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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第6期
利用易错 PCR（Error prone PCR，EP-PCR）或
DNA 改组（DNA shuffling）等基因突变技术对基因
启动子区进行改造构建启动子文库，并已在原核和
真核微生物的代谢工程、功能基因组学和合成生物
学中得到了成功应用［1-3］。启动子文库是不同强度
的启动子集合体，在构建时，对天然启动子序列进
收稿日期 ： 2014-02-22
基金项目 ：广西自然科学基金项目（2013GXNSFBA019096）
作者简介 ：秦秀林，女，讲师，博士，研究方向 ：生物化学与分子生物学 ；E-mail ：xiulinqin@gxu.edu.cn
通讯作者 ：钱江潮，女，教授，博士，研究方向 ：生物化学与分子生物学 ；E-mail ：jiangchaoqian@ecust.edu.cn
优化易错 PCR 条件以提高毕赤酵母 GAP 启动子文库
突变效率
秦秀林1  钱江潮2  储炬2
（1. 广西大学生命科学与技术学院，南宁 530004 ；2. 华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室，上海 200237）
摘 要 ： 高效的随机突变策略对于构建含有丰富突变体的启动子文库至关重要。为了建立一个突变率适中并能获得较多有
益突变子的易错 PCR（error-prone PCR，EP-PCR）条件，实现毕赤酵母 GAP 启动子的高效突变，对 EP-PCR 反应条件进行了优化。
考察了模板浓度、反应循环数和 Mg2+ 浓度对 EP-PCR 的产物得率和突变率的影响后，确定了适于 GAP 启动子突变的 EP-PCR 条件：
模板浓度、反应循环数和 Mg2+ 浓度分别为 1 ng/μL、25 和 10 mmol/L。优化 EP-PCR 条件后，GAP 启动子突变率为 1.1%，连续进行
3 轮 EP-PCR 后突变率可达到 4.0%。利用优化后 EP-PCR 对 GAP 启动子进行随机突变，筛选了 250 个突变子，获得 5 个启动子强
度高于野生型 GAP 启动子的突变体，有益突变达到了 2%，可用于构建 GAP 启动子文库。
关键词 ： 易错 PCR　突变效率　随机突变　毕赤酵母　GAP 启动子
High-error-rate Random Mutagenesis of GAP Promoter in Pichia
pastoris Using an Optimited Error Prone PCR
Qin Xiulin1 Qian Jiangchao2 Chu Ju2
（1. College of Life Science and Technology，Guangxi University，Nanning 530004 ；2. State Key Laboratory of Bioreactor Engineering，East
China University of Science & Technology，Shanghai 200237）
Abstract:  The first important step toward a successful preparation of large and diverse promoter library with desired complexity, is to
select a suitable mutagenesis strategy. To generate a promoter library of GAP promoter（pGAP）variants, mutations were introduced using
error-prone PCR. After optimization of the conditions for EP-PCR random mutagenes, high mutation（error rate 1.1%）frequence was obtained
using 1 ng/μL template and 10 mmol/L Mg2+, in combination with 25 thermal cycles. To increase mutational diversity and reach an appropriate
error rate, three consecutive rounds of EP-PCR were carried out under the same conditions. After random sequencing of 10 clones from each
round, an overall range of mutation rates from 1.1% to 4.0% was observed. Then, 250 clones containing pGAP variants were screened using the
highthroughput screening approach in 48-deep-well plates. Among them, 5 mutants exhibited higher fluorescent intensity compared to the wild-
type promoter.
Key words:  Error-prone PCR Mutation frequency Random mutagenesis Pichia pastoris GAP promoter
行突变，再从中筛选出合适强度的多个突变启动子
从而组成启动子文库［4］。由于启动子的碱基序列直
接影响其调控基因转录的强度，故只要所构建的文
库包含足够丰富的突变序列，筛选量足够大，就可
以从中筛选出一系列具有不同调控强度的突变启动
子，构成能对其下游基因实施精确微调的文库。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第6期212
近年来，EP-PCR 在启动子文库构建过程中应用
非常广泛［5-7］。Alper 等［4］通过 EP-PCR 获得了噬菌
体 PL-λ 启动子活性变化范围较大的突变启动子文库，
启动子的活性在 196 倍的范围内变化，而报告基因
gfp 的转录分析证明突变启动子调控的转录水平可
在 325 倍的范围内变化，证明可通过随机突变获得
启动子活性差别较大的突变体，以达到对基因进行
精细调节的目的。Nevoigt 等［8］通过筛选 EP-PCR 突
变的溶氧敏感型启动子 DAN1 突变体文库，获得了
在微氧条件下也能够诱导表达的启动子突变体，其
启动子活性在微氧条件下是野生型启动子的 1.8-2.9
倍。Hartner 等（Hartner et al. 2008）对巴斯德毕赤
酵母强启动子 AOX1 的转录因子结合序列（TFBSs）
进行突变改造后，利用 96 孔深孔板进行高通量筛选，
挑选出的突变启动子的活性可在原 AOX1 启动子强
度 6% 至 160% 之间变化。启动子文库能实现目的基
因表达的精确调控，但其不足之处是突变后获得的
有益突变体较少，Nevoigt 等［8］在筛选了 12 000 个
转化子后只有 6 个突变体的启动子活性较野生型启
动子提高 ；Alper 等［4］在筛选过程中从 30 000 个菌
落中只筛到不足 0.1% 具有有用启动子的菌株。因此，
启动子文库构建的主要难点不是繁重的高通量筛选，
而是建立一个能获得较多有益突变的 EP-PCR 条件。
作为真核生物，毕赤酵母具有高等真核表达系
统的许多优点 ：如蛋白加工、折叠、翻译后修饰等，
并已成功用于异源蛋白和代谢物的表达。这些使得
毕赤酵母广泛地应用于基础研究和大规模工业化生
产。利用 EP-PCR 对毕赤酵母组成型三磷酸甘油醛
脱氢酶启动子 GAP 进行随机突变，构建 GAP 突变
文库可以为毕赤酵母基因的连续表达调控提供一新
的基因操作平台。EP-PCR 的关键在于选择适当的突
变频率，一般有益突变频率较低，绝大多数突变是
有害或中性。若突变频率过高，几乎无法筛选到有
益突变 ；若突变频率太低，则未发生任何突变的野
生型在突变群体中将占优势，也很难筛选到理想突
变体 ；而目标基因的突变率在 1%-5% 范围时才能
获得较多的有益突变达到理想的诱变结果［9，10］。
因此，为了获得大量的具有丰富突变的 GAP 启
动子并增加启动子的突变效率，本研究对 EP-PCR
反应条件 ：模板浓度、循环数和 Mg2+ 浓度分别进行
优化，并应用优化后条件对 GAP 启动子进行突变。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试验材料 大肠杆菌 DH5α 由本实验室保藏，
毕赤酵母菌株 GS115 和 pGAP Z 载体购自 Invitrogen
公司，克隆载体 pMD18-T 购自 TaKaRa 公司。DNA
序列经 TaKaRa 公司测定。
1.1.2 试剂 脱氧核糖核苷酸（dATP、dTTP、dGTP
和 dCTP）、Taq DNA 聚合酶均购自上海生工生物工
程技术服务有限公司。限制性内切酶和连接反应试
剂盒均为 TaKaRa 公司产品，质粒小量抽提、胶回
收试剂盒和 PCR 反应液纯化试剂盒为 AxyGen 公司
产品。其他化学试剂均为国产分析纯。
1.2 方法
1.2.1 菌株的培养 大肠杆菌 DH5α 在 LLB 培养基
中 37℃培养，转化重组质粒后 LLB 培养基需添加
zeocin 至终浓度为 25 μg/mL。毕赤酵母菌株在 YPD
培养基（1% yeast extract，2% peptone，2% glucose）、
BMD 培 养 基（1.34% YNB，1% glucose，4×10-5%
biotin，100 mmol/L potassium phosphate，pH6）或 BM-
DY 培养基（1% yeast extract，2% peptone，1.34% Y-
NB，1% 葡萄糖，4×10-5% biotin，100 mmol/L pota-
ssium phosphate，pH 6）中 28℃培养。
1.2.2 毕赤酵母 GS115 的转化 重组质粒经 BspEI
线性化后电转化毕赤酵母 GS115 感受态细胞，用引
物 GAP primer 和 GFP-r（表 1）经菌落 PCR 确定重
组基因整合的正确性。转化子的筛选用含 0.4 μg/mL
biotin 的 MD 平 板（1.34%YNB，2% 葡 萄 糖，1.5%
琼脂粉）。
表 1 引物列表
引物 碱基序列 a
GAP-EPf TCGACTAGTTTTTTGTAGAAATGTCTTG
GAP-EPr TTAGCGGCCGCATAGTTGTTCAATTGATTG
pGAP-CXf AATTTAACTGTGATAAACTACCGCATT
pGAP-CXr CCAGTGAATAATTCTTCACCTTTAGACA
GAP Primer CTATTTCAATCAATTGAACAAC
GFP-r TTATTTGTACAATTCATC
a 下划线碱基序列为酶切位点
1.2.3 EP-PCR 突 变 GAP 启 动 子 以 质 粒 pGAP Z
2014年第6期 213秦秀林等 ：优化易错 PCR 条件以提高毕赤酵母 GAP 启动子文库突变效率
为模板，用引物 GAP-EPf /GAP-EPr（表 1）经 EP-
PCR 获得突变的 GAP 启动子，EP-PCR 反应体系为
100 μL， 所 含 Mn2+、dATP、dGTP、dCTP、dTTP 浓
度 固 定 不 变 分 别 为 0.5、0.2、0.2、1 和 1 mmol/L。
10×PCR 缓冲液 ：100 mmol/L Tri-HCl（pH8.3），500
mmol/L KCl，20 mmol/L MgCl2。 易 错 PCR 反 应 条
件 ：94℃预变性 3 min ；94℃变性 1 min，54℃退火
1 min，72℃延伸 1 min，25 个循环。
1.2.4 GAP 启动子突变文库的筛选 GAP 启动子突
变文库高通量筛选采用 48 深孔板，每孔装 900 μL
培养基，于 30℃，220 r/min 培养。筛选方式参照之
前报道的方法［11］：将转化后的转化子涂布于 MD 筛
选平板，待单菌落直径至 3 mmol/L 左右接种至保种
板培养（Master plate）培养 ；取保种板 24 h 培养菌
液至对应的预培养板孔（preculture plate）中培养，
预培养板的 48 深孔板每孔装 900 μL 的 BMD（0.2%
葡萄糖）；从预培养板取培养 48 h 的菌液至主培养
板（Main culture plate）中对应孔中，主培养板的 48
深孔板每孔装 900 μL 的 BMD（1% 葡萄糖），培养
36 h 后取菌液测定菌体浓度和 yEGFP 表达强度。
1.2.5 菌体密度测定 菌液稀释一定倍数后在波长
600 nm 处以无菌培养基为对照进行比色，OD600=OD
读数 × 稀释倍数。
1.2.6 重组菌中 yEGFP 荧光强度检测 将主培养板
培养了 36 h 的菌液取 30 μL 至装有 220 μL PBS 的 96
孔板中，利用多功能酶标仪（（BioTek Synergy 2）检
测酵母增强型绿色荧光蛋白 yEGFP 荧光强度（激发
波 长 ：395 nm， 发 射 波 长 ：509 nm）。 检 测 yEGFP
荧光强度时，以不表达 yEGFP 的基因工程菌 G/GH［11］
作为对照去除背景干扰。比荧光强度 F/OD600（RFU/
OD600）为荧光强度值比上对应细胞密度 OD600。
2 结果
2.1 EP-PCR反应体系中模板浓度的优化
为了提高目的基因的突变率并保证能获得较多
的扩增产物，首先对 EP-PCR 反应体系中模板（pGAP
Z 质粒）浓度进行了优化。反应体系中模板终浓度
为 0.1、0.5、1 和 2 ng/μL 时 EP-PCR 获得的产物（图
1）经纯化后利用 NanoDrop 分别测定其 DNA 的浓度。
模板浓度为 0.1 ng/μL 和 0.5 ng/μL 时，EP-PCR 产物
浓度分别只达到 25 ng/μL 和 40 ng/μL ；当模板浓度
达到 1 ng/μL 时，EP-PCR 产物浓度增加到 85 ng/μL ；
增加模板浓度至 2 ng/μL 时，EP-PCR 产物量没有显
著提高（90 ng/μL）。因此，EP-PCR 反应体系中模板
浓度为 1 ng/μL 时，可以获得较多的产物。
M
500
bp
1 2 3 4
M：DNA marker；1-4：EP-PCR 反应体系中模板浓度分别为 0.1、0.5、
1 和 2 μg/mL
图 1 反应体系中模板浓度对 EP-PCR 的影响
2.2 EP-PCR反应体系循环数的优化
为了研究循环数对 EP-PCR 产物浓度的影响，
将 EP-PCR 反 应 体 系 中 的 循 环 数 设 为 20、25、30
和 35（反应体系中模板浓度为 1 ng/μL），并利用
NanoDrop 检测对应的产物浓度，结果如图 2。当
扩增只进行 20 个循环时，EP-PCR 产物浓度约 35
ng/μL ；循环数增加至 25 时，产物浓度提高至约 85
ng/μL ；循环数增加至 30 和 35 时，产物浓度分别为
83 ng/μL 和 88 ng/μL。可见达到 25 个循环后，产物
浓度达饱和，增加循环数，并不能提高产物的浓度。
因此，EP-PCR 反应体系最佳的循环数为 25。
M
500
bp
1 2 3 4
M ：DNA marker ；1 ：EP-PCR 反应体系循环数为 20 ；2 ：EP-PCR
反应体系循环数为 25 ；3 ：EP-PCR 反应体系循环数为 30 ；4 ：EP-
PCR 反应体系循环数为 35
图 2 循环数对 EP-PCR 的影响
2.3 EP-PCR反应体系中Mg2+浓度的优化
为了优化易错 PCR 的反应条件，达到所需要的
突变率（1%-5%），将反应体系的模板浓度和循环
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第6期214
数分别设为 1 ng/μL 和 25，以不同的 Mg2+ 浓度：4、6、
8 、10、12 和 15 mmol/L 分别进行了易错 PCR 反应，
结果如图 3。Mg2+ 浓度在 4 -10 mmol/L 范围内可扩
增出单一的目的条带且产物浓度均达到约 90 ng/μL ；
当 Mg2+ 浓度为 12 mmol/L 时虽然扩增出了目的条带
但也出现了较多的非特异性条带 ；而 Mg2+ 浓度增加
至 15 mmol/L 时产物出现弥散现象，没有扩增出特
dCTP、dTTP 和模板浓度固定不变分别为 10 mmol/L、
0.5 mmol/L、0.2 mmol/L、0.2 mmol/L、1 mmol/L、
1 mmol/L 和 1 ng/μL， 进 行 25 个 循 环。 第 2 和 第 3
论 EP-PCR 的模板分别为第 1 轮 EP-PCR 和第 2 轮
EP-PCR 的回收产物，模板的添加量为 1%（V/V），
每轮随机挑选 10 个突变体进行克隆并测序。经过 3
轮 EP-PCR，突变率可达到 1.1%-4.0%（表 3）。变
启动子的序列各不相同，突变碱基分布在整个启动
子序列，无明显规律。连续进行 3 次 EP-PCR 突变
率为 4.0%，达到了预期的突变率，可用于 GAP 启
动子的突变。
表 3 经过 3 轮易错 PCR 反应后的突变率
突变条件 突变碱基数 突变率（%）
EP-PCR 第 1 轮 5.00±2.83 1.10
EP-PCR 第 2 轮 10.67±2.50 2.24
EP-PCR 第 3 轮 19.00±3.60 3.99
2.5 应用优化后EP-PCR对GAP启动子进行突变
为了检测突变启动子强度，构建了突变启动子
调控报告基因（酵母增强型绿色荧光蛋白 yEGFP 基
因 egfp）表达载体及对应重组菌，通过测定重组菌
yEGFP 荧光强度以检测对应的突变启动子强度。
首 先 以 质 粒 pGAP Z 为 模 板， 用 引 物 GAP-
EPf/GAP-EPr（表 1）经 EP-PCR 获得突变的 GAP 启
动子，经限制性内切酶 Spe I 和 Not I 双酶切，将突
变的 GAP 启动子混合片段与经 Spe I 和 Not I 双酶切
后载体 pGHg［11］连接，获得重组混合质粒，将这
些重组混合质粒用限制性酶 Bspe I 酶切线性化，电
转毕赤酵母 GS115，获得突变 GAP 启动子重组毕赤
酵母细胞库。转化后涂布 MD 平板，30℃倒置培养
3-5 d，直到单克隆出现。随机挑选 30 个克隆，采
用菌落 PCR 鉴定转化子，PCR 所用引物分别为 GAP
primer 和 GFP-r（表 1），阳性克隆 PCR 条带理论大
小约 800 bp。图 4 的结果表明，毕赤酵母 GAP 突变
启动子细胞库构建成功。
利用 48 深孔板，通过高通量筛选方法［11］筛
选所构建的突变体，并用荧光酶标仪检测重组菌的
yEGFP 荧光强度。随机挑取了 250 个突变子进行筛
选，检测到荧光强度较重组菌 G/GHg（野生型 GAP
启动子调控 yEGFP 表达菌株）显著提高的重组菌
M
500
bp
1 2 3 4 5 6
M ：DNA marker ；1-6 ：EP-PCR 反应体系中 Mg2+ 浓度依次为 4、6、
8、10、12 和 15 mmol/L
图 3 Mg2+ 浓度对 EP-PCR 的影响
异性条带。
将各 Mg2+ 浓度反应产物克隆至载体 pMD18-T 并
分别随机挑选 10 个突变子测序以统计其突变率。结
果如表 2，Mg2+ 离子浓度为 4 mmol/L 时所产生的突
变率较低只有 0.6%，而 Mg2+ 离子浓度为 10 mmol/L
时产生的突变率为 1.1%。6 mmol/L 和 8 mmol/L 的
Mg2+ 浓 度 易 错 PCR 反 应 突 变 率 分 别 为 0.74% 和
0.83%。这些突变序列与野生型 GAP 启动子序列相
比，突变碱基分布在整个启动子序列，无明显规律。
试验表明 Mg2+ 离子浓度为 10 mmol/L 时产生的突变
率较适中能满足试验要求，因此，EP-PCR 反应体系
的 Mg2+ 离子浓度为 10 mmol/L。
表 2 不同反应条件易错 PCR 的突变率
Mg2+ 浓度 突变碱基数 突变率（%）
4 mmol/L 2.80±1.41 0.59
6 mmol/L 3.52±2.14 0.74
8 mmol/L 3.95±2.20 0.83
10 mmol/L 5.00±2.83 1.10
2.4 连续进行多轮EP-PCR以提高突变率
为了增加 EP-PCR 的突变率，在第 1 轮 EP-PCR
的 基 础 上 又 进 行 第 2 或 第 3 轮 的 EP-PCR。 试 验
中，EP-PCR 反应体系的 Mg2+、Mn2+、dATP、dGTP、
2014年第6期 215秦秀林等 ：优化易错 PCR 条件以提高毕赤酵母 GAP 启动子文库突变效率
（G/GaHg、G/GbHg、G/GcHg、G/GdHg 和 G/GeHg）
5 个，其荧光强度值见表 4。为了验证这些重组菌
的 yEGFP 荧光强度改变确实是由于启动子序列突变
引起，将突变 GAP 启动子序列克隆并测序。测序结
果表明重组菌中对应的突变启动子 Ga、Gb、Gc、Gd
和 Ge 的序列各不相同（图 5），与野生型 GAP 启动
子序列相比，突变碱基分布在整个启动子序列，无
明显规律。这一结果表明重组菌中的启动子序列确
实发生了突变，重组菌 yEGFP 表达强度不同也确实
是由启动子的突变引起，利用优化条件后 EP-PCR
能高效筛选到有益突变子（启动子强度增强）。
表 4 含突变启动子重组菌的绿色蛋白荧光强度
菌株
比荧光强度 F/OD600
（RFU/ OD600）
相对荧光强度
G/GHg 含 GAP 启动子 185±16 1
G/GaHg 含 Ga 启动子 240±14 1.30±0.08
G/GbHg 含 Gb 启动子 231±16 1.25±0.09
G/GcHg 含 Gc 启动子 420±23 2.27±0.12
G/GdHg 含 Gd 启动子 252±17 1.36±0.09
G/GeHg 含 Ge 启动子 265±17 1.43±0.09

3 讨论
EP-PCR 是一种简便 快 速 地 在 DNA 序 列 中 随
机制造突变的方法，而且 EP-PCR 方法对目的基
因没有片段大小的限制，并且因为序列具有几乎
100% 的均一性，所以得到的克隆在遗传学上比较
稳定。与传统的随机突变中常用的亚硝基胍相比，
EP-PCR 突变获得的突变文库，其性状的多样性远
远 大 于 致 死 率 为 40%-50% 时 亚 硝 基 胍 的 突 变 效
果［12］。然而利用 EP-PCR 进行随机突变，一般 1 kb
目标基因内只有 1.5-6.6 个碱基发生碱基替换（突变
率 ：0.15%-0.66%）［13，14］，而目标基因的突变率在
1%-5% 范围时才能获得较多的有益突变以达到理
想的诱变结果［9，10］。因此，为了获得大量的具有丰
富突变的启动子并增加启动子的突变效率（1%-5%
范围）必须对 EP-PCR 反应条件进行优化。常规方
式是通过改变传统 PCR 反应体系中某些组分的浓
度，如模板、dNTP（不同的脱氧核糖核酸配比浓
度 ）［15］、Mn2+［16］ 和 Mg2+ 的 浓 度， 使 碱 基 在 一 定
程度上随机错误而创造序列的多样性。其中，Mn2+
浓度通常为 0.5 mmol/L，而为了避免碱基突变的偏
向 性 dATP∶dGTP∶dCTP∶dTTP 的 比 例 通 常 设 为
1∶1∶5∶5［17］。因此，本研究中将 EP-PCR 反应体
系的 Mn2+、dATP、dGTP、dCTP、dTTP 浓度固定不
变分别设为 0.5、0.2、0.2、1 和 1 mmol/L，在此条件下，
研究了 EP-PCR 反应中模板浓度、循环数和 Mg2+ 浓
度对其影响。
EP-PCR 反应体系中模板的初始浓度会影响基
因的突变效率和扩增产物的量。反应体系中模板的
初始浓度越低，模板所经历的扩增次数越多，最后
产物中积累的突变位点越多，即突变效率越高［18］；
而提高反应体系中模板的初始浓度，突变效率会降
低［19］但最终扩增到的产物量会增加。本研究优化
EP-PCR 反应体系中模板浓度（1 ng/μL）后，在获得
较多产物同时保证了目的基因较高的突变率。
在优化 EP-PCR 反应体系循环数的过程中也发
现 25 个循环得到的产物浓度可达到约 85 ng/μL，再
增加循环数，产物的浓度并没有增加。这是因为在
一定倍增次数范围内，EP-PCR 反应过程中目的基
因倍增次数与突变效率相关，即目的基因倍增次数
越高产生的突变位点越多，同时形成的目的产物
浓度也越高 ；但扩增产物达到一定浓度后（5-50
ng/μL）［20］，增加循环数并不能提高产生的量。
很多研究显示，易错 PCR 的突变率受 Taq 酶保
真性的影响。加入 Mn2+ 后，Taq 酶保真性随着反应
体系中 Mg2+ 的浓度增加而降低。为了增加 EP-PCR
的突变率，可以在第 1 轮 EP-PCR 的基础上又进行
M
800
bp
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
M
800
bp
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
A
B
（A）PCR 鉴定重组菌 ；M ：DNA Marker ；1-15 ：重组菌 ；6 ：阳性对照（以
质粒 pGHg 为模板）；17：阴性对照（以 GS115 为模板）。（B）PCR 鉴定重组菌；
M ：DNA Marker ；1 ：阳性对照（以质粒 pGHg 为模板）；2 ：阴性对照（以
GS115 为模板）；3-17 ：重组菌
图 4 毕赤酵母 GAP 突变启动子重组菌菌落 PCR 验证
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第6期216
第 2 或 第 3 轮 的 EP-PCR［21］。EP-PCR 反 应 体 系 的
Mg2+ 离子浓度达到 10 mmol/L 时 GAP 启动子产生的
突变率达到了 1.1%，经过 3 轮连续 EP-PCR，GAP
启动子突变率的范围为 1.1%-4.0%，符合产生有益
突变较多突变率范围（1%-5%）。利用优化后 EP-
PCR 对 GAP 启动子进行突变，通过高通量筛选 250
个突变子，获得 5 个启动子强度高于野生型 GAP 启
动子的突变体，有益突变达到了 2%。
4 结论
本研究对 EP-PCR 反应中模板浓度、循环数和
Mg2+ 浓度分别进行了优化，优化条件后，经过 3 轮
EP-PCR，突变率可达到 1.1%-4.0%。利用优化后的
EP-PCR 反应条件对 GAP 启动子进行突变，筛选了
250 个突变子，可挑选出启动子强度较野生型 GAP
启动子显著提高的突变子 5 个。
参 考 文 献
［1］ Braatsch S, Helmark S, Kranz H, et al. Escherichia coli strains with
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way for transcriptional fine-tuning［J］. Biotechniques, 2008, 45（3）：
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［2］ Siegl T, Tokovenko B, Myronovskyi M, et al. Design, construction
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gene expression in actinomycetes［J］. Metabolic Engineering,
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［3］ Rytter JV, Helmark S, Chen J, et al . Synthetic promoter
l ibraries for Corynebacterium glutamicum［J］ . Applied
Microbiology and Biotechnology, 2014, Published online.
［4］ Alper H, Fischer C, Nevoigt E, et al. Tuning genetic control through
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Sciences of the United States of America, 2005, 102（36）：12678-
12683.
灰色突出显示部分为突变位点
图 5 突变 GAP 启动子序列比对
401
Ga401
Gb401
Gc401
Gd401
Ge400
GA P401
301
Ga301
Gb301
Gc301
Gd301
Ge300
GA P301
201
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Gb201
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Ge200
GA P201
101
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1
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GA P 1
1 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
101 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200
201 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300
301 310 320 330 340 350 360 370 380 390 400
401 410 420 430 440 450 460 477
2014年第6期 217秦秀林等 ：优化易错 PCR 条件以提高毕赤酵母 GAP 启动子文库突变效率
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（责任编辑 李楠）