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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第11期
日本榧（Torreya nucifera（L.）Sieb. et Zucc）是
红豆杉科（Taxaeceae）榧树属（Torreya）的植物，
主要分布于日本和朝鲜，青岛中山公园和南京植物
园等地也有引种栽培。其叶片细胞含有榧黄素、紫
杉醇（Taxol）及其类似物，是一种重要的天然抗肿
瘤药物［1］。树皮所含有的二苄基丁酸内酯木脂素具
有抗病毒作用［2］；从榧树果实中提取分离的榧黄素
（kayaflavone）能够抗 RSa 肿瘤细胞，为该属植物所
特有［3］。日本榧叶片、果实细胞内溶物的主要化学
成分是倍半萜、二萜、木脂素、黄酮以及 β-月桂稀、
玫瑰醇、β-金合欢烯等 26 种芳香族有机物。这些内
收稿日期 ： 2013-08-12
基金项目 ：国家自然科学基金项目（31071676）
作者简介 ：张云璇，女，研究方向 ：生物技术 ；E-mail ：yuqing_xuan@163.com
通讯作者 ：姜国勇，男，教授，研究方向 ：植物分子生物学 ；E-mail ：jiangguoyong@qau.edu.cn
日本榧原生质体的分离与纯化
张云璇1  苗积广2  谢明春2  田松2  董明哲1  姜国勇1
（1. 青岛农业大学植物基因工程研究所，青岛 266109 ；2. 青岛市中山公园管理处，青岛 266071）
摘 要 ： 日本榧原生质体的分离与纯化对于建立日本榧悬浮细胞无性系，从而获得次生代谢产物榧黄素等具有重要的经济
价值。以日本榧一年生以及当年生叶片为分离材料，采用酶解法成功获得了完整的原生质体。试验结果表明，日本榧叶片细胞原
生质体获得的最适酶浓度为 ：CPW+ 纤维素酶（Cellulase R-10）3.0%-6.0%、离析酶（Macerozyme R-10）5.0%-6.0%。原生质体的
纯化使用蔗糖浓度为 30%-44%。日本榧原生质体在 0.7 mol/L 甘露醇 +50 mmol/L MES+0.5% PVP 等渗液中做连续培养可以保持完整
的细胞形态。
关键词 ： 日本榧 原生质体 分离 纯化
Isolation and Purification of Protoplast Cell from the
Leaves of Torreya nucifera
Zhang Yunxuan1 Miao Jiguang2 Xie Mingchun2 Tian Song2 Dong Mingzhe2 Jiang Guoyong1
（1. Institute of Plant Genetic Engineering，QAU，Qingdao 266109 ；2. Zhongshan Park Management Bauru，Qingdao 266071）
Abstract:  Isolation and purification of protoplast cell from the leaves of T.nucifera may exert great economic value for further suspension
construction of somatic asexual cell and obtain secondary metabolites-kayaflavone. Enzyme methods was used to isolate the cell of T.nucifera
leaf as materials successfully obtained protoplasts. The results showed that the suitable concentration for protoplast cells were ：CPW+Cellulase
（R-10）3.0%-6.0% and Macerozyme（R-10）5.0%-6.0%. The concentration 30%-44% sucrose obtained was employed for cell centrifugation
in protoplast purification. The purified protoplast could keep on well-growth status for sustainable culture in the medium with 0.7 mol/L
mannitol+50 mmol/L MES+0.5% PVP.
Key words:  Torreya nucifera Protoplasts Isolation Purification
溶物对于清除血管内的血栓、胆固醇以及消解脂肪
淤积、抗菌消炎具有明显的药理作用［4，5］。因此，
开展日本榧细胞培养，并从悬浮细胞系中提取上述
物质对于药用资源的开发具有积极的意义。日本榧
的同科植物红豆杉作为生物反应器进行红豆杉细胞
的大规模培养和工业化生产是药用产业的研究热点，
已经有多个红豆杉树种实施了一定规模的产业化［6］。
目前关于日本榧的研究主要集中在次生代谢物质的
提取与化验分析上，尚未有日本榧的细胞培养和原
生质体培育的研究报道。本研究主要是通过酶解一
年生和当年生幼嫩叶片来获得原生质体细胞，旨在
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第11期76
为细胞无性系的建立、药物的提取以及工业化生产
的开发利用奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 分离材料 取自青岛市中山公园种植的日本
榧一年生以及当年生叶片。
1.1.2 试剂 CPW 储备液（Compositions of Protoplast
Washing-solution，CPW）［7］：KNO3 101 mg/L、
MgSO4·7H2O 246 mg/L、KH2PO4 2.72 mg/L、KI 0.16
mg/L、CuSO4·5H2O 0.25 mg/L、CaCl2·2H2O 0.5%。
等 渗 液 ：0.7 mol/L 甘 露 醇 +50 mmol/L MES+
0.5% PVP（pH5.7-5.8）。
酶解液 ：纤维素酶（Cellulase R-10）+ 离析酶
（Macerozyme R-10）（pH5.8）。
等渗液及蔗糖悬浮液由 CPW 储备液配制，酶液
由等渗液直接配制，纤维素酶、离析酶为 Yakult 公
司产品。
1.2 方法
1.2.1 原生质体的分离 取当年生或一年生的日本
榧叶片 0.2 g，将叶片切成约 1.0 mm 左右的细丝，将
细丝放入到直径为 4 cm 的小培养皿中，加入 2 mL
等渗液配制的酶液。用 Parafilm 膜封口后放入 25℃、
50 r/min 的恒温培养振荡器中，遮光条件下解离 10 h。
1.2.2 原生质体的纯化 取酶解 10 h 后的原生质体
酶解液，经 0.08 mm 孔径的不锈钢网过滤收集于 2
mL 离心管中，除去未解离的叶片碎片以及细胞团。
900 r/min、7 min 离心，其沉淀部分为解离获得的原
生质体。用枪头吸去上清液，加入 600 μL 0.7 mol/L
甘露醇等渗液悬浮原生质体。再取出 800 μL 蔗糖悬
浮液轻轻加入到等渗液液面以下，形成两层液相分
离。300 r/min、5 min 后形成三层液相分离，中层为
原生质体聚集区。
2 结果
2.1 纤维素酶浓度对原生质体分离效果的影响
取日本榧一年生叶片为试验材料，仅仅使用纤
维素酶和离析酶配合即可获得形态完整的原生质体
细胞。其中离析酶浓度定为 3.0%，纤维素酶浓度分
别为 3%、4%、5%、6%。试验结果（表 1，图 1）表
明，在离析酶 3.0% 的条件下，纤维素酶的酶解浓度
为 6.0% 时日本榧原生质体的分离效果最好。圆球形
细胞的个数最多，在显微镜的视野内达到 10 个以上。
表 1 在离析酶 3% 的条件下、不同纤维素酶浓度酶解的原
生质体个数
纤维素酶
浓度（%）
原生质体
总个数
圆球细胞
个数
圆球细胞占
比例（%）
3 16.0 3.0 18.75
4 17.5 9.0 51.43
5 16.5 6.0 36.36
6 23.0 10.0 43.48
0
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30
3 4 5 6
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图 1 在离析酶 3% 的条件下原生质体个数随纤维素酶浓度
变化
2.2 离析酶浓度对原生质体分离效果的影响
将纤维素酶浓度设定为 6.0%、探索离析酶的使
用浓度。取日本榧一年生叶片切成细丝，在离析酶
浓度分别为 3%、4%、5% 和 6% 的条件下酶解 10 h。
试验结果（表 2，图 2）表明，此时离析酶 5%-6%
时叶片原生质体细胞的解离效果最好，获得的圆球
形原生质体细胞的比例达到了 67.39%。
表 2 在纤维素酶 6% 的条件下、不同离析酶酶解的原生质
体个数
离析酶
浓度（%）
原生质体
总个数
圆球形
个数
圆球形所占
比例（%）
3 22.0 10 43.48
4 25.0 7.5 30
5 32.0 18 56.25
6 23.0 15.5 67.39
试验结果还表明，日本榧叶片酶解产生的原生
质体在 0.7 mol/L 甘露醇等渗液中，可以保持完整的
细胞形态，并呈圆球形。酶解液中含有的 50 mmol/L
MES 和 0.5% PVP 不仅有助于酶解液 pH 值的稳定，
还可以有效地防止叶片在酶解过程中褐化。
2013年第11期 77张云璇等 ：日本榧原生质体的分离与纯化
2.3 不同浓度蔗糖的纯化效果
日本榧原生质体的纯化，采用甘露醇 - 蔗糖梯
度离心法。主要目的是在适合的蔗糖浓度下形成三
层液相分离，并在分离界面处获得更多的原生质体
细胞。为了达到分离纯化高浓度含量原生质体细胞
的目的，在 0.7 mol/L 甘露醇等渗液中，设计蔗糖的
浓度为梯度分别为 30%、37%、44% 和 51%，并对
其细胞的得率及其纯化效果进行了比较。镜检表明，
当蔗糖浓度为 44% 时可以达到最佳的原生质体分离
效果（图 3）。
糖浓度为 30% 的纯化液即可。镜检发现，当年生叶
片酶解产生的原生质体细胞颜色浅，叶绿体细胞少，
但纯化后的原生质体细胞完整、形状圆满（图 5）。
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图 2 在纤维素酶 6% 的条件下原生质体个数随离析酶浓度
变化
图 3 蔗糖浓度分别为 30%、37%、44% 和 51% 时的纯化
效果
当蔗糖浓度为 44% 时，原生质体的分离纯化效
果较好，上层镜检图片可以看到破碎的细胞内容物，
中层镜检图片可以看到细胞形态完整的圆球形原生
质体，下层镜检图片可以看到一些聚集的细胞团及
细胞碎片或杂质（图 4）。
2.4 日本榧当年生叶片的酶解
日本榧当年生叶片非常幼嫩，所需酶解液的酶
解浓度相对较低。试验结果表明，采用 3% 的纤维
素酶和离析酶的混合酶解液即可以获得细胞形态完
整的原生质体。当使用纤维素酶 6%，离析酶 6% 时，
可以增加酶解的原生质体个数。细胞的纯化采用蔗
A B C
A ：三层分离时上层镜检图片 ；B ：三层分离时中层镜检显示圆形细胞 ；
C ：三层分离时镜检显示下层细胞碎片
图 4 蔗糖浓度为 44% 时的纯化效果
6
图 5 当年生叶片的酶解纯化后的原生质体细胞
3 讨论
日本榧树是从日本引进的一种红豆杉科的乔木，
它与我国南方种植的香榧树同为榧属（Torreya）的
树种，如同红豆杉的细胞培养与药物开发的研究一
样，日本榧叶片细胞含有榧黄素、紫杉醇类似物，
其原生质体分离及其细胞培养并应用于药物开发具
有重要价值。本研究使用纤维素酶和离析酶的混合
酶液，并在 CPW 液的配合下酶解日本榧叶片 10 h
即可获得相当多的原生质体细胞。与 Luo 等［7］在南
方红豆杉进行原生质体培养的研究相比较，原生质
体细胞的密度也达到了（2.3-3.2）×105/mL，表明
使用上述混合酶液对原生质体的分离作用卓有成效。
然而与 Luo 和 Naill 等［7，8］的研究不同的是，酶解日
本榧叶片并不使用果胶酶，只需要离析酶和纤维素
酶的配合即可达到预期的效果。
经过试验比较，日本榧一年生叶片酶解获得的
原生质体，使用甘露醇 - 蔗糖梯度离心法纯化，蔗
糖浓度为 44% 就会取得理想的效果。如果利用日本
榧当年生叶片做分离纯化材料时，离心时的蔗糖浓
度为 33% 就会获得完整、形状圆满原生质体的细胞。
同样，利用日本榧当年生叶片做分离纯化材料，当
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纤维素酶和离析酶的浓度增加到 6% 时，原生质体
细胞的个数可以增加至 3.2×105/mL 以上。这一研究
结果可以大大提高原生质体的分离效率，有利于日
本榧细胞的大规模培养及其工业化生产。
4 结论
应用酶解法成功获得了日本榧一年生以及当
年 生 叶 片 的 原 生 质 体。 其 CPW 酶 解 液 的 纤 维 素
酶（Cellulase R-10） 浓 度 为 3.0%-6.0%、 离 析 酶
（Macerozyme R-10）浓度为 5.0%-6.0%。原生质体纯
化的蔗糖浓度为 30%-44%。日本榧原生质体在 0.7
mol/L 甘露醇 +50 mmol/L MES+0.5% PVP 等渗液中连
续培养可以保持完整的细胞形态。
参 考 文 献
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（责任编辑 狄艳红）