全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第4期
收稿日期 ：2012-11-08
基金项目 ： 国家科技部农业科技成果转化资金项目（2010GB2B100118 ），吉林省科技发展计划项目（20100803），吉林省高技术产业发展项
目［吉发改高技（2009） 633 号］，吉林师范大学研究生创新科研计划资助项目［研创新（学）（201116 号）］
作者简介 ： 周晓馥，女，博士，教授，硕士生导师，研究方向 ：植物基因工程 ；E-mail: xiaofuzhou@sohu.com
通讯作者 ：徐洪伟，男，博士，副教授，硕士生导师，研究方向 ：植物基因工程 ；E-mail ：jlspxhw@126.com
苜蓿属植物是世界上分布最广的优良牧草，也
是我国种植面积最大的人工牧草，其不仅是一种重
要的饲料作物，而且还是很好的水土保持植物和绿
肥植物，在我国牧草乃至整个草业发展中占有重要
战略地位。每年由细菌、真菌、卵菌和病毒病原引
起的植物病害导致作物产量损失巨大［1］。提高现有
苜蓿栽培种对逆境和病虫害的耐受力以及培育抗逆、
抗病虫的苜蓿新品种迫在眉睫。育种亲本资源匮乏、
周期长限制了通过传统育种培育性状优良的植物新
品种。近年来，植物基因工程的迅速发展为植物遗
传育种提供了新手段。植物基因工程中，已经应用
的遗传转化技术有基因枪法、农杆菌介导法、花粉
紫花苜蓿组织培养体系的建立及其遗传转化
周晓馥  吕杰  苗璐  高峰  徐洪伟
（吉林师范大学植物资源科学与绿色生产吉林省重点实验室，四平 136000）
摘 要 ： 为建立高效的农杆菌介导的紫花苜蓿的遗传转化体系，以紫花苜蓿无菌苗叶片作为外植体，用 8 种含有不同激素
浓度梯度的培养基对其进行愈伤组织及不定芽的诱导，结果表明，M7 培养基（MS+1 mg/L 2，4-D + 2 mg/L CH + 0.25 mg/L KT + 2
mg/L 琼脂）的愈伤组织诱导率最高，可达 100% ；继代表现最好，为胚性愈伤组织 ；同时，继续培养后可直接分化出不定芽，分
化率达 100%。结果表明，最适宜条件分别为卡那霉素（Kan） 筛选浓度为 75 mg/L ；农杆菌菌液 OD600 值为 0.45-0.6 之间。
关键词 ： 紫花苜蓿 组织培养 高频再生 遗传转化 农杆菌 卡那霉素 OD600 值
Establishment of Alfalfa Tissue Culture System and Research on
Agrobacterium-mediated Transformation System in Alfalfa
Zhou Xiaofu Lü Jie Miao Lu Gao Feng Xu Hongwei
（Key Laboratory of Jilin Province for Plant Resources Science and Green Production，Siping 136000）
Abstract:  In order to establish high-efficiency alfalfa genetic transformation system，the influence factors of Agrobacterium-mediated
transformation system were studied. The callus and adventitious bud of alfalfa were induced by culturing leaves as explants in 8 different kind of
medium，named M1-M8, respectively. The results showed that M7 medium（MS+1 mg/L 2，4-D + 2 mg/L CH + 0.25 mg/L KT + 2 mg/L agar）
was the best one which can induced the much more ammount of callus and adventitious bud of alfalfa than others. The results showed that the
most suitable conditions for kanamycin was 75 mg/L; OD600 of agrobactium concerntration value for 0.45-0.6.
Key words:  Alfalfa Tissue culture High frequency regeneration Genetic transformation Agrobacterium Kanamycin OD600
管通道法、PEG 介导法、子房注射法、超声波法、
阳离子转化法和电击法等。其中主流方法是基因枪
轰击法和农杆菌介导法。基因枪轰击法有整合模式
相对复杂、外源基因表达传代相对不稳定、容易受
技术限制的缺点。农杆菌介导法尽管有载体骨架甚
至染色体片段可被转移的缺点，但整合模式相对简
单外源基因表达传代相对稳定，操作简便、成本低，
也可转移大片段等。农杆菌介导的遗传转化技术体
系的核心是具备较高植株再生频率与转化效率的受
体系统［2］。1985 年，Vash 第一次提出了在组织培
养基础上利用遗传转化技术将特定的外源基因导入
牧草的可行性，为利用基因工程技术改良牧草奠定
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第4期64
了理论基础。1986 年，Deak 等［3］与 Shahin 等［4］分
别在 Plant cell 和 Crop Science 杂志上公布，通过根
癌农杆菌介导的苜蓿遗传转化获得成功 ；之后在该
方法基础上，人们在许多方面作了改进。其中，以
Mariotti 和 Chabaud 为代表的大多数研究结果显示遗
传转化的效率决定于基因型［5，6］和菌株类型［7-9］；
Aoki 和 Slavica 等［10，11］报道遗传转化效率也决定于
选择转化体的能力和茎段再生频率。
本研究通过对紫花苜蓿的遗传转化进行研究，
以期为利用紫花苜蓿叶片建立优良的转化受体系统
提供重要的技术基础和理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
紫花苜蓿（Medicago sativa L1.） 种子，灭菌种
子萌发后获得无菌种子苗，之后将种子苗无性繁殖
后于无菌瓶中保存无菌苗，后种植于温室保存植株。
取无菌苗的叶片作为再生体系研究的外植体。 基本
培养基为 MS，添加不同种类、浓度激素组合和有
机附加物作为愈伤组织诱导培养基（编号 M1-M8），
各培养基成分见表 1。1/2MS 培养基作为生根壮苗培
养基，所有培养基 MS 41.74 g/L，pH5.8，121℃高温
高压灭菌 20 min。本试验中所用继代培养基分别与
所用诱导培养基相同。
1.2 方法
1.2.1 无菌苗的培养 取成熟紫花苜蓿种子，纱布
包裹，漏土，流水冲洗，然后在超净工作台用 75%
酒精浸泡 2 min，再用 0.1% 升汞溶液浸泡 4-5 min，
最后用无菌水冲洗 6-8 次。灭菌后将种子接种到
1/2MS 固体培养基上，每瓶中接种 25 粒。培养条件
为光照 16 h，光照强度 2 000 lx，温度 26℃。
1.2.2 外植体来源 愈伤组织诱导 ：取培养 1.5 个
月左右的紫花苜蓿无菌苗，将其真叶边缘切割，分
别接种到含不同激素浓度梯度的培养基（M1-M8）
上。培养条件同 1.2.1，每隔 15-20 d 继代 1 次 ；8
个处理，每个处理重复 3 次。
愈伤组织分化 ：以愈伤组织诱导试验结果中的
愈伤组织为材料，继续在相应的愈伤组织诱导培养
基上培养，进化分化培养试验，每隔 15-20 d 继代 1 次。
生根培养 ：分化出的不定芽转接到 1/2MS 培养
基上进行生根及再生培养。
1.2.3 再生苗的移栽 再生苗在生根培养基上长到
6-8 cm 左右，根系发达时打开瓶盖炼苗，2-3 d 左
右移栽，刚移栽 1-2 周内，刚移栽小苗不可被阳光
直射，且要求湿度较大 ；2 周后，可逐步移入有阳
光的地方，置于温室培养。
1.2.4 试验设计 紫花苜蓿组织培养最适培养基的
选择 ：取紫花苜蓿无菌苗的叶片进行切割，分别将
其接种到不同激素浓度梯度的培养基（M1-M8）上，
培养条件同 1.2.1，每隔 15-20 d 继代 1 次 ；接种 2
周后统计接种数、出愈数及出愈率，接种 1 个月后
统计各培养基诱导出的愈伤组织类型及其生长状态；
根据出愈率与愈伤组织类型及其生长状态筛选出紫
花苜蓿叶片组织培养的最适培养基。
紫花苜蓿组织培养最适外植体的选择 ：取紫花
苜蓿无菌苗 3 个部位，分别为茎段、叶片、节间，
将其接种到 M7 培养基上，诱导其产生愈伤组织，
培养条件同 1.2.1，每隔 15-20 d 继代 1 次 ；接种 2
周后统计接种数、出愈数及出愈率，接种 1 个月后
统计各培养基诱导出的愈伤组织类型及其生长状态；
根据出愈率与愈伤组织类型及其生长状态筛选出紫
花苜蓿组织培养的最适外植体。
筛选压的确定 ：卡那霉素（Kanamycin，Kan ）
是植物基因工程中普遍使用的一种选择性抗生素，
通过卡那霉素抗性基因对转基因植物的筛选起作用。
本试验中，将紫花苜蓿无菌苗分别接种于含有 0、
25、50、75 和 100 mg/L 卡那霉素的 1/2MS 壮苗生根
培养基上培养，培养条件同 1.2.1 ；之后每 2 周观察
统计 1 次，统计无菌苗的接种数、白化数、白化率；
5 个处理，每个处理重复 3 次 ；结果数据用 SAS8.0
表 1 培养基成分
培养基
MS
（g/L）
2，4-D
（mg/L）
CH
（mg/L）
KT
（mg/L）
Agar
（g/L）
M1 41.74 2 500 0.25 2
M2 41.74 2 200 0.25 2
M3 41.74 2 2 0.25 3.5
M4 41.74 2 2 0.25 2
M5 41.74 2 1 0.25 2
M6 41.74 2 0.5 0.25 2
M7 41.74 1 2 0.25 2
M8 41.74 1 1 0.25 2
2013年第4期 65周晓馥等 ：紫花苜蓿组织培养体系的建立及其遗传转化
进行统计分析。
农杆菌不同菌液浓度对转化效率的影响 ：分别
用 OD600 值为 0.3、0.45、0.6 和 0.8 的菌液侵染紫花
苜蓿叶片，侵染 4 d 后进行 GUS 组织化学染色分析。
根据 GUS 阳性表达量，确定用于侵染紫花苜蓿叶片
时最适宜的农杆菌菌液 OD600 值。
2 结果
2.1 紫花苜蓿组织培养体系的建立
2.1.1 最适培养基的选择 本试验中，8 种培养基
（M1-M8）都能不同程度地诱导出愈伤组织（表 2）。
由表 2 可知，对于苜蓿叶片的愈伤组织诱导率 ：M7
最 高，M1、M3、M4 和 M8 次 之，M2、M5 较 低，
M6 最低 ；对于其愈伤组织类型及继代表现 ：M7 中
诱导的苜蓿叶片的愈伤组织呈淡黄色、结构内部较
致密外部较松散、表面较干燥、生长较快，为 II 型
愈伤组织 ；M3、M4 和 M8 中诱导的苜蓿叶片的愈伤
组织则表现为呈淡黄色、结构较松软、表面较干燥、
生长一般，为 I 型和 II 型的混合型愈伤组织 ；M5 和
M6 中诱导的苜蓿叶片的愈伤组织表现为呈暗黄色、
结构松软、生长较慢，为Ⅲ型愈伤组织，在继代过
程中容易褐化而死亡 ；M1 和 M2 中诱导的苜蓿叶片
的愈伤组织表现为部分呈乳白色、表面干燥、结构
较松软，在继代过程中容易褐化而不能长期继代。
根据表 2 中各培养基诱导的愈伤组织结果，结
合表 1 中各培养基的成分可以看出，M7 是紫花苜蓿
叶片组织培养最适宜的培养基。
表 2 不同培养基时紫花苜蓿叶片愈伤组织的诱导率及其继代表现
培养基 接种数（个） 出愈数（个） 出愈率（%） 愈伤组织类型及继代表现
M1 81 75 92.59 Ⅰ型，生长缓慢
M2 87 70 80.46 Ⅰ型，生长缓慢
M3 93 89 95.7 Ⅰ型，生长较慢
M4 84 80 95.24 Ⅰ型，生长一般
M5 117 92 78.63 Ⅰ型和Ⅱ型的混合型，生长较慢
M6 110 55 50 Ⅰ型和Ⅱ型的混合型，生长缓慢
M7 111 108 98.18 Ⅱ型，生长较快
M8 76 72 94.73 Ⅰ型和Ⅱ型的混合型，生长缓慢
2.1.2 最适外植体的选择 接种到 M7 培养基上的
紫花苜蓿无菌苗的茎段、叶片、节间，其愈伤组织
诱导结果图 1（图 1）显示，接种于 M7 培养基上的
3 种外植体，其出愈率及愈伤组织分化出的不定芽
基本一致，均为 100%。其中叶片与节间来源的愈伤
组织大、其分化出的不定芽多，茎段来源的愈伤组
织较小、其分化出的不定芽较少。说明 M7 培养基
是适用于紫花苜蓿多种外植体组织培养优选培养基。
2.1.3 紫 花 苜 蓿 叶 片 胚 性 愈 伤 组 织 的 高 频 再 生
植 紫花苜蓿叶片在 M7 培养基上接种 1 周左右开
始形成伤组织，之后 1 个月左右形成不定芽，由不
定芽到生根阶段约 2 个月，之后移入生根培养基中，
再生成植株，苗高为 6-8 cm 左右时，根系发达时打
开瓶盖炼苗，2-3 d 左右移栽，刚移栽 1-2 周内，刚
移栽小苗不可被阳光直射，且要求湿度较大；2 周后，
可逐步移入有阳光的地方，置于温室培养。
A B C
图 1 紫花苜蓿茎段、节间、叶片 3 个部位在 M7 培养基
上形成愈伤组织不定芽
A ：紫花苜蓿茎段于 M7 培养基上诱导形成愈伤组织不定芽 ；B ：紫花苜蓿
节间于 M7 培养基上诱导形成愈伤组织不定芽 ；C ：紫花苜蓿叶片于 M7 培
养基上诱导形成愈伤组织不定芽。
2.2 紫花苜蓿叶片途径的转化受体系统的研究
2.2.1 选择培养中选择压的确定 卡那霉素对紫花
苜蓿无菌苗生长有抑制作用，表现为茎细弱白化。
随着卡那霉素浓度的升高，紫花苜蓿地上部分受到
的抑制作用越来越强，表现为白化苗数持续增加。
由表 3 可知，不加卡那霉素时，其白化苗率与卡那
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第4期66
A B C
D E F
G H I
100 mg/L 中的苜蓿无菌苗全部白化死亡（图 3-C、
图 3-D）。由此看见，苜蓿无菌苗的适宜卡那霉素筛
选压为 75 mg/L。
图 2 紫花苜蓿的高频植株再生体系
A，B ：紫花苜蓿叶片在 M7 培养基上诱导形成愈伤组织 ；B，C ：愈伤组织
在 M7 培养基中分化形成不定芽 ；D，E ：不定芽在 1/2MS 生根培养基中生
根并再生成植株 ；F，G ：再生植株移栽到土中 ；H，I ：移栽的紫花苜蓿植
株生长并开花
霉素浓度为 25 mg/L、50 mg/L 时的白化苗率之间有
显著性差异（P<0.05），表明卡那霉素会显著抑制苜
蓿无菌苗的正常生长 ；当卡那霉素浓度为 25 mg/L、
50 mg/L 时，其白化苗率与卡那霉素浓度为 75 mg/L、
100 mg/L 时的白化苗率之间有显著性差异（P<0.05），
表明 75 mg/L、100 mg/L 的卡那霉素浓度较 50 mg/L
的卡那霉素浓度，显著抑制紫花苜蓿无菌苗的正常
生长。当卡那霉素为 75 mg/L 和 100 mg/L 时，紫花
苜蓿无菌苗白化苗率达到最高，约 100%。
图 3 卡那霉素对紫花苜蓿种子苗生长的影响
A ：当培养基中的 Kan 浓度为 0 mg/L 时，苜蓿无菌苗正常生长 ；B ：当培养
基中的 Kan 浓度为 50 mg/L 时，部分苜蓿无菌苗白化 ；C、D ：当培养基中
的 Kan 浓度为 75 mg/L 和 100 mg/L 时，全部苜蓿无菌苗白化
A B
C D
2.2.2 农杆菌菌液浓度对紫花苜蓿遗传转化率的影
响 取 OD600 值分别为 0.3、0.45、0.6 和 0.8 的菌液
侵染苜蓿叶片，侵染 4 d 后进行 GUS 组织化学染色
分析，结果见表 4 和图 4。由表 4 可知，OD600 值分
别为 0.45、0.6 和 0.8 时 GUS 的阳性发生率最高，为
100%，OD600 值小于 0.45 时 GUS 阳性发生率下降。
因此，侵染苜蓿叶片的最适宜菌液 OD600 值为 0.45-
0.6 之间，但偏向 0.6 左右更好。
由图 4 可知，当菌液 OD600 值为 0.3 时 GUS 阳
性发生部位仅在叶片局部位置（图 4-B）；当菌液
OD600 值为 0.45 时，GUS 阳性发生部位在叶片边缘
伤 口 处（ 图 4-C）；当 菌 液 OD600 值 为 0.6 时，GUS
阳性发生部位布满整个苜蓿叶片（图 4-D）；当菌液
OD600 值为 0.45 时，GUS 阳性发生部位在叶片局部
位置，且较 OD600 值为 0.3 时要多，但较 OD600 值为 0.45
和 0.6 时明显少（图 4-E），未转化的对照叶片不能
被染色（图 4-A）。
3 讨论
3.1 紫花苜蓿组织培养体系的建立
本试验中各培养基的基本培养基为 41.74 g/L
表 3 卡那霉素对紫花苜蓿无菌苗生长的影响
Kan 浓度（mg/L） 接种数（个） 白化率（%）
0 44 0.01753 C
25 53 0.55047 B
50 45 0.59727 B
75 47 0.9471 A
100 48 0.95833 A
注 ：数据经 SAS8.0 方差分析，每组数据上的不同字母表示具有显著性差异
（P<0.05）
随着筛选培养时间的延长，如图 3 所示，生长
在卡那霉素浓度为 50 mg/L 中的苜蓿无菌苗部分白
化（图 3-B），而生长在卡那霉素浓度为 75 mg/L 和
2013年第4期 67周晓馥等 ：紫花苜蓿组织培养体系的建立及其遗传转化
表 4 不同 OD600 值的农杆菌菌液转化紫花苜蓿叶片后 GUS 基因瞬时表达率
菌液 OD600 转化外植体数 GUS
+ 外植体数 GUS+ 频率（%） GUS+ 分布
0 40 0 0 无
0.3 45 33 73.33 叶片局部，少
0.45 52 52 100 叶片边缘，较多
0.6 47 47 100 整个叶片，很多
0.8 55 55 100 叶片局部，较少
图 4 转化 gus 基因的苜蓿叶片及对照的 GUS 染色
A：对照，未转化的苜蓿叶片不能被染色；B：菌液 OD600 值为 0.3 时，染色的苜蓿叶片，蓝色斑点少；C：菌液 OD600 值为 0.45
时，染色的苜蓿叶片，蓝色斑点较多，且多分布在伤口处；D：菌液 OD600 值为 0.6 时，染色的苜蓿叶片，蓝色斑点最多，
且分布在整个叶片 ；E ：菌液 OD600 值为 0.8 时，染色的苜蓿叶片，蓝色斑点少
A B
C D E
MS。当琼脂量为 3.5 g/L 时，诱导出的愈伤组织较
干燥，且生长较缓慢 ；而琼脂量为 2.0 g/L 时，愈伤
组织生长良好。因此，最适宜琼脂量为 2 g/L。根据
M1-M2 所诱导的愈伤组织的对比发现，M1 和 M2
中诱导的苜蓿叶片的愈伤组织表现为部分呈乳白色、
表面干燥，这可能是由于水解酪蛋白 CH 量过高，
因为根据本实验室之前在做玉米幼胚的愈伤组织诱
导与培养时，CH 都是 500 且效果极好。本试验刚开
始设计 2，4-D 为 2 mg/L 时，CH 量分别为 500、200，
结果发现诱导的愈伤组织呈乳白色、表面干燥且生
长较慢，考虑到苜蓿是含蛋白量最多的一种牧草，
所以在后续试验中设计 CH 的量大幅降低，依次为
2、1 和 0.5 mg/L。根据 M3-M6 所诱导的愈伤组织的
对比发现 ：当 2，4-D 为 2 mg/L 时，诱导愈伤组织最
适宜的 CH 量应为 2 mg/L ；考虑到苜蓿愈伤组织的
生长和分化主要决定于愈伤组织诱导培养基的激素
配比［12］，故推断当 2，4-D∶CH = 1∶1（2 mg/L ：2
mg/L）时，为适宜的愈伤组织诱导培养基，在此基
础上设计 M7（2，4-D∶CH = 1 mg/L∶2 mg/L）、M8（2，
4-D∶CH = 1 mg/L∶1 mg/L）培养基，结果发现，M8
培养基诱导苜蓿愈伤组织愈伤组织呈淡黄色、结构
较松软、表面较干燥、生长一般，为 I 型和 II 型的
混合型，这与 M4 培养基诱导出的愈伤组织情况基
本一致，这证明培养基中对于诱导愈伤组织起主要
决定作用的是激素的配比，而非单一激素浓度，这
与吴丽芳等［12］的结论一致。而 M7 培养基诱导的苜
蓿愈伤组织出愈率高，且愈伤组织呈淡黄色、结构
内部较致密外部较松散、表面干燥、生长较快，为
II 型愈伤组织。且在后续试验中发现，此 M7 培养
基上诱导出的愈伤组织，继续在 M7 培养基上继代，
1 个月左右分化出不定芽，之后移入生根培养基
1/2MS 中，2 个月左右可直接再生成植株。在同一种
培养基 M7 上既能诱导愈伤组织同时可分化出丛生
芽，这可能是因为培养基中激素 KT 能刺激愈伤组
织分化［13］。克服了常规组织培养中不同阶段分别需
要不同培养基（诱导培养基与分化培养基）的繁琐
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第4期68
之处，大大简化了试验过程，因此 M7 为苜蓿组织
培养高频再生的最适宜培养基。
3.2 紫花苜蓿叶片途径的转化受体系统的研究
卡那霉素抗性基因（npt-II ），是目前在植物基
因转化中应用最广泛的选择标记基因［14，15］。本试验
对卡那霉素对紫花苜蓿无菌苗的敏感性进行了检测，
结果发现，导致全部苜蓿无菌苗白化的最小卡那霉
素浓度为 75 mg/L。本试验旨在筛选致死苜蓿无菌苗
的最小卡那霉素浓度，因此确定卡那霉素 75 mg/L
为筛选苜蓿无菌苗的临界值。这为苜蓿转基因中卡
那霉素选择浓度的确定提供了一定的依据，在以往
的研究中，卡那霉素在子叶植物中的使用浓度一般
在 50-100 mg/L［16］，与本试验的结果大致相符。
4 结论
本研究建立了紫花苜蓿组织培养高频再生体
系，即以叶片或节间或茎段为外植体，在 M7 培养
基（MS+1 mg/L 2，4-D + 2 mg/L CH + 0.25 mg/L KT +
2 mg/L 琼脂）上进行愈伤组织的诱导和分化，诱导
率和分化率均可达到 100% ；分化出的不定芽转接到
1/2MS 壮苗生根培养基上进行生根及再生，形成完
整的再生植株 ；再生植株炼苗 2-3 d 后，即可移栽
到土壤中生长 ；移栽 2 周内避免阳光直射，且湿度
要求较大，2 周后可逐渐移到有阳光的地方。紫花
苜蓿无菌苗的适宜筛选压为 75 mg/L。侵染紫花苜蓿
叶片时最适宜的菌液 OD600 值为 0.45-0.6 之间，偏
向 0.6 时更好。
参 考 文 献
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（责任编辑 狄艳红）