产量则显著减少，30
h 后仅为 0 g/L ；培养基初始 pH 为 7.0，发酵过程中
不控制酸碱度，随着发酵的进行，pH 不断下降，乳
酸产量最终也为 0 g/L。
表 2 pH 对副产物乳酸的影响
时间（h）
乳酸（g/L）
A1） B2） C3）
6 5.0 1.0 1.0
9 8.0 1.0 2.0
12 13.0 3.0 3.0
24 21.0 3.0 0
30 21.0 0 0
1 ：发酵过程中控制 pH7.0 ；2 ：发酵过程中控制 pH6.0 ；3 ：初始 pH7.0，
发酵过程中不控制酸碱度
所以在分批补料发酵中，选择发酵液初始 pH
值为 7.0，发酵过程中不控制酸碱度这一条件。结果
（图 2）显示，72 h 仅得到 3 g/L 的乳酸，2，3-丁二醇
的产量则达到 81.4 g/L。
2.4 残糖浓度对2,3-丁二醇产量的影响
葡萄糖浓度对 2，3-丁二醇发酵具有一定的影响。
图 2 显示，在葡萄糖浓度为 30 g/L 时 2，3-丁二醇产
率最高，为 1.9 g/L·h，而随着葡萄糖浓度降低，产
率也随之下降，推测发酵液中较低的葡萄糖浓度导
致葡萄糖利用缓慢，产率下降，周期延长。为了验
证这一假设，我们在分批补料发酵中，将残糖浓度
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第8期162
氏菌和粘质沙雷氏菌［17］。因此，努力提高芽孢杆菌
生产 2，3-丁二醇产量具有重要意义。
近年来，对 2，3-丁二醇发酵菌种的选育，主要
围绕着菌种的诱变筛选和基因工程的改造等［18］。本
研究使用紫外诱变育种，是菌种选育研究中最常采
用的方法，该方法操作简便，并且安全［19］。有研究
表明提高菌株的耐糖性不仅可以提高 2，3-丁二醇产
量，还可以缩短发酵时间［20］。所以紫外诱变后，首
先进行耐高糖菌株的筛选。乙偶姻是 2，3-丁二醇的
前体物质，通过筛选乙偶姻高产菌株，进而得到 2，3-
丁二醇高产菌株，而采用肌酸比色法分离筛选高产
乙偶姻的菌株，大大减少了筛选的工作量。由此获
得突变株 BL41，通过摇瓶试验，2，3-丁二醇产量较
出发菌株 127-7 提高了 41.1%。
发酵过程中 pH 是代谢活动的综合指标，是发
酵过程中重要控制参数［21］，在混和酸发酵过程中，
pH 对发酵产物组成的影响尤其显著，直接影响碳源
的代谢流向。碱性条件下，发酵有利于有机酸的形成，
从而导致 2，3-丁二醇合成量的减少。而酸性条件下，
2，3-丁二醇的合成量较碱性条件下有明显上升，有
机酸量则明显下降［22］。不同研究中，对培养基及发
酵过程中的 pH 值采取了不同控制策略，可能会对
2,3-丁二醇的产量产生影响［13，14］。而乳酸在 pH 为
7.0-8.0 是主要产物，在 pH5.0-6.5 时，2,3-丁二醇是
主要的产物［1］。本研究中，控制 pH 为 7.0 时产生大
量乳酸，而在 pH 为 6.0 和自然 pH 条件下，乳酸产
量则显著减少。在分批补料发酵条件下，发酵过程
中不控制 pH，副产物乳酸的产量很低，碳源更多地
流向 2，3-丁二醇途径，产量达到 81.4 g/L，显著地提
高了 2，3-丁二醇的生产效率。
采用不同的补料方式，对 2，3-丁二醇的产量会
产生不同的影响。针对菌株粘质沙雷氏菌 H30 的
研究发现，采用恒底物浓度发酵方式，高残糖浓度
（15-25 g/L）2，3-丁二醇的产量，高于低残糖浓度（5
g/L）［23］。以肺炎克雷伯氏菌 SDM 为生产菌株，发
现与脉冲补料、恒速补料和指数补料相比，将葡萄
糖浓度控制在 20-30 g/L 的恒底物浓度补料策略最为
有效［15］。而地衣芽孢杆菌 10-1-A，能够耐受高浓度
葡萄糖，在残糖浓度为 20-70 g/L 之间时，能够维持
2，3-丁二醇的较高产率［13］。本研究也发现，在分批
403632ᰦ䰤 h 2,3-бҼ䞷ˈң䞨ӗ䟿 g/L 2,3-бҼ䞷ӗ⦷ g/L·h 282420161284 44 48 52 56 60 64 68 72
100
㪑㨴㌆⎃ᓖ
2,3-бҼ䞷ӗ⦷ 2,3-бҼ䞷ӗ䟿ң䞨ӗ䟿
90
80
70
60
50
40
30
㪑㨴㌆⎃ᓖ g/L
20
10
0
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
2.0
1.8
1.6
1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
图 2 自然 pH 对 2，3-丁二醇产量的影响
维持在 30 g/L。结果（图 3）显示，2，3-丁二醇产量
在 46 h 时即达到最高，为 83.4 g/L，产率在 22 h 后
一直维持在 1.9 g/L·h 左右，发酵时间明显缩短。发
酵过程中，只有很低水平的乳酸产生。因此持续的
高水平产率导致发酵时间变短。
2622ᰦ䰤 h 2,3-бҼ䞷ˈң䞨ӗ䟿 g/L 2,3-бҼ䞷ӗ⦷ g/L·h 18141062 30 34 38 42 46
100
㪑㨴㌆⎃ᓖ
2,3-бҼ䞷ӗ⦷ 2,3-бҼ䞷ӗ䟿ң䞨ӗ䟿
90
80
70
60
50
40
30
㪑㨴㌆⎃ᓖ g/L
20
10
0
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
2.0
1.8
1.6
1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
图 3 残糖浓度对 2，3-丁二醇发酵的影响
3 讨论
地衣芽孢杆菌是常见的 2，3-丁二醇生产菌株，
它被美国食品药品监督管理局（US Food and Drug
Administration） 认 定 为 GRAS（generally recognized
as safe）菌株，由于其不具有致病性，可以安全的用
于大规模工业生产［13］。此外，地衣芽孢杆菌具有产
生淀粉酶和木聚糖酶的能力，可以利用农业废弃物
为原料发酵生产 2，3-丁二醇，不仅可以降低生产成
本，而且不与人类争夺资源［16］。但从目前报道来看，
其生产能力普遍低于 2，3-丁二醇生产优势菌克雷伯
2014年第8期 163郭文逸等 ：地衣芽孢杆菌高产 2，3-丁二醇菌株的选育和发酵研究
补料发酵中，将残糖浓度维持在 30 g/L 时，可以长
时间维持 2，3-丁二醇较高的产率，使发酵时间缩短
了 26 h，提高了生产效率。
4 结论
本研究从牛奶中分离到 1 株地衣芽孢杆菌，经
紫外诱变后，突变子 BL41 合成 2，3-丁二醇的能力
显著提高。进一步在 5 L 发酵罐中进行工艺优化，
发现不控制酸碱度，可以明显减少乳酸的水平，碳
源更多的流向 2，3-丁二醇合成途径。另外，提高残
糖浓度至 30 g/L，2，3-丁二醇产量几乎不变，但发酵
时间缩短 26 h。结果显示，地衣芽胞杆菌 BL41 可
以作为候选菌株，用于大规模生产 2，3-丁二醇。
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（责任编辑 马鑫）