全 文 ：摇 核 农 学 报摇 圆园员猿袁圆苑渊缘冤院园远园苑 耀 园远员圆允燥怎则灶葬造 燥枣 晕怎糟造藻葬则 粤早则蚤糟怎造贼怎则葬造 杂糟蚤藻灶糟藻泽
收稿日期院圆园员圆鄄园怨鄄圆员摇 接受日期院圆园员猿鄄园员鄄员远
基金项目院国家自然科学基金渊猿园圆苑园愿缘缘冤
作者简介院高义平渊员怨远愿鄄冤袁女袁河北高阳人袁高级农艺师袁主要从事种质资源创新与遗传育种研究遥 耘鄄皂葬蚤造院遭凿早赠责岳 员圆远援 糟燥皂
文章编号院员园园园鄄愿缘缘员渊圆园员猿冤园缘鄄园远园苑鄄园远
易错 孕悦砸研究进展及应用
高义平员袁圆 摇 赵摇 和员 摇 吕孟雨员 摇 杨学举圆 摇 王海波员
渊员河北省农林科学院遗传生理研究所 辕河北省植物转基因中心袁石家庄摇 园缘园园缘员曰
圆 河北农业大学农学院袁保定摇 园苑员园园园冤
摘摇 要院易错 孕悦砸是目前最简单尧有效的一种基因体外随机诱变技术袁是农业尧工业尧生物制药等领域获
得优异基因的重要手段遥 本文综述了易错 孕悦砸的基本原理尧方法尧发展历程袁以及该技术的最新研究成
果尧成功应用领域袁并提出了目前存在的问题和可能解决途径遥
关键词院易错 孕悦砸曰 随机诱变曰 研究进展
摇 摇 孕悦砸是一种 阅晕粤片段体外复制技术袁但常有一定
的碱基错配发生袁一般错配率为 员园 原远 耀 员园 原缘遥 碱基错
配虽然降低了 阅晕粤 序列复制的保真性袁但对获得新
阅晕粤序列提供了一种可利用的突破口遥 于是袁便出现
了易错 孕悦砸 技术 渊 耘则则燥则鄄责则燥灶藻 孕悦砸袁 藻责孕悦砸冤遥 易错
孕悦砸是通过改变 孕悦砸条件袁提高扩增产物的碱基错配
率袁从而获得与原来不同的 阅晕粤序列或基因遥
易错 孕悦砸作为一种简便尧有效地获得 阅晕粤 序列
变异的技术袁主要是针对特定的基因袁这在遗传和基因
改良研究中具有巨大的应用前景袁但是目前尚无系统
的归纳总结遥 为此袁本文综述了易错 孕悦砸 的概念尧原
理尧方法尧研究进展尧应用情况以及存在的问题袁以期为
基因体外诱变工作者提供参考遥
员摇 易错 孕悦砸的概念和基本原理
员郾 员摇 易错 孕悦砸的概念
易错 孕悦砸袁意为易错条件下的 孕悦砸袁即容易使复
制出的 阅晕粤 序列出现错误的 孕悦砸 技术袁又称错配
孕悦砸或倾向错误 孕悦砸袁是指通过利用低保真度 栽葬择
阅晕粤聚合酶和改变 孕悦砸 反应条件袁降低 阅晕粤 复制的
保真度袁在新 阅晕粤 链合成过程中增加碱基错配袁从而
使扩增产物出现较多点突变的一种体外诱导 阅晕粤 序
列变异的方法遥
在 圆园 世纪 缘园 耀 愿园 年代袁随着 阅晕粤 体外合成尧复
制理论和技术的逐渐成熟袁很多人对 阅晕粤 体外合成尧
复制过程中发生碱基代换的诸多影响因素进行研究袁
以提高基因体外合成的精确性曰同时袁还有很多研究者
在积极寻求能够诱导基因产生各种可能变异的有效方
法袁来模仿自然界核酸尧蛋白质的进化过程遥 蕴藻怎灶早
等咱员暂受以上两个不同研究方向的启示袁提出了基因在
易错 孕悦砸条件下产生变异袁可以构建突变体库的观
点袁并建立了易错 孕悦砸 技术体系遥 该体系于 员怨怨圆 年
经 悦葬凿憎藻造造和 允燥赠糟藻咱圆暂进一步发展得到了完善袁目前广
泛应用的易错 孕悦砸技术多是参照他们的做法遥
员郾 圆摇 易错 孕悦砸的基本原理
员郾 圆郾 员摇 碱基的异构为错配提供了可能摇 组成 阅晕粤的
源 种碱基都有互变异构体存在袁其中鸟嘌呤渊郧冤尧胞嘧
啶渊悦冤和胸腺嘧啶渊栽冤猿 种含氧碱基有酮式和烯醇式
两种互变异构体袁腺嘌呤渊粤冤和胸腺嘧啶两种含氮碱
基有胺式尧亚胺式两种互变异构体遥 郧尧悦 和 栽 主要以
酮式结构存在袁烯醇式结构的比率极低袁粤和 栽两种含
氮碱基上的氮原子主要以氨基渊晕匀圆冤状态存在袁以亚
胺基渊晕匀冤状态存在的比率极低咱猿暂 遥 不同同分异构体
之间氢原子位置的不同袁及同一位置电子云偏离方向
的不同袁可使得碱基的配对形式发生改变袁这样在复制
后的子链上就可能出现错配遥 例如当胸腺嘧啶以酮式
结构存在时袁与腺嘌呤配对袁以烯醇式结构存在时袁与
鸟嘌呤配对袁这样就出现了 粤能配上 悦尧栽能配上 郧的
不稳定碱基对袁从而造成错配咱源 原 缘暂 遥
早在 员怨缘猿 年袁当 宰葬贼泽燥灶 和 悦则蚤糟噪咱远暂提出 阅晕粤 双
螺旋结构之后袁就提出了在 阅晕粤复制过程中出现错配
苑园远
核摇 农摇 学摇 报 圆苑 卷
的原因袁可能为碱基异构体的存在造成了碱基的错配遥
由于这种 粤窑悦尧栽窑郧的含量极低袁至今没有分离到其结
晶体袁所以这一结论目前还停留在生物化学的理论阶
段遥
员郾 圆郾 圆摇 阅晕粤聚合酶的保真性可以通过改变反应条件
降低 摇 所有的 阅晕粤 聚合酶在催化 阅晕粤 复制的过程
中都会出现碱基的错配袁不同的 阅晕粤聚合酶出错率不
同咱源袁苑 原 怨暂 遥 在已知的几种耐热 阅晕粤 聚合酶中袁 栽葬择
阅晕粤聚合酶的错配率最高咱员园 原 员员暂 遥 栽葬择 阅晕粤 聚合酶是
发现的耐热 阅晕粤聚合酶中活性最高的一种袁具有 缘忆要
猿忆外切酶活性袁不具 猿忆要缘忆外切酶活性袁因此在合成中
对某些单核苷酸错配没有校正功能袁所以比有 猿忆要缘忆
校对活性的 阅晕粤聚合酶发生错配的概率较高咱员圆暂 遥
栽葬择阅晕粤聚合酶的最大特点是在高温下保持酶活
性袁正是由于这一特点才使得 孕悦砸 技术得以广泛应
用袁而 栽葬择 阅晕粤聚合酶催化 阅晕粤 复制时出现较低概
率的碱基错配又为人们改变基因提供了可能遥 不过袁
正常情况下这一错配率并不足以诱变一个基因袁还需
要对 孕悦砸反应条件进行改变袁以降低其忠实度遥 通过
改变 孕悦砸反应条件可以使 栽葬择 阅晕粤 聚合酶的错误率
得到显著放大遥 根据 孕悦砸 不同的目的袁对 阅晕粤 聚合
酶种类尧性能做了更多研究袁为了使 阅晕粤复制更严谨袁
发展出了高保真酶曰为了使 阅晕粤 复制时变异率提高袁
以便得到突变体库袁有人试验了选择那种聚合酶尧如何
来降低酶的保真性袁等等遥
阅晕粤聚合酶的保真性可以通过多种方法来降低袁
包括使用 源 种浓度不同 凿晕栽孕尧添加 酝灶圆 垣 尧提高 酝早圆 垣
浓度等遥 几种诱变方法导致扩增 阅晕粤 链碱基变异的
机理各不相同遥 酝灶悦员圆是很多 阅晕粤 聚合酶的诱变因
子袁加入 酝灶圆 垣可以降低聚合酶对模板的特异性袁提高
错配率咱员源暂 曰源 种 凿晕栽孕泽浓度的不平衡可以提高碱基错
误掺入的概率袁实现错配咱员源 原 员愿暂 曰酝早圆 垣具有激活 栽葬择 酶
的作用袁增加 酝早圆 垣浓度袁使之超过正常用量袁能稳定非
互补的碱基对咱员怨 原 圆园暂 曰提高 栽葬择 阅晕粤 聚合酶用量尧增加
每个循环延伸时间袁可以增加错配终端延伸的概率曰降
低起始模板浓度袁会使后面 孕悦砸循环的变异模板比例
增加遥
圆摇 易错 孕悦砸技术的发展历程
圆郾 员摇 易错 孕悦砸基本技术体系的建立与完善
易错 孕悦砸技术是采用多种方法提高 阅晕粤 聚合酶
的碱基错配率袁并稳定非互补碱基对遥 改变 孕悦砸反应
条件的方法主要有 源 种袁一是使用低保真度 栽葬择酶尧并
加大 栽葬择酶用量曰二是调整反应体系中 源 种 凿晕栽孕 的
浓度袁使之非 员颐 员颐 员颐 员的平衡浓度关系曰三是在反应体
系中加入一定量的 酝灶圆 垣 曰四是增加反应体系中的
酝早圆 垣浓度遥 此外袁降低起始模板浓度尧增加每个循环
的延伸时间尧提高反应体系 责匀 值尧增加循环次数等也
都可以明显提高诱变率遥 几种方法可单独使用袁但更
多的时候是综合使用袁以求最简单尧快捷的得到更多的
突变子遥
在 蕴藻怎灶早等咱员暂提出的易错 孕悦砸体系中袁易错 孕悦砸
的变异带有强烈的倾向性袁即 粤窑栽寅郧窑悦 的变异率
明显高于 郧窑悦寅粤窑栽 的变异率遥 在 悦葬凿憎藻造造 和
允燥赠糟藻咱圆暂修正的体系中 粤窑栽寅郧窑悦 与 郧窑悦寅粤窑栽
变异比率接近袁这样袁基因的诱变文库会有更好的多样
性袁并且不会造成不同碱基含量的显著变化遥 目前常
用的标准易错 孕悦砸 方法是参考 悦葬凿憎藻造造 等咱圆员暂的方案
形成的袁即院员园园滋蕴 反应体系袁含 苑皂皂燥造窑蕴 原员 酝早悦造圆袁
园郾 缘皂皂燥造窑蕴 原员 酝灶悦造圆袁缘园皂皂燥造窑蕴 原员 运悦造袁员园皂燥造窑蕴 原员 栽则蚤泽鄄
悦造袁责匀 愿郾 猿渊圆缘益冤袁员皂皂燥造窑蕴 原员 凿栽栽孕和 凿悦栽孕袁园郾 圆皂皂燥造
窑蕴 原员 凿粤栽孕和 凿郧栽孕袁缘哉 的 栽葬择阅晕粤 聚合酶曰退火温度
的基本设计原则是宜低不宜高曰反应不进行热启动和
末端延伸遥 易错 孕悦砸 诱变出现的最多变异类型是点
突变袁删除引起的移框突变也偶有出现遥
常规的 孕悦砸 员园园滋蕴 反应体系含 员郾 缘皂皂燥造窑蕴 原员
酝早悦造圆尧圆郾 缘哉 的 栽葬择阅晕粤 聚合酶曰不含 酝灶悦造圆曰 源 种
凿晕栽孕全部为 园郾 圆皂皂燥造窑蕴 原员遥 即在易错 孕悦砸 诱变体系
中袁酝早圆 垣浓度提高 源郾 苑 倍袁栽葬择阅晕粤 聚合酶提高 圆 倍袁
添加 酝灶圆 垣 袁提高 缘 倍的一种或两种 凿晕栽孕 浓度遥 按以
上标准易错 孕悦砸体系进行诱变袁可构建无序列倾向性
的基因随机点突变库袁每个核苷酸的突变率约为 远郾 远
伊 员园 原猿遥
砸蚤藻凿藻造的研究结果显示袁易错 孕悦砸 要根据情况选
择最佳反应条件遥 一般增加 凿粤栽孕和 凿栽栽孕 浓度时袁宜
选择含有 悦燥圆 垣 的 月怎枣枣藻则曰而增加 凿悦栽孕 和 凿郧栽孕 浓度
时袁宜选择含有 酝灶圆 垣的 月怎枣枣藻则遥 孕悦砸 反应缓冲液中的
运 垣有利于扩增大于 缘园园 遭责长度的 阅晕粤 片段咱圆圆暂 遥
陈晓穗等咱圆猿暂通过对错配 孕悦砸 致突变条件研究认
为袁增加 凿栽栽孕 和 凿悦栽孕 浓度的致突变效果优于增加
凿粤栽孕 和 凿郧栽孕 的效果曰使用 缘 皂皂燥造窑蕴 原员 酝早悦造圆尧园郾 缘
皂皂燥造窑蕴 原员 酝灶悦造圆尧凿栽栽孕 和 凿悦栽孕 浓度提高到 员 皂皂燥造窑
蕴 原员的条件下袁经 圆 轮 孕悦砸渊共 远园 个循环冤碱基错配率
可达 圆郾 源豫 遥 其突变类型有明显偏向性袁以 粤 辕 栽 的突
变为主袁转换多于颠换遥
由 悦葬凿憎藻造造 和 允燥赠糟藻咱圆暂完善的易错 孕悦砸 技术是通
过增加 阅晕粤聚合酶的错误率来诱导基因变异袁这种方
愿园远
摇 缘 期 易错 孕悦砸研究进展及应用
法得到的诱变率在 园郾 远豫 耀 圆郾 园豫 辕 遭责 辕 孕悦砸 之间袁目前
这种诱变方法已经很成熟袁很多大型生物试剂公司都
有了这种基因体外诱变方法的试剂盒遥 利用试剂盒诱
变虽然简单袁但类型单一袁因此在实际操作中袁常常根
据不同的实验目的对易错 孕悦砸 进行修改尧补充和完
善遥
圆郾 圆摇 连续易错 孕悦砸
在通常情况下袁经一轮的易错 孕悦砸尧定向筛选袁很
难获得令人满意的结果袁由此发展出了连续易错 孕悦砸
渊杂藻择怎藻灶贼蚤葬造 藻则则燥则鄄责则燥灶藻 孕悦砸冤袁该方法是将一次 孕悦砸扩
增得到的有益突变基因作为下一次 孕悦砸扩增的模板袁
连续反复进行随机诱变袁使得每一次获得的少量有益
突变累积而产生重要的有益突变遥 连续两轮 孕悦砸袁或
连续多轮易错 孕悦砸袁突变率可增至一轮易错 孕悦砸 的 猿
倍咱圆员暂 遥
诱变技术的基本要求是创造尽可能多的突变体袁
但碱基突变率并非越高越好袁因为有益突变通常要比
有害突变的变异率低很多袁一个突变分子中所含的有
益突变很有可能会被同时存在的有害突变所抵消或淹
没遥 因此袁连续易错 孕悦砸要根据基因具体情况设计每
一轮 孕悦砸的诱变率袁建立突变体库袁通过高通量筛选袁
获得有益突变袁然后再以其为模板袁进行第二轮易错
孕悦砸袁不断富集有益基因遥
圆郾 猿摇 与 阅晕粤改组尧模板交错延伸等的联合应用
易错 孕悦砸技术在体外分子进化的研究中袁可以
单独使用遥 随着 阅晕粤 改组渊 阅晕粤 泽澡怎枣枣造蚤灶早冤 咱圆源暂和模
板交错延伸渊杂贼耘孕冤 咱圆缘暂等技术方法的出现袁易错 孕悦砸
还可以和这些方法联合使用袁实现变异圃广尧变异率
高尧有益基因出现频率高尧筛选变异工作量小的最终
目的遥
阅晕粤改组是指将一组相关 阅晕粤 序列切割成随机
片段后通过 孕悦砸进行重新聚合袁从而产生突变体遥 模
板交错延伸是一种简化的 阅晕粤改组技术袁是将模板混
合后进行短暂的复性和延伸反应袁这样在每个循环中袁
延伸的片段在复性时会与不同的模板配对袁最终合成
全长 阅晕粤序列遥 它省去了 阅晕粤 改组中的酶切程序遥
阅晕粤改组技术相当于一组相关基因不同序列间的重
新排列组合袁因此诱变的有益突变率相对较高遥
易错 孕悦砸 多用于高频率诱变单个基因袁与 阅晕粤
改组技术联合应用可以集二者的优点袁这样不仅可以
对单一基因进行易错 孕悦砸 随机诱变袁创造新的基因袁
还可以将易错 孕悦砸获得的有益基因改组袁进行序列间
的重新编排袁从而获得不同种尧属基因家族里基因序列
变异圃更广尧功能更强的基因遥 一般做法是先用易错
孕悦砸引入点突变袁构建起始基因文库袁筛选出所有良
性克隆袁再以此作为亲本基因进行 阅晕粤 改组袁使得有
益突变迅速积累袁基因功能明显提高遥 而且袁这样所建
的突变体库小袁定向进化效果显著遥 也可以进行多轮
改组袁得到更好的结果咱圆远暂 遥 因此袁易错 孕悦砸 与 阅晕粤
改组联合应用逐渐成为基因诱变的主要方法之一遥
粤灶等咱圆苑暂将易错 孕悦砸 与模板交错延伸相结合袁并
使之在同一 孕悦砸管内进行袁简化了操作程序遥 具体操
作过程为院以 员缘 个以下循环的易错 孕悦砸 引入随机变
异袁孕悦砸诱变产物经乙醇沉淀纯化后袁再作为模板和
引物袁直接进行交错延伸程序进行 阅晕粤重组遥 该方法
以腺苷甲硫氨酸 渊粤凿燥酝藻贼冤 合成酶基因 泽葬皂员 的诱变
为例袁建库证实有效袁并得到了在体内表达量增加
缘远豫的突变子遥
圆郾 源摇 易错 孕悦砸诱变方法的补充与完善
易错 孕悦砸为以 孕悦砸为基础的诱变开辟了一条新
路袁不少学者在沿着这条路寻找新的或更加完善尧更加
简便的诱变技术袁如醇介导的易错 孕悦砸尧易错 孕悦砸 与
交错延伸联合简化诱变方法袁以及碱基类似物与易错
孕悦砸混合使用方法等遥
悦造葬增藻葬怎咱圆愿暂研究了醇介导的易错 孕悦砸遥 即在 孕悦砸
反应体系中加入异丙醇尧丙醇或丁醇袁根据酶的耐热性
和醇的疏水性不同袁醇的临界浓度也不同遥 醇的临界
浓度一般随着聚合酶抗热性增加而提高袁随醇自身的
疏水性提高而降低遥 研究显示醇的疏水性是影响聚合
酶构象的重要因素遥 当丙醇在体系中的体积比为
苑郾 园豫 到 愿郾 园豫时诱变率可以达到 怨郾 愿 伊 员园 原猿 辕 遭责 辕
孕悦砸遥 这一条件下优先得到碱基 郧 和 悦 的改变袁而与
此相反袁标准易错 孕悦砸优先改变碱基 粤和 栽遥 丙醇与
酝灶悦造圆作用方式不同袁丙醇对聚合酶保真性降低的作用
是对聚合酶稳定性精细调节的结果遥
以上的易错 孕悦砸研究全部采用改变 孕悦砸 反应条
件袁来提高 阅晕粤 聚合酶错误率的方法进行袁也有人尝
试通过修饰 阅晕粤聚合酶来提高常规 孕悦砸错配率的研
究遥 月藻灶躁葬皂蚤灶 和 悦燥灶灶燥造造赠 于 圆园园源 年报道了一个 孕枣怎
阅晕粤聚合酶的变种在易错 孕悦砸 反应中表现出极好的
性能遥 孕枣怎 阅晕粤聚合酶有两个 琢螺旋构成了聚合酶的
指状子域袁这一区域负责将碱基与模板链正确地互补
配对遥 当两个 琢 螺旋之间的关键氨基酸发生变异袁与
缺失 猿忆要缘忆核酸外切酶活性同时发生时袁一个高保真
野生型聚合酶就变为了一个低保真聚合酶遥 这个 孕枣怎
阅晕粤聚合酶变种能够在标准 孕悦砸 反应条件下用于诱
变基因袁并得到高频率尧几乎没有任何倾向的变异咱圆怨暂 遥
这些都是对易错 孕悦砸研究的新探索和有益补充遥
怨园远
核摇 农摇 学摇 报 圆苑 卷
猿摇 易错 孕悦砸技术的应用及发展前景
易错 孕悦砸从概念提出尧体系完善至今已被广泛应
用于生物工程的各个领域遥
猿郾 员摇 易错 孕悦砸技术为特种工业酶的改造提供了有效
的工具
工业酶的催化反应通常处于高温尧有机溶剂尧氧化
剂尧极端酸碱等存在的环境遥 在自然界进行选择袁根本
无法筛选到能在上述恶劣条件下完成催化反应的酶遥
运用易错 孕悦砸技术袁在人工模拟环境下进行选择袁已
经成功地得到了各种特种功能的工业酶袁可满足工业
生产的特殊需要遥 例如袁 在澡葬燥 等咱猿园暂 利用连续易错
孕悦砸获得了枯草杆菌蛋白酶基因的随机点突变袁并用
交错延伸方法重组 阅晕粤袁连续提高培养温度对突变体
进行筛选袁最终获得一株突变体 耘缘鄄猿匀缘袁不仅将酶的
最适温度提高了 员苑益袁 还使酶在 远缘益的半衰期增加
了 圆园园 倍遥 淀粉蔗糖酶是一种催化蔗糖合成直链淀粉
的酶袁孕燥贼燥糟噪蚤鄄灾藻则燥灶藻泽藻等咱猿员暂利用易错 孕悦砸 和 阅晕粤 改
组技术对其进行突变袁得到催化蔗糖活性提高 远园豫的
突变体 粤泽灶猿愿苑粤泽责遥 易错 孕悦砸是蛋白质分子体外定向
进化研究最早采用的一种构建基因文库的方法袁尤其
是在酶分子诱变上研究应用最多遥
猿郾 圆摇 在农业生物技术中的应用
中国科学院遗传所朱祯实验室采用易错 孕悦砸 方
法获得了水稻抗草甘膦突变基因 藻责泽责员园圆袁突变体对草
甘膦和磷酸烯醇式丙酮酸的亲和力分别达到 苑园 倍和
源郾 远倍咱猿圆暂 遥 苏军等咱猿猿暂将 藻责泽责 突变基因导入籼稻明恢
愿远袁对 栽猿 材料进行抗性检测袁显示种子萌发时对草甘
膦的抗性提高 员缘 倍袁三叶期对草甘膦的抗性提高 猿 耀
源 倍遥
在植物的遗传尧育种研究中袁最缺乏的已经不再是
转基因和常规杂交的手段袁而是缺乏优异基因遥 有了
专一性优异基因袁农业中的高产尧抗逆尧抗病虫尧抗除草
剂等新品种尧新材料就会快速脱颖而出遥 易错 孕悦砸 为
我们提供了一种实验室快速获得优质基因的手段遥
猿郾 猿摇 在医药研究中的应用
易错 孕悦砸技术已成为生物制药研究的有效工具遥
例如袁粘质沙雷氏菌是多种病症的致病菌遥 刘治江
等咱猿源暂以重组 耘援 糟燥造蚤 月蕴圆员渊阅耘猿冤责蕴赠泽杂 辕 责耘栽圆圆遭鄄悦澡蚤悦为
亲本袁采用易错 孕悦砸对粘质沙雷氏菌几丁质酶 悦 基因
渊悦澡蚤 悦冤进行定向进化袁经过两轮易错 孕悦砸袁建立突变
体文库袁通过筛选获得一个酶活较高的突变酶渊酝怎贼鄄
悦澡蚤 悦冤袁其催化活性为亲本重组酶的 员郾 怨 倍袁比活力为
出发菌酶活的 猿郾 猿 倍袁最适温度由 源园益提高到 远园益遥
对进化酶基因测序发现袁该基因所编码蛋白有 源 处氨
基酸被取代袁均为有义突变遥
此外袁易错 孕悦砸技术在基础理论研究尧生物制药尧
基因治疗尧疫苗研制尧石油化工等研究领域也具有广阔
的应用前景遥
源摇 应用特点及存在问题
易错 孕悦砸可以随机诱变任何一个克隆基因袁建立
突变体库袁从而扫描到理想性状的表达序列遥 诱变中
应注意选择最接近人们需要的基因作为起点袁若用于
理论研究袁应控制较低的突变率袁使突变多为单一氨基
酸取代袁这样才能将基因功能变化与突变表型一一对
应起来遥 第二个需要注意的问题是控制 阅晕粤 的合适
突变频率遥 如果 阅晕粤的突变频率太高袁产生的大多数
蛋白将失去活性袁如果突变频率太低袁突变位点过少袁
野生型的背景太高袁样品的多样性则较少袁不利于后续
的筛选和鉴定工作遥 对于每一 阅晕粤序列来说袁理想的
碱基置换率和易错 孕悦砸 的最佳条件依赖于随机突变
的目标 阅晕粤片段的长度遥 一般每代每序列有 圆 耀 猿 个
碱基置换或一个氨基酸替代较为适宜咱猿缘暂 遥
易错 孕悦砸方法虽然已广泛应用袁但还是存在一些
问题袁首要问题是碱基的变异具有倾向性咱圆袁缘暂 遥 即在
四种碱基比例不平衡的情况下袁粤窑栽寅郧窑悦 的变异
比率通常高于 郧窑悦寅粤窑栽 的变异比率袁这样就会影
响变异的多样性袁所以在用此方法诱变基因时袁一定要
注意选择诱变条件遥 二是易错 孕悦砸 产量和变异水平
偏低遥 较低的模板浓度以及引物与模板结合严格性的
降低袁使得目标片段的产量偏低由于碱基变异偏好尧转
换高于颠换咱圆员暂 袁造成变异圃较窄袁筛库得到有益基因
的概率降低遥 三是对模板的要求较高袁最好是只含目
的基因的 阅晕粤片段遥 孕悦砸在易错条件下进行时袁容易
造成引物与模板的错误结合袁形成大量与目的片段不
同长度的非特异扩增产物袁模板越长袁这种非特异扩增
的概率会越大遥 另外袁应用易错 孕悦砸时一般都要针对
具体基因进行诱变条件的优化袁需要优化的条件有多
个袁包括 酝灶圆 垣 浓度尧酝早圆 垣 浓度尧源 种 凿晕栽孕 浓度尧栽葬择
阅晕粤 聚合酶浓度尧模板浓度尧延伸时间尧循环次数等袁
这些条件综合起来优化还比较费力遥
针对以上问题袁可能的解决途径有以下几个院一是
从 栽葬择 阅晕粤 聚合酶的基本特性入手袁寻找新的影响酶
功能尧同时又不带来碱基变异偏好的因素袁开发更多的
易错 孕悦砸方法袁用于不同目的的诱变袁或寻求更佳的
园员远
摇 缘 期 易错 孕悦砸研究进展及应用
诱变方法遥 栽葬择 阅晕粤 聚合酶的基本性质中袁酝早圆 垣依赖
性和几种变性抑制剂对于酶的错误率有很大影响袁可
以做为研究的目标遥 在此研究方面袁 悦造葬增藻葬怎 等咱圆愿暂做
了成功的尝试袁通过醇的疏水性影响 栽葬择酶的构象袁提
高了碱基错配率遥 但醇介导的易错 孕悦砸出现了 郧窑悦
寅粤窑栽的变异偏好袁仍不理想遥 二是易错 孕悦砸 多种
诱变条件的简化遥 根据经验袁多种诱变条件对碱基错
配率的贡献不同袁对于贡献大的因素袁有 圆 耀 猿 个条件
即可得到 圆豫左右的碱基错配率袁这样就大大简化了
诱变前期的条件优化工作遥
随着研究的不断深入袁易错 孕悦砸 技术会日臻完
善袁并更多地应用到生命科学的各个领域袁创造更丰富
的资源尧更多的优异基因遥
参考文献院
咱 员 暂 摇 蕴藻怎灶早 阅 宰袁 悦澡藻灶 耘袁 郧燥藻凿凿藻造 阅 灾援 粤 皂藻贼澡燥凿 枣燥则 则葬灶凿燥皂
皂怎贼葬早藻灶藻泽蚤泽 燥枣 葬 凿藻枣蚤灶藻凿 阅晕粤 泽藻早皂藻灶贼 怎泽蚤灶早 葬 皂燥凿蚤枣蚤藻凿 责燥造赠皂藻则葬泽藻
糟澡葬蚤灶 则藻葬糟贼蚤燥灶咱允暂 援 栽藻糟澡灶蚤择怎藻袁 员怨愿怨袁 员院 员员 原 员缘
咱 圆 暂 摇 悦葬凿憎藻造造 悦袁 允燥赠糟藻 郧 云援 砸葬灶凿燥皂蚤扎葬贼蚤燥灶 燥枣 早藻灶藻泽 遭赠 孕悦砸 皂怎贼葬早藻灶藻泽蚤泽
咱允暂 援 孕悦砸 酝藻贼澡燥凿泽 葬灶凿 粤责责造蚤糟葬贼蚤燥灶泽援 员怨怨圆袁 圆院 圆愿 原 猿猿
咱 猿 暂 摇 沈 同袁 王镜岩援 生物化学渊第二版上册冤咱酝暂援北京院高等教育出
版社袁圆园园圆袁猿猿苑 原 猿猿愿
咱 源 暂 摇 杂蚤灶澡葬 晕 运袁 匀葬蚤皂藻泽 酝 阅援 酝燥造藻糟怎造葬则 皂藻糟澡葬灶蚤泽皂泽 燥枣 泽怎遭泽贼蚤贼怎贼蚤燥灶
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