全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第2期
收稿日期 : 2011-07-09
基金项目 : 国家自然科学基金项目（30870013，30910103907）
作者简介 : 曹春蕾 , 女 , 硕士研究生 , 研究方向 : 药用真菌 ;E-mail:caochunlei123@126.com
通讯作者 : 戴玉成 , 男 , 博士 , 教授 , 研究方向 : 大型真菌的分类与资源利用 ;E-mail:yuchengd@yahoo.com
桑木层孔菌液体培养条件的研究
曹春蕾 崔宝凯 戴玉成
（北京林业大学微生物研究所，北京 100083）
摘 要 : 对桑木层孔菌（Phellinus mori）液体发酵条件进行了研究，以生物量和胞外多糖为指标，通过 L16（45）和 L9（34）
正交表进行了两次正交试验，筛选出桑木层孔菌最适液体培养条件为 ：麦芽糖 30 g/L，酵母浸粉和蛋白胨 15 g/L（质量比 2 1），
KH2PO4 和 CaCl2 5.5 g/L（质量比 1 1），初始 pH6.0 ；通过单因素试验筛选出最适装液量为 120 mL/250 mL，最适接种量为 10%。在
此条件下液体发酵培养 7 d 后，桑木层孔菌生物量达到 23.375 g/L，胞外多糖产量达到 3.993 g/L。
关键词 : 桑木层孔菌 液体发酵 生物量 胞外多糖 正交试验
Studies on Submerged Culture Conditions of Phellinus mori
Cao Chunlei Cui Baokai Dai Yucheng
（Institute of Microbiology，Beijing Forestry University, Beijing 100083）
Abstract: The objective of this paper was to optimize the submerged culture conditions of Phellinus mori for maximum production of
mycelial biomass and exopolysaccharides （EPSs）. Based on orthogonal array design, the optimum medium compositions were: maltose 30 g/L,
yeast extract powder and peptone 15 g/L （2 1）, KH2PO4 and CaCl2 5.5 g/L （1 1）, initial pH6.0. Single factor experiment showed that the
optimal liquid medium volume was 120 mL/250 mL and the optimal inoculum volume was 10%. Under the optimal culture conditions, the
mycelial biomass and EPS achieved 23.375 g/L and 3.993 g/L respectively.
Key words: Phellinus mori Submerged culture Mycelial biomass Exopolysaccharide Orthogonal array design
桑木层孔菌（Phellinus mori）2008 年首先被报
道于我国东北及华北地区，生长于桑树上［1］，该种
隶属于菌物界（Fungi），担子菌门（Basidiomycota），
伞菌纲（Agaricomycetes），锈革孔菌目（Hymenocha-
etales）， 锈 革 孔 菌 科（Hymenochaetaceae）， 木 层
孔菌属（Phellinus）。该种子实体的主要特征为子
实体多年生，平伏，黄褐色至深褐色，孔口表面
多裂纹，木栓质，多子实层具刚毛，担孢子较小
（4.3-5.2×3.8-4.6 μm）［2］。
20 世纪 60 年代以来，随着对多糖的研究深入，
人们逐渐发现多糖具有复杂的、多方面的生物活性
和功能，尤其是真菌多糖药理活性的研究越来越多。
木层孔菌属不但是多孔菌的重要类群［3］，也是重要
的药用真菌类群［4］，该属的桑黄类群——鲍姆木层
孔菌（Phellinus baumii）、裂蹄木层孔菌（Phellinus
linteus）、火木层孔菌 （Phellinus igniarius）研究较多，
其中抗肿瘤［5-8］、增强免疫力［9］、降血糖［10］及抗
氧化［11］等活性备受关注，多糖是其重要的药用成
分。桑木层孔菌是木层孔菌属的一个新种，它寄生
的桑树更是传统的中药材，潜在药用价值较大。然
而，桑木层孔菌产多糖的研究方面尚未有报道。因此，
本试验以生物量和胞外多糖为指标，通过四因素四
水平和三因素三水平两次正交试验筛选出了桑木层
孔菌液体发酵最适碳源、氮源、无机盐及初始 pH，
通过追加的单因素试验筛选出了最适装液量及最适
接种量，为桑木层孔菌的液体发酵生产提供了培养
基配方，也为今后开发利用其药用成分提供了一定
的基础。
2012年第2期 177曹春蕾等 ：桑木层孔菌液体培养条件的研究
1 材料与方法
1.1 供试菌株
桑木层孔菌（Phellinus mori）菌株 Dai 8310 于
2007 年分离于黑龙江省镜泊湖风景区的桑树上，现
保存于北京林业大学微生物研究所（BJFC）。
1.2 方法
1.2.1 菌种活化 菌种活化固体培养基 ：葡萄糖
20 g，酵母浸粉 5 g，KH2PO4 1 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，
维生素 B1 10 mg，琼脂 20 g，蒸馏水 1 000 mL，自
然 pH。
1.2.2 液体种子制备 用打孔器取平板上长势一致
的菌饼接至液体种子培养基中（100 mL/250 mL），
28 ℃，150 r/min 培 养 7 d， 得 到 一 级 液 体 发 酵 种
子，匀浆后按 10% 接种量接至液体种子培养基中
（100 mL/250 mL），28℃，150 r/min 培养 3 d 得二级
发酵种子。
液体种子培养基 ：葡萄糖 20 g，酵母浸粉 5 g，
KH2PO4 1 g，MgSO4·7H2O 0. 5 g，维生素 B1 10 mg，
蒸馏水 1 000 mL，pH 自然。
1.2.3 液体培养方法 每个供试培养基（100 mL/
250 mL）中接 10% 二级液体发酵种子，每个处理 3
个重复，28℃，150 r/min 培养 7 d，测发酵液多糖及
生物量。
第一次正交试验基础培养基 ：碳源 20 g，氮
源 5 g， 无 机 盐 1.5 g， 维 生 素 B1 10 mg， 蒸 馏 水
1 000 mL。
1.2.4 生物量及胞外多糖测定方法 生物量测定 ：
过滤后湿菌丝用蒸馏水冲洗几次，置烘箱中，65℃
烘干至恒重，称量。
胞外多糖测定 ：过滤后的滤液浓缩至原体积的
1/10，加入 3 倍体积的无水乙醇，4℃沉淀 24 h，过
滤后取沉淀，置 65℃干燥箱至恒重，即得发酵液粗
多糖，单位 g/L。
1.2.5 最佳培养条件的确定 正交试验 ：为了筛选
出桑木层孔菌最佳液体培养条件，进行了两次正交
试验，第一次通过 L16（45）正交表得出最佳的碳源、
氮源、无机盐及初始 pH。在第一次正交得出的最佳
组合基础上，第二次通过 L9（34）正交表得出了碳源、
氮源及无机盐的最适用量。第一次和第二次正交试
验的因素水平设计见表 1 和表 2。
追加试验 ：两次正交试验得出最佳培养基组合
后，通过单因素试验确定最适接种量及装液量。
1.2.6 数据处理 运用 SPSS 18.0 软件进行正交试验
方差分析检验数据间的差异性，P ＜ 0.05 时为差异
显著。
水平 因素A（碳源） B （氮源） C （无机盐） （1:1） D （初始 pH）
1 葡萄糖 酵母浸粉 MgSO4+KH2PO4 4.0
2 麦芽糖 蛋白胨 KH2PO4+CaCl2 5.0
3 甘露醇 硝酸钾 KNO3 MgSO4+CaCl2 6.0
4 蔗糖 酵母浸粉 + 蛋白胨 （质量比 2:1） KH2PO4+NaCl 7.0
水平 因素A（碳源） （g/L） B（氮源）（g/L） C （无机盐） （1:1） （g/L）
1 10 5 1.5
2 20 10 3.5
3 30 15 5.5
表 1 第一次正交试验因素水平表
表 2 第二次正交试验因素水平表
2 结果
2.1 第一次正交试验结果及分析
四因素四水平 3 次重复的正交试验结果（表 3）
显示，不同组合处理的桑木层孔菌生物量和胞外多
糖产量差异很大。其中第 5 个组合的生物量最大，
为 11.262 g/L，第 3 个组合的胞外多糖产量最大，为
2.884 g/L。
用正交试验直观分析法分别对生物量和胞外多
糖进行分析，结果（表 3）显示，桑木层孔菌生物
量的影响因素中，氮源＞初始 pH ＞无机盐＞碳源。
最佳组合为 A2B4C2D2，即麦芽糖、酵母浸粉和蛋白
胨、KH2PO4 + CaCl2、初始 pH5.0。对桑木层孔菌胞
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第2期178
外多糖的影响因素中，初始 pH ＞碳源＞无机盐＞
氮源。最佳组合为 A2B3C2D3，即麦芽糖、硝酸钾、
KH2PO4+CaCl2、初始 pH7.0。
分别以生物量和胞外多糖为因变量对正交试验
结果进行方差分析，结果（表 4）显示，不同水平
的碳源、氮源、无机盐和初始 pH 对桑木层孔菌生
物量影响差异均显著。而以胞外多糖为指标时，不
同氮源水平对胞外多糖产量的影响差异不显著，其
他因素对胞外多糖影响均差异显著。同时从 F 值的
大小也可以看出，对生物量的影响因素从大到小依
次为氮源、初始 pH、无机盐和碳源，对胞外多糖的
影响因素从大到小依次为初始 pH、碳源、无机盐和
氮源，和极差分析结果一致。
极差分析结果表明，分别以生物量和胞外多糖
为指标时，最适氮源和初始 pH 不同，硝酸钾和复
合氮源相比较，多糖产量相差较小，因此，综合考
虑生物量和多糖的产量，选择复合氮源酵母浸粉和
蛋白胨。初始 pH 为 6.0 时生物量和多糖产量都位于
第二，因此选择初始 pH6.0。最终选择碳源为麦芽糖，
氮 源 为 酵 母 浸 粉 和 蛋 白 胨， 无 机 盐 为 KH2PO4 和
CaCl2 组合，最适初始 pH6.0。由于正交表中没有该
组合，因此设置 3 组验证组，得出生物量为 11.097、
12.052 和 11.138 g/L，平均值为 11.429 g/L ；胞外多
糖 为 2.734、2.8 和 2.602 g/L， 平 均 值 为 2.712 g/L。
生物量高于正交表中的最大值 11.262 g/L，胞外多糖
略低于正交表中的最大值。认为该组合较适合桑木
编号
因 素
A（碳源） B （氮源） C （无机盐） （1:1） D （初始 pH） 生物量 （g/L） 胞外多糖（g/L）
1 1 1 1 1 5.778 1.858
2 1 2 2 2 7.949 1.718
3 1 3 3 3 2.6 2.884
4 1 4 4 4 5.436 2.069
5 2 1 2 3 11.262 2.536
6 2 2 1 4 6.986 2.527
7 2 3 4 1 3.578 2.588
8 2 4 3 2 10.179 1.978
9 3 1 3 4 2.848 2.375
10 3 2 4 3 6.506 1.534
11 3 3 1 2 4.13 1.297
12 3 4 2 1 10.521 2.549
13 4 1 4 2 10.444 0.916
14 4 2 3 1 6.407 1.486
15 4 3 2 4 3.905 2.121
K1 5.441 7.583 6.345 6.571
K2 8.001 6.962 8.409 8.176
K3 6.001 3.553 5.509 7.214
K4 7.311 8.656 6.491 4.794
R1 2.56 5.103 2.9 3.382
k1 2.132 1.921 1.878 2.120
k2 2.407 1.674 2.231 1.477
k3 1.939 2.223 2.181 2.196
k4 1.588 2.106 1.777 2.273
R2 0.819 0.407 0.454 0.796
表中生物量及胞外多糖为平均值（n=3）；K1,K2,K3,K4,R1 为生物量的平均值和极差，k1,k2,k3,k4,R2 为胞外多糖的平均值和极差。
表 3 第一次正交试验结果
2012年第2期 179曹春蕾等 ：桑木层孔菌液体培养条件的研究
层孔菌生产菌丝体和胞外多糖，因此选用该组合进
行第二次正交试验。
2.2 第二次正交试验结果及分析
以第一次正交试验得出的最优组合麦芽糖、酵
母浸粉和蛋白胨、KH2PO4 和 CaCl2、初始 pH6.0 为
基础，用表 2 的因素水平表进行第二次正交试验，
结果见表 5。从试验结果可以看出，不同组合处理
的桑木层孔菌生物量和胞外多糖产量差异很大。其
中第 3 个组合的生物量最大，为 16.55 g/L，第 9 个
组合的胞外多糖产量最大，为 2.865 g/L。
用 正 交 试 验 直 观 分 析 法 分 别 对 生 物 量 和 胞
外多糖进行分析，结果如表 5 所示，不同用量的
碳源、氮源和无机盐对桑木层孔菌生物量的影响
大 小 排 序 为 氮 源 ＞ 碳 源 ＞ 无 机 盐， 最 佳 组 合 为
A3B3C3，即麦芽糖 30 g/L、酵母浸粉和蛋白胨 15 g/L、
KH2PO4+CaCl2 5.5 g/L。对桑木层孔菌胞外多糖的影
响因素中，氮源＞无机盐＞碳源，最佳组合和生物
量最佳组合相同，都为 A3B3C3。
分别以生物量和胞外多糖为因变量对第二次正
交试验结果进行方差分析，结果（表 6）显示，无
机盐 3 个不同水平对桑木层孔菌生物量和胞外多糖
的影响差异都不显著，而碳源和氮源不同水平对生
物量和胞外多糖影响差异均显著。
从 以 上 正 交 试 验 的 直 观 分 析 和 方 差 分 析 得
出桑木层孔菌产菌丝体和胞外多糖的最优组合为
A3B3C3，即麦芽糖 30 g/L、酵母浸粉和蛋白胨 15 g/L、
KH2PO4+CaCl2 5.5 g/L，正交表中没有该组合，因此
设置了 3 组验证试验，其生物量为 19.536 7、21.516 7、
20.166 g/L，平均值为 20.406 5 g/L；胞外多糖为 3.244、
2.990 3、3.032 g/L，平均值为 3.088 8 g/L。验证组生
物量及胞外多糖的产量都高于正交表中的最大值，说
明该组合更适合桑木层孔菌产生菌丝体和胞外多糖。
变差来源 因变量 平方和 自由度 F 值 显著性
A 生物量 37.027 3 11.011 **
胞外多糖 3.970 3 14.582 **
B 生物量 154.872 3 46.056 **
胞外多糖 1.059 3 3.891 *
C 生物量 49.857 3 14.827 **
胞外多糖 1.739 3 6.388 **
D 生物量 79.540 3 23.654 **
胞外多糖 4.641 3 17.047 **
误差 生物量 35.868 32
胞外多糖 2.904 32
总计 生物量 2342.415 45
胞外多糖 191.473 45
表 4 生物量和胞外多糖方差分析表
* 表示差异不显著 ；** 表示差异显著
表 5 第二次正交试验结果
编号
因素
A（碳源）
（g/L）
B （氮源）
（g/L）
C （无机盐）
（1:1）（g/L）
生物量
（g/L）
胞外多糖
（g/L）
1 1 1 1 6.544 1.367
2 1 2 2 10.337 2.232
3 1 3 3 16.550 2.441
4 2 1 2 11.399 1.937
5 2 2 3 11.493 2.714
6 2 3 1 12.042 2.186
7 3 1 3 11.908 2.734
8 3 2 1 14.967 2.518
K1 11.144 9.95 11.184
K2 11.645 12.266 12.232
K3 13.945 14.518 13.317
R1 2.801 4.568 2.133
k1 2.013 2.013 2.024
k2 2.279 2.488 2.345
k3 2.706 2.497 2.63
R2 0.693 0.484 0.606
表中生物量及胞外多糖为平均值（n=3）; K1,K2,K3,K4,R1 为生物量的平
均值和极差，k1,k2,k3,k4,R2 为胞外多糖的平均值和极差。
表 6 生物量和胞外多糖方差分析表
变差来源 因变量 平方和 自由度 F 值 显著性
A 生物量 40.175 2 4.935 **
胞外多糖 2.195 2 9.906 **
B 生物量 73.841 2 9.070 **
胞外多糖 1.591 2 7.182 **
C 生物量 8.057 2 0.990 *
胞外多糖 0.499 2 2.252 *
误差 生物量 81.411 20
胞外多糖 2.216 20
总计 生物量 4271.681 27
胞外多糖 153.215 27
* 表示差异不显著 ；** 表示差异显著
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第2期180
2.3 不同装液量和接种量对桑木层孔菌生物量和
胞外多糖的影响
为了探索桑木层孔菌液体培养过程中不同装液
量对生物量和胞外多糖产量的影响，对装液量 80 mL/
250 mL、100 mL/250 mL、120 mL/250 mL 进行单因素
试 验， 结 果 如 图 1 所 示。 当 装 液 量 为 120 mL/
250 mL 时，生物量为 23.375 g/L，胞外多糖为 3.993 g/L，
产量都高于 80 mL/250 mL 和 100 mL/250 mL。方差
分析结果表明，不同装液量对生物量影响差异显著
（P<0.05），对胞外多糖影响差异不显著（P>0.05）。
图 1 装液量对桑木层孔菌生物量及
胞外多糖产量的影响
为了探索桑木层孔菌液体培养过程中不同接种
量对生物量和胞外多糖产量的影响，对接种量 5%、
10%、15% 进行单因素试验，结果（图 2）显示，当
接种量为 10% 时，生物量为 21.516 7 g/L，胞外多糖
为 2.990 3 g/L，高于接种量为 5% 和 15%，因此接种
量选择 10%。方差分析结果表明，不同接种量对生
物量影响差异显著（P<0.01），对胞外多糖影响差异
不显著（P>0.05）。
3 讨论
在菌丝体快速增长过程中，氮源为其蛋白质和
核酸的生成提供原料，高等真菌中，无机氮源不能
用于合成必需氨基酸，因此大多数担子菌在发酵培
养时都更偏好复合的有机氮源［13］，并且有机氮源中
的维生素、核苷酸等小分子物质也能促进菌丝体的
生长，复合氮源的营养成分更为丰富，因此本试验中，
酵母浸粉和蛋白胨做复合氮源时，桑木层孔菌生长
较快，生物量明显高于其他氮源。
图 2 不同接种量对桑木层孔菌生物量及
胞外多糖产量的影响
无机盐是微生物生长必不可少的一类营养物
质，对机体的酶活、生物大分子和细胞结构的稳定
性、细胞渗透压的平衡等都起着重要作用。Kang 等［14］
报道过 KH2PO4 和 CaCl2 是促进木层孔菌属菌丝体生
长的最适无机盐，Hwang 等［15］也报道了裂蹄针层
孔菌产菌丝体和胞外多糖最适无机盐为 KH2PO4 0.68
g/L 和 CaCl2 0.55 g/L，本试验也得出了同样的结果，
即 KH2PO4 和 CaCl2 能明显促进桑木层孔菌菌丝体的
生长和胞外多糖的产生。
同一微生物的不同生长阶段和不同的生理、生
化过程，其最适 pH 都不同，Hwang 等［12］曾报道淡
黄木层孔菌（Phellinus gilvus）液体发酵时，产菌丝
体最适 pH 为 5.0，而产胞外多糖的最适 pH 为 9.0。
本试验第一次正交试验结果中，桑木层孔菌产生物
量最适初始 pH 为 5.0，产胞外多糖最适 pH 为 7.0，
与 Hwang 等的结论基本相同，即桑木层孔菌在偏酸
的环境中生长较快，而接近中性的环境更适合生产
胞外多糖。
第一次正交结果表明，桑木层孔菌生物量的主
控因素是氮源，而胞外多糖的主控因素是初始 pH，
与李朔等 ［16］报道的桑黄（Phellinus baumii）的液体
培养结果一致。对生物量和胞外多糖进行相关性分
析，结果表明生物量和胞外多糖之间不存在可靠的
相关性。然而，不同的因素之间是否存在交互作用，
还需进一步试验证明。
4 结论
本试验通过两次正交试验和单因素试验，以生
物量和胞外多糖为指标，探索了桑木层孔菌液体培
2012年第2期 181曹春蕾等 ：桑木层孔菌液体培养条件的研究
养的最适条件。结果表明，麦芽糖 30 g/L，酵母浸
粉和蛋白胨 （2 1）15 g/L，KH2PO4 和 CaCl2（1 1）
5.5 g/L，初始 pH6.0，装液量 120 mL/250 mL，接种
量 10%，桑木层孔菌生物量达到 23.375 g/L，胞外多
糖产量达到 3.993 g/L。本试验得出的桑木层孔菌胞
外多糖和菌丝体干重产量也较高，但是否可用于多
糖的大量生产，还需进一步的发酵罐放大试验。
参 考 文 献
［1］ 戴玉成 . 中国东北地区木材腐朽菌的多样性 . 菌物学报 , 2010,
29（6）:801-818.
［2］ Dai YC, Cui BK, Tao WQ. Phellinus mori sp. nov. （Basidiomycota, H-
ymenochaetales） from northern China. Mycotaxon, 2008, 105:53-58.
［3］ 戴玉成 . 中国多孔菌名录 . 菌物学报 , 2009（3）:315-327.
［4］ 戴玉成 , 杨祝良 . 中国药用真菌名录及部分名称的修订 . 菌物
学报 , 2008, 27（6）:801-824.
［5］ 戴玉成 . 药用担子菌—鲍氏层孔菌（桑黄）的新认识 . 中草药 ,
2003, 34（1）:94-95.
［6］ Kim GY, Oh YH, Park YM. Acidic polysaccharide isolated from
Phellinus linteus induces nitric oxide-mediated tumoricidal activity
of macrophages through protein tyrosine kinase and protein kinase C.
Biochemical and Biophysical Research Communications, 2003, 309
（2）:399-407.
［7］ Bae JS, Jang KH, Yim H, et al. Inhibitory effects of polysaccharides
isolated from Phellinus gilvus on benzo（a） pyrene-induced foresto-
mach carcinogenesis in mice. World Journal of Gastroenterology,
2005, 11（4）:577-579.
［8］ Zhu T, Guo J, Collins L, et al. Phellinus linteus activates different
pathways to induce apoptosis in prostate cancer cells. British Journal
of Cancer, 2007, 96: 583-590.
［9］ Kim GY, Lee JY, Lee JO, et al. Partial characterization and
immunostimulatory effect of a novel polysaccharide-protein complex
extracted from Phellinus linteus. Bioscience Biotechnology and
Biochemistry, 2006, 70（5）:1218-1226.
［10］ Cho EJ, Hwang HJ, Kim SW, et al. Hypoglycemic effects of
exopolysaccharides produced by mycelial cultures of two different
mushrooms Tremella fuciformis and Phellinus baumii in ob/ob mice.
Applied Microbiology and Biotechnology, 2007, 75（6）:1257-1265.
［11］ Park IH, Chung SK, Lee KB, et al. An antioxidant hispidin from
the mycelial cultures of Phellinus linteus. Archives of Pharmacal
Research, 2004, 27（6）:615-618.
［12］ Hwang HJ, Kim SW, Xu CP, et al. Production and molecular
characteristics of four groups of exopolysaccharides from submerged
culture of Phellinus gilvus. Journal of Applied Microbiology, 2003,
94（4）:708-719.
［13］ Jung IC, Kim SH, Kwon YI, et al. Cultural condition for the mycelial
growth of Phellinus igniarius on chemically defined medium and
grains. The Korean Journal of Mycology, 1997, 25（2）:133-142.
［14］ Kang TS, Lee DG, Lee SY. Isolation and mycelial cultivation
submerged of Phellinus sp. The Korean Journal of Mycology, 1997,
25:257-267.
［15］ Hwang HJ, Kim SW, Choi JW, et al. Production and characterization
of exopolysaccharides from submerged culture of Phellinus linteus
KCTC 6190. Enzyme and Microbial Technology, 2003, 33（2-3）:
309-319.
［16］ 李朔 , 丁一新 , 徐霁 , 等 . 桑黄胞内多糖液体发酵培养基的优
化 . 食品科学 , 2006, 27（11）:236-240.
（责任编辑 马鑫）