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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011 年第 4 期
基于易错 PCR技术的黏质沙雷氏菌
脂肪酶基因 LipA的定向进化
陈英 朱绮霞 张搏 陈东 黄日波
(广西科学院非粮生物质酶解国家重点实验室 国家非粮生物质能源工程技术研究中心 广西生物炼制重点实验室，南宁 530007)
摘 要: 利用易错 PCR技术对黏质沙雷氏菌脂肪酶基因 LipA进行定向进化，经过筛选最终获得一个比活力比野生酶
提高了 425 U /mg的突变体 ep1，测序分析 ep1 有 5 个氨基酸发生了突变，与野生酶相比 ep1 的最适 pH值由原来的 8. 5 降低为
7. 5，Tm 值提高 3℃，Km值由原来的 40 mg /mL降低为 12. 5 mg /mL。对其三维结构进行分析，推测酶学性质的改变可能与处
在活性中心右前方双螺旋发卡结构上的 I58A、和处在下部 β卷曲折叠拐角处的 S375G的突变有关。
关键词: 黏质沙雷氏菌 脂肪酶 易错 PCR 定向进化
Directed Evolution of Serratia marcescens Lipase
Gene by Error-prone PCR
Chen Ying Zhu Qixia Zhang Bo Chen Dong Huang Ribo
(State Key Laboratory of Non-Food Biomass and Enzyme Technology，National Engineering Research
Center for Non-Food Biorefinery，Guangxi Academy of Science，Guangxi
Key Laboratory of Biorefinery，Nanning 530007)
Abstract: Directed evolution to Serratia marcescens Lipase gene-LipA by Error-prone PCR was carried out，and a final mutant ep1
was obtained whose specific activity increased 425 U /mg than the wild type． Sequence analysis showed that ep1 had 5 amino acid muta-
tions． Compared with the wild type enzyme． the optimum pH value of ep1 reduced from 8. 5 to 7. 5． Tm value increased 3℃ and Km val-
ue reduced from 40 mg /mL to 12. 5 mg /mL． By analyzing 3D structure，it speculated that the changes of the enzymatic properties may
be related with the site I58A and S375G，which respectively located in the double-helix in the right front of the active sites and curled
corner of β-sheet．
Key words: Serratia marcescens Lipase Error-prone PCR Directed evolution
收稿日期:2010-09-14
基金项目:生产生物柴油共性关键技术的研发———生物柴油生产用共性脂肪酶的技术和工艺研究(桂科攻 0895003-4-1)
作者简介:陈英，硕士，研究方向:微生物生物技术;E-mail:cy2008-5-1@ 163． com
通讯作者:黄日波，博士，教授，研究方向:发酵与酶工程;E-mail:rbhuang@ gxas． cn
生物柴油作为一种易降解、无污染的“绿色能
源”近些年引起了人们的广泛关注，成为新兴的石
油替代能源之一。它是一种含有不同单烷基酯的
混合物，可以由油和醇通过酯交换反应生成，利用
脂肪酶(EC 3. 1. 1. 3)作为催化剂催化这一反应，
不但反应条件温和，且反应副产物少，产物易于分
离。为了使自然界的脂肪酶能更好地应用于生
产，满足人类需求，对脂肪酶的研究也越来越广泛
和深入。
由于自然界获得的脂肪酶普遍活力较低、易受
甲醇抑制，使得生物柴油转化率较低，难以形成大规
模生产。随着基因工程和蛋白质工程技术的不断发
展，以及生物信息学对蛋白质功能分析的不断深入，
人们开始在分子水平上对酶的进行定向进化，实验
室常用的蛋白质分子改造的方法有易错 PCR、定点
突变、定点饱和突变和 DNA shuffling 等。王睿等［1］
对华根霉脂肪酶基因通过两轮易错 PCR，筛选到两
个突变菌株，表达的酶活力分别是野生酶的 2 倍和
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 4 期
4 倍，其中一突变酶的 Km 值比野生酶相比降低了
10%。赵博等［2］通过对枯草芽孢杆菌脂肪酶基因
进行两轮易错 PCR和高通量的筛选，最后获得的突
变体比活力是野生酶的 4. 5 倍，热稳定性有所提
高。胡长浩等［3］利用易错 PCR和交错延伸相结合
的方法对扩展青霉脂肪酶基因进行定向进化，得
到的突变株的最适作用温度比野生型提高了 5℃。
Niu等［4］通过易错 PCR 和 DNA shuffling 的方法对
Rhizopus arrhizus 脂肪酶进行定向进化，从而得到
最适作用温度和热稳定性提高的菌株，并证明了
190 位点对酶的最适作用温度和热稳定性起着决
定性作用。Fang 等［5］也是利用易错 PCR 和 DNA
shuffling相结合的方法，使 Proteus vulgaris T6 脂肪
酶的酶活力比野生酶提高了 3. 5 倍。本试验旨在
利用易错 PCR 的方法对黏质沙雷氏菌(Serratia
marcescens)脂肪酶基因 LipA 进行定向进化，通过
筛选获得酶活力有所提高，酶学特性有所改善的
突变体。
1 材料与方法
1. 1 材料
1. 1. 1 菌种和质粒 表达载体 pSE380-LipA 为本
实验室构建保存，E． coli JM109(DE3)和表达载体
pSE380(His)均为本实验室保存。
1. 1. 2 酶与试剂 T4 DNA Ligase，dNTP、Taq DNA
Polymerase购自 TaKaRa 公司;限制性内切酶 Nco I
和 Hind III 购自 Fermenters 公司，p-NPP 购自 Sigma
公司，Yeast extract、Tryptone 由 OXIOD 生产，其他试
剂均为国产分析纯。
1. 1. 3 培养基 罗丹明 B-橄榄油平板培养基参照
文献［6］，LB 培养基参照文献［7］。
1. 2 方法
1. 2. 1 易错 PCR 以实验室已构建好的 pSE380-
LipA 质粒为模板，用引物 LP1 和 LP2 进行易错
PCR，在上下游引物中分别加入了 Nco I 和 Hind III
限制性内切酶酶切位点，分别用下划线标出。LP1:
5-ACTCCATGGGCATCTTTAGCTATAAGGATCTG-
3，LP2:5-CATAAGCTTTTAGGCCAACACCACCT-
GATCGGT-3。为了提高 PCR的错配率反应体系中
加入不同浓度的 4 种碱基、提高 Mg2 +离子浓度、加
入 Mn2 +离子、采用不同的退火温度，反应程序:95℃
预变性 5 min，94℃变性 45 s，分别用 50℃、54. 7℃、
57. 8 ℃退火，72℃延伸 2 min，40 个循环后 72℃延
伸 10 min。
1. 2. 2 随机突变子的筛选 PCR 产物经 Nco I 和
Hind III 双酶切后与同样双酶切的载体 pSE380
(His)连接转化到 E． coli JM109(DE3)中，将转化后
在含有 Amp抗性的 LB平板上长出的单菌落用灭菌
牙签分别点接到罗丹明 B-橄榄油筛选平板上，37℃
培养过夜，待菌落长出后，室温放置数天以观察菌落
产透明圈情况，选取透明圈与菌落直径比值较大的
菌株进行诱导表达。
1. 2. 3 酶活的测定 采用 p-NPP法测定酶活力［8］。
1. 2. 4 胞内酶的纯化 将诱导表达 20 h 的大肠杆
菌发酵液用冷冻离心机离心后收集菌体，用溶菌酶
进行破胞，破胞后的样品采用镍柱亲和层析的方法
进行纯化，大肠杆菌破胞和镍亲和层析的具体方法
参照文献［7］。
1. 2. 5 蛋白质浓度的测定 蛋白质浓度的测定采
用 Bradford检测法［9］。
1. 2. 6 酶学性质的测定 最适 pH 和 pH 稳定性，
最适温度和热稳定性的测定参照文献［10］，Km 值
的测定采用 Linewaver-Burk双倒数作图法［11］。
2 结果与分析
2. 1 LipA基因的易错 PCR扩增
易错 PCR的产物琼脂糖凝胶电泳结果见图 1，扩
增产物条带大小约为 1. 8 kb，与目的条带大小相符。
M． DL2000 DNA Marker;1-4．易错 PCR产物
图 1 易错 PCR产物琼脂糖凝胶电泳
2. 2 易错 PCR随机突变体的平板筛选
易错 PCR 产物与 pSE380 连接转化 E． coli
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2011 年第 4 期 陈英等:基于易错 PCR技术的黏质沙雷氏菌脂肪酶基因 LipA的定向进化
JM109(DE3)后，用罗丹明 B-橄榄油平板进行大量
筛选，单菌落在平板上生长的情况如图 2 所示，大多
数菌落都没有透明圈产生，选取透明圈较大的菌落
进行后续试验。
图 2 大肠杆菌转化子的罗丹明 B平板
2. 3 易错 PCR突变库获得的突变体
将在罗丹明 B 平板上产生透明圈较大的菌
株转接到液体 LB(Amp + )培养基中，用于菌种
保存和诱导表达，表达后测定发酵产物酶活力，
最终获得 1 个酶活力较高的突变体，送交上海鼎
安公司进行测序，测序结果经 Vector NTI 分析显
示该突变体有 5 个氨基酸发生改变，比对结果如
图 3 所示。
图 3 野生酶与突变酶氨基酸序列比对结果
2. 4 野生酶和突变酶的 SDS-PAGE分析
野生重组酶和突变酶经镍柱亲和层析纯化后
SDS-PAGE结果如图 4 所示，纯化后只有单一的一
条带，大小约 64 kD，与目的蛋白理论值大小相符。
M． Protein Marker;1．含有空质粒的菌株 E． coli JM109(DE3) ;
2 ． 含有重组质粒pSE380-LipA的菌株E． coliJM109(DE3) ;
3 ． 经纯化后的野生酶LIPA;4 ． 经纯化的突变菌酶 LIPA
图 4 野生酶与突变酶的 SDS-PAGE分析
2. 5 野生酶和突变酶比活力的测定
使用上海捷瑞生物工程有限公司的 Bradford 试
剂盒测定蛋白质标准曲线，在相同反应体系和反应
时间下测定样品溶液在 595 nm下吸光值，再于蛋白
质标准曲线上查出对应的蛋白含量，从而求出酶的
比活力，测定结果显示一个突变酶的比活力由野生
型的 2 345 U /mg提高到 2 770 U /mg，另一个突变酶
则降低到 1 609 U /mg。
最终获得一个比活力提高的突变体 ep1。
2. 6 突变体 ep1 和野生酶酶学性质分析
2. 6. 1 最适温度和最适 pH 值的测定 首先在 pH
8. 0 的条件下从 15 － 60℃，对野生型和突变型脂肪
酶进行酶活测定，结果如图 5 所示，野生酶(wt)和
突变酶 ep1 的最适作用温度均为 40℃。从 pH 5. 5
－ 9. 0 测定野生型和突变型脂肪酶的活性，由图 6
可以看出野生酶的最适 pH为 8. 5，突变酶 ep1 的最
适 pH值降低为 7. 5。
图 5 温度对野生酶和突变酶活力的影响
图 6 pH对野生酶和突变酶活力的影响
2. 6. 2 热稳定性的比较 Tm 值又称解链温度，是
描述酶热稳定性的参数之一，酶活力随着温度的升
高不断降低，当酶活力降低为原始酶活力一半时，此
时的温度即为该酶的 Tm值。将野生型和突变型脂
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肪酶分别在 15 － 55℃的不同温度下放置 30 min 后
测剩余酶活力，以原酶液活力作为 100%对照，由图
7 可以看出野生酶的 Tm 值约为 39℃，ep1 的 Tm 值
约为 42℃，比野生型提高了 3℃。
图 7 温度对野生酶和突变酶稳定性的影响
2. 6. 3 Km值的测定 Km值的测定采用 Linewaver-
Burk双倒数作图法，以 1 /［S］为横坐标，以 1 /V为纵
坐标作图，直线在 X轴上截距的负倒数即为 Km 值。
从图 8 可以得出野生酶 Km 值为40 mg /mL，ep1 的
Km值降低为 12. 5 mg /mL。
图 8 Lineweaver-Burk双倒数作图法测定
野生酶(A)和突变酶(B)的 Km值
3 讨论
一般认为蛋白质的△△G(kcal /mol)越低该蛋
白越稳定，越能更好地发挥催化作用，在网站 pop-
music V2. 0 上对突变体 ep1 的各个突变氨基酸进行
分析，发现 5 个突变位点中有 4 个都是能量变低的，
具体见表 1，可能这也是其比活力和 Tm值有所提高
的一个原因。
表 1 ep1 的突变位点和突变点△△G的变化情况
突变位点 △△G(kcal /mol)
I58A － 0. 08
Q96R － 0. 03
S375G 0
K424E － 1. 57
N464D － 0. 39
在 Serratia marcescens 脂肪酶的三维结构中(图
9-A) ，Meier 等［12］推定螺旋 α6 是控制活性位点的
盖子结构，该盖子以疏水面面向活性中心的裂缝，认
为这个疏水面与底物表面相互作用互补进而打开活
性中心位点。在活性中心的右前方是一个由双螺旋
形成的发卡结构，由 33 － 74 位氨基酸组成，它在
水介质中展现出明显的疏水性表面，可能起第二
盖子的作用。突变酶 ep1 的比活力比野生酶高，
可能是因为突变位点 I58V 处在双螺旋 hairpin 的
边缘，双螺旋 hairpin 作为第二盖子，它的疏水性
质的改变可能会影响到活性中心的功能进而影
响酶活力。
Meier等［12］还发现 C 端的两个串联的 β 卷曲
折叠形成的三明治结构对 N 端催化功能域的折叠
和稳定性起着核心作用，从图 9-B 中可以看到突变
体 ep1 的突变位点 S375 位于 β卷曲的折叠拐角处，
氨基酸突变后由于侧链方向发生变化可能会影响到
β卷曲的折叠和和周围肽链的空间位置，进而影响
到 N 端催化功能域的稳定性，这可能是其 Tm 值提
高的原因。
要清楚地了解 Serratia marcescens脂肪酶的三维
结构及其功能需要大量更深入的工作，本试验通过
易错 PCR最终获得一个比活力提高的突变体，Tm
值比野生型提高了 3℃，且 Km 值明显降低，通过对
突变位点和酶学性质进行分析为以后更好地研究
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2011 年第 4 期 陈英等:基于易错 PCR技术的黏质沙雷氏菌脂肪酶基因 LipA的定向进化
Serratia marcescens脂肪酶的三维结构及其功能提供
了参考。
图 9 Serratia marcescens 脂肪酶的三维结构
参 考 文 献
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(责任编辑 李楠)
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