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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第11期
抗坏血酸（ascorbic acid，AsA）也称维生素 C
（Vc），属于水溶性维生素，是一种广泛存在于植物
体内的高丰度抗氧化物质［1］。AsA 在植物体内直接
参与活性氧（reactive oxygen species，ROS）的清除，
并且在多条代谢途径中充当还原剂，与超氧化物歧化
酶（superoxide dismutase，SOD）以及抗坏血酸 - 谷
胱甘肽循环（ascorbate-glutathione cycle，AsA-GSH）
中的相关酶一起，在清除 ROS 的过程中发挥着极其
收稿日期 : 2012-04-08
基金项目 : 大学生创新性实验项目（6309201）
作者简介 : 林源秀 , 女 , 硕士研究生 , 研究方向 : 生物技术在果树上的应用 ; E-mail: yuanxiulin1989@Gmail.com
通讯作者 : 汤浩茹 , 男 , 教授 , 博士 , 研究方向 : 果树学 ; E-mail: htang@sicau.edu.cn
草莓 MDHAR 及 AO 基因的克隆及序列分析
林源秀  顾欣昕  汤浩茹  侯艳霞  代小娟  张勇  罗娅  刘泽静
（四川农业大学园艺学院，雅安 625014）
摘 要 ： 从新鲜幼嫩‘丰香’草莓（Fragaria×ananassa cv. Toyonaka）果实中提取分离总 RNA，反转录成 cDNA，根据已报
道的其他植物单脱氢抗坏血酸还原酶（MDHAR）及抗坏血酸氧化酶（AO）基因的保守区分别设计一对引物，通过 PCR 扩增均得
到目的条带。序列分析发现 ：mdhar 基因片段长 372 bp，与刺梨同源性最高达 96%，该片段编码 123 个氨基酸，推导的氨基酸序
列与苹果属植物同源性为 91%，与其他植物该基因编码的氨基酸序列也有较高相似性 ；ao 基因片段长 842 bp，编码 280 个氨基酸，
该片段与其他多种植物的 ao 基因均具有较高同源性，与甜瓜和黄瓜 ao 基因的同源性最高，均为 70%，编码的氨基酸序列与其他
多种植物均具有 70% 左右的相似性。
关键词 ： 草莓 单脱氢抗坏血酸还原酶 抗坏血酸氧化酶 克隆 序列分析
Cloning and Sequence Analysis of cDNA Segment Encoding
Monodehydroascorbate Reductase and Ascorbate Oxidase from
Fragaria×ananassa cv. Toyonaka
Lin Yuanxiu Gu Xinxin Tang Haoru Hou Yanxia Dai Xiaojuan Zhang Yong Luo Ya Liu Zejing
（College of Horticulture，Sichuan Agricultural University，Ya’an 625014）
Abstract:  RNA was extracted and separated from the fruits of Fragaria×ananassa cv. Toyonaka for the synthesis of cDNA first chain,
primers were designed according to conserved regions of monodehydroascorbate reductase and ascorbate oxidase reported in several species. The
objective bands was obtained by RT-PCR. The identification and sequence analysis indicated that the obtained 371 bp fragment was indeed a
mdhar gene fragment which shared high homology with other Rosaceae mdhar gene. The highest homology shared was 96% with Rosa Roxburghii
in nucleotide sequence. It encoded 123 amino acid, and also shared high homology with other Mulus in amino acid sequence. The 842 bp
fragment was indeed an ao gene fragment which shared high homology with other plants. The highest homology was 70% with Cucumis sativus
Linn and Cucumis melo. It encoded 280 amino acid, and likewise shared high homology with other plants in amino acid sequence.
Key words:  Fragaria MDHAR AO Cloning Sequence analysis
重要的作用［2］。同时，AsA 对于人类正常心血管功
能的维护、免疫细胞的发育有重要作用，可用于预
防与结缔组织有关的疾病，如坏血病，能够增强心
血管和免疫细胞功能和 α-生育酚（维生素 E）的再
生［3］。虽然植物和大多数动物可以合成 AsA，但是
人类由于其 AsA 生物合成途径中最后一步合成酶 -L-
古洛糖酸 -1，4- 内酯氧化酶（L-gulono-1，4-lactone
oxidase）基因发生突变导致丧失合成 AsA 的能力［4］，
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第11期84
作用和显著的经济效益倍受消费者和种植者的喜爱。
尤其是草莓果实的维生素 C 含量非常高，是苹果与
葡萄的 7-10 倍，素有“维生素 C 女王”的美称。而
MDHAR 和 AO 是草莓 AsA-GSH 循环的两个关键酶
（图 1），对草莓果实 AsA 的积累和代谢具有非常重
要的作用［12］。因此，本试验采用草莓栽培品种‘丰香’
（Fragaria×ananassa cv. Toyonaka）果实为研究材料，
拟克隆草莓 mdhar 和 ao 基因，并研究其结构和功能，
为草莓育种和生产提供基因资源和理论指导。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 植物材料 草莓栽培品种‘丰香’（Fragaria×
ananassa cv. Toyonaka）于 2008 年 1 月从四川双流兴
隆镇引种，栽于四川农业大学教学科研园区塑料大
棚内，进行常规管理。于 2010 年 1 月中旬采集成熟
的无病虫害‘丰香’新鲜果实，置于冰盒内带回实
验室，用液氮速冻后，立即将其保存于 -80℃ 冰箱
备用。
1.1.2 仪器设备 PCR 仪（Bio-Rad，美国）、核酸
蛋白分析仪（Eppendorf，德国）、凝胶成像系统（SY-
NGENE，美国）等。
1.1.3 试剂及培养基
1.1.3.1 试剂 PLANT RNAOUT 试剂盒（天泽基因
工程有限公司）、Easy-GoTM RT PreMix 试剂盒（北
京赛百盛基因技术有限公司）等。
1.1.3.2 培养基 LB 培养基、LB/Amp 培养基、SOB
培养基、SOC 培养基等。
1.2 方法
1.2.1 总 RNA 的提取及 cDNA 合成 参照 PLANT
RNAout 试剂盒（天泽基因工程有限公司）使用手册
提取其总 RNA。并参照 Easy-GoTM RT PreMix 试剂盒
（北京赛百盛基因技术有限公司）说明书操作进行反
转录合成 cDNA，cDNA 合成后立即保存于 -20℃冰
箱待用。
1.2.2 引物设计与合成 根据 GenBank 中已登录的
其他植物 ao 基因和 mdhar 基因的氨基酸序列，利用
CODEHOP（Consensus Degenerate Hybrid Oligonucleo
tide Primers）在线软件（http://bioinformatics. Weiz-ma-
nn.ac.il/blocks/codehop.html）程序化进行同源比对， 图 1 植物抗坏血酸 - 谷胱甘肽循环［5］
APX
H2O2 H2O
GLDH
GL Ascorbate
AO
MDA
MDAR
DHAR
GR
GSSG 2GSH
DHA
Non-enzymic
disproportionation
2,3-diketogulonate
并且人体中不能贮存 AsA，所以必须从日常饮食特
别是植物中获得，新鲜的水果和蔬菜就是最好的
来源。
AsA 的再生途径主要是通过植物抗坏血酸谷胱
甘肽（AsA-GSH）循环［5］（图 1）。作为该循环中两
个主要酶，抗坏血酸由抗坏血酸氧化酶（ascorbate
oxidase，AO）氧化 AsA 生成单脱氢抗坏血酸（mono-
dehydroascorbate，MDHA），从而调节植物原生质体
外 AsA 库的总体氧化还原状态。MDHA 不稳定，一
部分被歧化生成脱氢抗坏血酸（dehydroascorbate，
DHA）；另一部分在单脱氢抗坏血酸还原酶（monode-
hydroascorbate reductase，MDHAR）的催化作用下还
原为 AsA。由此可见，AO 主要调节植物原生质体
外 AsA 库的氧化还原状态，维持抗坏血酸库的氧化
还原比率［6］。此外，AO 对植物的逆境响应［7］、基
因表达［8］、生长发育和成花诱导［9］都可起调控作
用，这些调控机制均与质体外 AsA 库的氧化还原状
态 有 关。 而 MDHAR 催 化 MDHA 还 原 为 AsA， 对
抗坏血酸的再生有重要作用。罗娅［10］的研究表明，
MDHAR 是抗坏血酸再生的主要酶。此外，Yoon 等［11］
的 研 究 还 表 明，MDHAR 在 清 除 ROS 方 面， 维 持
AsA 抗氧化特性也有重要作用。目前，mdhar 基因
已从黄瓜、豌豆等植物中克隆出来，ao 基因已从黄瓜、
南瓜等植物中得到克隆和鉴定。
草莓（Fragaria×ananassa. Duch.）属于蔷薇科
草莓属植物，是世界栽培范围仅次于葡萄的第二大
浆果。草莓果实以其丰富的营养物质、重要的保健
2012年第11期 85林源秀等 ：草莓 MDHAR 及 AO 基因的克隆及序列分析
得到高度保守的连续氨基酸区域后，设计用于 MDH-
AR 扩增的兼并引物 MRf: 5-GCTGCCCGAGTGGTAC-
AAGSARAARGGNAT-3，MRr: 5-CGGGGCATGCAC-
CANGGYTC-3 ；用于 AO 克隆的兼并引物 AOf: 5-G-
GTGGTGGAAGCCGAGGGNAAYTA-3，AOr: 5-CAT-
ATGCAAATGGGGTTCAATATGRCATGRAA-3。（M=A
or C V=A or C or G R=A or G H=A or C or T W=A or T
D=A or G or T S=C or G B=C or G or T Y=C or T N=A or
C or G or T K=G or T）预测目的片段大小，AO 为 837
bp ；MDHAR 为 369 bp。引物合成由上海生工生物
公司完成。
1.2.3 PCR 扩增与克隆、鉴定 采用降落 PCR 法
（touchdown PCR，TD-PCR）扩增。20 μL 体系包括，
10×Buffer 2 μL，Mg2+ 1.6 μL，模板 cDNA 1 μL，dN-
TPs 0.4 μL，Taq DNA 聚合酶 0.4 μL，上下游引物各
1 μL， 用 已 灭 菌 的 ddH2O 补 足 20 μL， 轻 轻 混 匀，
瞬时离心后置 PCR 仪进行热启动降落 PCR 扩增。
mdhar 基因 PCR 扩程序 ：94℃预变性 3 min ；94℃变
性 1 min，58℃退火 1 min，每经过一个循环退火温
度降低 1℃，7 个循环，72℃延伸 1 min ；94℃变性
1 min，50℃退火 1 min，72℃延伸 1 min，31 个循环，
最后再 72℃延伸 1 min。ao 基因退火温度从 56℃降
到 50℃，其他程序与 mdhar 基因相同。取 5 μL 扩增
产物经琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。
PCR 产 物 采 用 琼 脂 糖 凝 胶 DNA 回 收 试 剂 盒
进行回收，并将回收的 PCR 片段连接到 pMD19-T
Vector 上，转化大肠杆菌 JM109，再在涂有 IPTG 的
Amp-LB 固体培养基上培养，随机挑取白色单菌落
于 Amp-LB 液体培养基中 37℃培养过夜，提取质粒，
对质粒进行电泳快速检测，以确定阳性克隆。确定
阳性克隆后，培养新鲜菌液，各取适量交由上海生
工生物公司进行测序。
1.2.4 序列分析 同源性比较在 NCBI（National Cen-
ter for Biotechnology Information，http://www.ncbi.nlm.
nih.gov）网站使用 BLAST（Basic Local Alignment Se-
arch Tool，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Blast）搜索比对；
利用 DNAMAN 软件进行核苷酸序列分析，并绘制克
隆片段与已知该基因的系统进化树，分析它们的进
化关系。
2 结果
2.1 草莓果实总RNA的提取
所提取的草莓果实总 RNA 经 1% 的琼脂糖凝胶
电泳检测（图 2），28S 和 18S 条带清晰完整，经核
酸蛋白分析仪测定 OD260nm/280nm=1.86，表明所提的草
莓果实总 RNA 的完整性和纯度均较高，符合后续试
验要求。
M. 200 bp DNA Ladder ；1. 草莓果实总 RNA
图 2 草莓果实总 RNA 凝胶电泳图
28S
18S
4000
bp
M 1
1000
1600
2.2 mdhar基因片段和ao基因片段的扩增
以 草 莓 总 RNA 反 转 录 成 的 cDNA 为 模 板，
mdhar 基因以 MRf 和 MRr 为上下游引物，ao 基因以
AOf 和 AOr 为上下游引物进行 PCR 扩增。PCR 产物
经 1% 的琼脂糖凝胶电泳检测，在 200-400 bp 之间
（图 3）和 800 bp（图 4）左右各有一条明亮的条带，
分别与预测的片段大小相符，初步断定所得条带为
目的条带，然后采用琼脂糖凝胶 DNA 回收试剂盒进
行回收。
2.3 PCR产物的克隆
将回收的目的片段连接到 pMD19-T Vector 上，
转化大肠杆菌 JM109，通过筛选获得了有插入外源
基因 mdhar（图 5）和 ao（图 6）的阳性克隆。
2.4 扩增产物测序结果与分析
根据测序结果，草莓 mdhar 基因长 372 bp，推
测编码 123 个氨基酸（图 7）；ao 基因长 842 bp，推
测编码 280 个氨基酸（图 8）。NCBI 登录号分别为
JQ320104 和 JQ320105。
利用 NCBI-BLAST 工具进行所得基因序列分别
与不同植物来源的 mdhar 基因和 ao 基因序列同源性
比对，结果如表 2 和表 3 所示。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第11期86
M. 200 bp DNA Ladder ；1. ao 基因片段
图 4 ao PCR 扩增产物凝胶电泳图图 3 mdhar PCR 扩增产物凝胶电泳图
M. 200 bp DNA Ladder ；1. mdhar 基因片段
ⴞⲴᶑᑖ㓖400 bp
4000
bp
M 1
200
1000
400
600 ⴞⲴᶑᑖ㓖800 bp
4000
bp
M 1
200
1000
400
600
1-4, 6. 阳性克隆 ；5. 非阳性克隆 ；0. 对照，即已插入 200 bp 外
源基因片段的重组质粒电泳条带，并经过测序确定，下同
图 5 mdhar 基因转化大肠杆菌挑选质粒电泳图
mdhar䱣ᙗݻ䲶ሩ➗
0 1 2 3 4 5 6
ao䱣ᙗݻ䲶ሩ➗
0 1 2 3 4 5 6
图 6 ao 转化大肠杆菌提取质粒电泳图
0. 对照 ；1, 2. 非阳性克隆 ；3-6. 阳性克隆
图 7 mdhar 基因测序结果及推测的氨基酸序列
图 8 ao 基因测序结果及推测的氨基酸序列
2012年第11期 87林源秀等 ：草莓 MDHAR 及 AO 基因的克隆及序列分析
利用 DNAMAN6.0 软件绘制 mdhar 基因及 ao 基
因与其他植物的同源树及系统进化树。
由图 6-A 同源树图可以看出，草莓 mdhar 基因
首先跟刺梨聚类，其次与苹果聚类，再与其他类群
的植物聚类，说明草莓与刺梨和苹果的同源性较高，
与在 NCBI 上不同植物来源 mdhar 基因序列同源性
比对结果一致。而从图 6-B 进化树可以看出，草莓
首先还是与刺梨聚为一类，表明它们的进化关系较
近，估计草莓与刺梨在进化过程中，具有某些相似
的生理特性和形态特征。
由图 7-A 可以看出 ：黄瓜 ao 基因与甜瓜聚为一
类，再与草莓聚为一类，然后与其他植物聚类，说
明草莓与黄瓜和甜瓜的同源性最高。由图 7-B 可知 ：
草莓首先与笋瓜聚类，黄瓜与甜瓜首先聚类，再与
草莓和笋瓜聚类，再与其他植物聚类，说明草莓和
笋瓜的亲缘关系最近，与黄瓜和甜瓜次之。
表 2 草莓 mdhar 序列与其他植物 mdhar 序列同源性比较
植物来源 核苷酸序列一致性（%） 氨基酸序列一致性（%） 基因登录号
Rosa Roxburghii 96 92 GU552461
Malus domestica 88 91 FJ752239
Ricinus communis 83 87 XM002533956
Vitis vinifera 79 84 EF554360
Oryza sativa 76 77 D8571558
Camellia sinensis 77 77 FJ014470
Cucumis sativus 78 79 DQ641068
Brassica 78 79 AB125637
Lycopersicon esculentum 76 37 L41345
表 3 草莓 ao 序列与其他植物 ao 序列同源性比较
植物来源 核苷酸序列一致性（%） 氨基酸序列一致性（%） 基因登录号
Glycine max 68 69 AF529300
Cucumis sativus Linn 70 70 FR750377
Arabidopsis thaliana 66 66 XM002871921
Cucumis melo 70 70 AF233594
Pisum sativum L. 69 68 AB457618
Brassica 67 67 AF206721
Lycopersicon esculentum 67 66 AY971876
Ricinus communis 68 67 XM002530151
Cucurbita maxima 69 68 D55677
图 6 基于 mdhar 基因核苷酸序列构建的同源树（A）以及核苷酸序列系统进化树（B）
96%
89%
77%71%
81%76%
72% 48%
90% 80% 70% 60% 50% 40% 0.05
0.009 0.027
0.012
0.035
0.163
0.001
0.006
0.074 0.131
0.1120.011
0.116
0.139
0.159
0.254
13
⭈㬍
ኡ㥦
㥹㧃
ࡪỘ
㤩᷌
㪑㨴
哴⬌
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⮚㤴
⭈㬍
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㥹㧃
ࡪỘ
㤩᷌
㪑㨴
哴⬌
≤に
⮚㤴
A B
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第11期88
3 讨论
草莓、刺梨以及苹果同属蔷薇科植物，它们之
间核苷酸序列相似程度以及氨基酸相似性都较与其
他植物的相似性高，因此本试验扩增所得到的草莓
mdhar 基因与蔷薇科蔷薇属植物刺梨及蔷薇科苹果
属植物首先聚类，再与其他不同植物聚类，并且在
NCBI 数据库比对结果表明克隆到的 MDHAR cDNA
371 bp 碱基序列确为草莓 MDHAR cDNA 片段。在
植物中单脱氢抗坏血酸还原酶有胞质、叶绿体、线
粒体等几种存在形式［13］，本研究克隆所得到的草莓
mdhar 编码的氨基酸序列与刺梨、苹果、黄瓜、水
稻等胞质来源的 MDHAR 同源性较高，初步推断本
研究所得的草莓 mdhar 基因编码的 MDHAR 为胞质
MDHAR。
AO 属 于 多 铜 氧 化 酶 家 族， 定 位 于 植 物 细 胞
壁［14］，不同植物来源的 ao 基因具有相似的结构［15］。
Kisu 等［16］ 从南瓜（Cucurbita sp.）中克隆到的 AO
基因由 4 个外显子和 3 个内含子组成，其中外显子
的序列与不同来源 AO 的 cDNA 上的对应序列一致。
本研究克隆得到的 ao 基因编码的氨基酸序列与南瓜
该基因编码的氨基酸序列一致性并不是最高，但在
系统进化树中，草莓首先和南瓜聚为一类，说明草
莓和南瓜在进化上亲缘关系较近。
迄今人们对 AO 的分子结构、催化机制、表达
调控和参与的生理现象进行了较为广泛的探究，但
对 AO 和不同的信号途径之间的关系还不清楚 ；对
MDHAR 逆境胁迫中的表达及其与抗坏血酸的再生
关系已有部分研究。本研究利用 CODEHOP 设计简
并引物，并结合 Touchdown PCR——设计多循环以
使相连循环的退火温度从高到低变化，从而达到最
佳扩增条件的行之有效的 PCR 方法，省却了常规
PCR 中摸索最适退火温度的过程的同时，减少了非
特异片段的扩增，有效的得到了草莓中抗坏血酸代
谢的相关酶 mdhar 及 ao 基因片段，为进一步分离和
鉴定这两种基因奠定了基石，同时为揭开其具体作
用机制提供理论依据 ；也为进一步利用该基因改良
草莓及其他园艺植物增强抗坏血酸含量打下基础，
具有一定的应用价值和现实意义。
4 结论
本研究以草莓栽培品种‘丰香’为材料，分
离并报道了抗坏血酸 - 谷胱甘肽循环中两个重要
酶——MDHAR 及 AO 基因片段序列。并经过序列分
析得到，mdhar 基因编码的氨基酸序列与苹果属植
物同源性最高为 91% ；ao 基因编码的氨基酸序列与
黄瓜和甜瓜的同源性最高为 70%。
参 考 文 献
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90%100% 80% 70% 60% 50% 0.05
92%
70%
74%
64%
66%
62%
73% 56%
54%
A B
0.003
0.004
0.091
0.031
0.014
0.048
0.119
0.264
0.140
0.1640.136
0.1380.036
0.0640.023
0.123
0.041
0.226
㥹㧃
⭌⬌
哴⬌
བྷ䉶
䉼䉶
㬆哫
ㄻ⬌
⮚㤴
㣨㯩኎
ᤏই㣕
㥹㧃
⭌⬌哴⬌
བྷ䉶䉼䉶
㬆哫
ㄻ⬌
⮚㤴
㣨㯩኎ᤏই㣕
图 7 基于 ao 基因核苷酸序列构建的同源树（A）以及核苷酸序列系统进化树（B）
2012年第11期 89林源秀等 ：草莓 MDHAR 及 AO 基因的克隆及序列分析
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（责任编辑 李楠）