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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第10期
迄今为止，已发现有 20 多种淀粉样蛋白沉积
疾病，如阿尔茨海默病、帕金森病、Ⅱ型糖尿病、
疯牛病和亨廷顿病等［1，2］。蛋白质沉积疾病很大一
部分具有高度的致死性，它们共同的特征是蛋白质
纤维化聚合物成为细胞内含物或细胞外的淀粉样物
质［3］。研究蛋白质错误折叠和聚集分子机制对于阐
明淀粉样蛋白沉积疾病和更多相关疾病的病理学分
子基础和生化基础具有非常重要的作用，而获得大
量具有生物学活性、高纯度的淀粉样沉积前体蛋白
是完成以上研究的前提和必要保证。近年，已被证
实的人体淀粉样物质的前体蛋白已超过 30 种，其中
比较常见和著名的有 Aβ 肽、Tau、朊病毒、α-突触
收稿日期 : 2012-04-26
基金项目 : 教育部留学回国人员科研启动基金［教外司留（2010）1561 号］, 国家自然科学基金项目（30970152）, 辽宁省教育厅优秀人才
项目（2009R26）
作者简介 : 何剑为 , 男 , 博士 , 副教授 , 研究方向 : 淀粉样蛋白聚集机制 ; E-mail: jwhe@lnu.edu.cn
通讯作者 : 宋有涛 , 男 , 博士 , 教授 , 研究方向 : 淀粉样蛋白聚集机制 ; E-mail: ysong@lnu.edu.cn
淀粉样蛋白纯化方法的研究进展
何剑为1 陈应广1 王禹1 宋有涛1，2
（1 辽宁大学生命科学院，沈阳 110036 ；2 辽宁大学环境学院，沈阳 110036）
摘 要： 淀粉样纤维是一种富含 β折叠的高度有序的由淀粉样蛋白前体聚集而成的蛋白聚集体。由于淀粉样蛋白较普通蛋
白具有不稳定、易于聚集的特性，此类蛋白的表达和纯化与常规方法有较明显的差别，主要体现在更为严格的技术和过程要求。
基于近年来淀粉样蛋白分离纯化技术领域取得的进展，并结合作者的相关研究，总结淀粉样蛋白的分析和制样方法，为淀粉样蛋
白沉积疾病的分子机理研究提供理论依据和技术支撑。
关键词： 淀粉样蛋白 提取 分离 纯化
Progress in Research of Amyloidogenic Protein Purification Methods
He Jianwei1 Chen Yingguang1 Wang Yu1 Song Youtao1，2
（1School of Life Science，Liaoning University，Shenyang 110036；2School of Environmental Sciences，
Liaoning University，Shenyang 110036）
Abstract: Amyloid fibrils is a class of highly ordered protein aggregates that are rich of cross-β structure, they are aggregated from
amyloidogenic or amyloid prone precursor protein. Owing to its low stability and high aggregation properties compared to ordinary proteins, the
methods of expression and purification of this kind of protein have a big difference compared to non-amyloidogenic proteins, mainly reflected in
more strictly requirement of technology and procedures. Based on the progress of the purification strategies of amyloidogenic proteins in recent
years and the authors’ research experience in the field, this article summarized the methods of both amyloidogenic protein sample preparation
and sample analysis, provided theoretical foundation and technical support for the studies on the mechanism of amyloid deposition diseases.
Key words: Amyloid protein Extract Separate Purification
核蛋白、胱抑素 C、亨廷顿蛋白、免疫球蛋白轻链、
溶菌酶和胰岛素等［4］。这些前体蛋白在一定条件下
很容易形聚集成淀粉样纤维。随着分子生物学实验
水平的提高，有关淀粉样蛋白聚集分子机制的研究
需要大量的分离纯化的蛋白才能实现，而除了个别
的淀粉样前体蛋白可直接从动植物组织提取外，大
部分淀粉样前体蛋白都不能直接分离得到。目前大
多采用体外重组技术表达生产淀粉样前体蛋白，然
而体外获得大量高纯度有活性蛋白的过程要求经过
多步分离纯化的复杂操作。本研究主要根据淀粉样
前体蛋白的来源，从天然动物病变的组织的直接提
取、重组蛋白的细胞不溶性表达、重组蛋白的细胞
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第10期70
可溶性表达 3 个方面阐述了近年来淀粉样蛋白分离
纯化方法的研究进展。
1 天然动植物组织中淀粉样蛋白的纯化方法
从天然的病变组织里提取淀粉样蛋白，更好地
保证了所研究病变蛋白的原始结构和特性，也能够
较好地保证目的淀粉样前体蛋白的活性和完整性［5］。
现在很多研究者依然钟情于直接从病变组织中提取
目的蛋白，其纯化过程也因蛋白的不同而有所差
异，但其机理都是相似的。例如，Westermark 等［6］
从富含淀粉样物质的心肌层组织中直接提取甲状腺
素转运蛋白（TTR），其纯化基本过程为 ：用丙酮
两次溶解材料后干燥，然后用高浓度盐酸胍溶液溶
解样品，凝胶过滤后透析，透析完毕再次用高浓度
盐酸胍溶液溶解样品，向溶液中添加二硫基苏糖醇
（DTT）后过夜孵育，再次凝胶过滤，收集蛋白峰的
样品，将这些蛋白直接上样于 Thiopropyl 琼脂糖凝
胶 CB-CL 柱，收集后进行透析，冻干之后利用包含
盐酸胍、DTT 溶液再次溶解，然后通过聚丙烯酰胺
葡聚糖凝胶 S-300 柱凝胶过滤精制，得到高纯度的
全长的 TTR 片段。Rashid ［7］从新鲜的胎盘组织中提
取胱抑素，将人胎盘组织在中性 pH 的缓冲液处理，
离心，调节 pH 为 3.0，60℃孵育，去除杂质蛋白，
然后调节 pH 到 6.0，离心 15 min，将上清液进行盐析，
然后将沉淀蛋白溶解透析，溶解蛋白进行葡聚糖凝
胶 G50-80 凝胶过滤层析，得到较高纯度的目的蛋白。
从天然的病变组织里提取蛋白，因为动植物组织都
为真核细胞，在蛋白的获取过程中，往往需要大量
的病变组织。在提取过程中，由于混有大量杂蛋白，
蛋白的纯化过程中需要考虑的除杂问题更多，纯化
过程比较繁琐。
2 包涵体形式表达的淀粉样蛋白纯化方法
当淀粉样重组蛋白以包涵体形式存在时，可获
得高表达、高纯度的重组蛋白，能够避免蛋白酶对
外源蛋白的降解，但不具有生物活性。因此，要对
其进行分离纯化就需要对包涵体进行变性、复性处
理。由于包涵体为一封闭的难溶的细胞内单元，必
须首先将其溶解后才能进行蛋白纯化。包涵体的裂
解一般都采用强变性剂处理，如脲、盐酸胍或硫氰
酸盐等［8，9］。对于含有半胱氨酸的蛋白，还需加入
还原剂，如巯基乙醇、DTT、二硫赤藓糖醇。温度
一般选择在 30℃以促进溶解。此外，由于金属离子
具有氧化催化作用，还常常需要加入金属螯合剂，
如 EDTA、EGTA 等以去除金属离子。对于细胞周质
内形成的包涵体，则需采用原位溶解的方法［10，11］。
对包涵体进行溶解之后，要想获得高纯度淀粉样前
体蛋白还需要进一步的纯化。常用的方法有金属亲
和层析、凝胶过滤层析、离子交换层析、疏水层析、
双水相萃取技术和反胶团相转移技术等。因淀粉样
蛋白都有易聚集的特性，所以对淀粉样蛋白形成的
包涵体进行纯化时，更需要注意避免如包涵体的浓
度、纯化体系温度、pH 值和盐离子等因素的影响［12］。
经过纯化获得的重组蛋白产量虽高，蛋白质的二级
结构已被破坏，需经蛋白复性才可能恢复它的生物
活性。常用的方法有梯度稀释复性、复性色谱、吸
附复性、凝胶过滤层析复性和双水相法复性等［13， 14］。
包涵体表达淀粉样蛋白最具代表性的为阿尔茨
海默病的致病蛋白 Aβ 肽。Aβ 肽的肽链长短略有不
同，其中 Aβ40 在体内含量最多，但 Aβ42 更易于形
成斑块样的沉积。Walsh 等［15］在大肠杆菌中以包涵
体的形式分泌表达的 Aβ 蛋白采用阴离子交换树脂
柱进行纯化，上样后树脂柱用 NaCl 低盐溶液梯度
洗脱，所有的操作都在微碱性 pH 条件下进行。包
涵体用阴离子交换树脂经过两步纯化可以得到高纯
度蛋白样品，每升培养基大约可以纯化得到 10-20
mg Aβ42 蛋白。试验证明，纯化 Aβ42 或者 Aβ40 用
离子交换树脂的分步洗脱产率要比一步洗脱得到的
蛋白的产率高很多。Sharpe 等［16］用大肠杆菌 BL21
（DE3）表达 KSI-（Aβ11-26）-His 融合蛋白。超声
破碎菌体后高速离心收集得到包涵体，复性后，接
着用 Ni-NTA 树脂与蛋白混合孵育，最后将树脂注
入重力沉降柱，用 6 mol/L 盐酸胍缓冲液清洗，得到
KSI-（AB11-26）融合蛋白，经过透析，低压冻干得
到目标融合蛋白。综上所述，原核包涵体表达时，
因原核生物的包涵体表达适用于分子量较小的淀粉
样前体蛋白［17］。其纯化后结构复性比较容易。纯化
时一般需要先裂解菌体，然后进行包涵体的溶解，
待溶解之后可依据淀粉样蛋白的大小等特性进行纯
化，最后再对其进行复性。相较于一般蛋白，淀粉
样前体蛋白在纯化过程中需特别注意在纯化时应尽
2012年第10期 71何剑为等 ：淀粉样蛋白纯化方法的研究进展
量避免蛋白的聚集。因此需要多重考虑纯化时的温
度、pH、纯化时间等因素对蛋白的聚集的影响［18-20］。
3 可溶性表达淀粉样蛋白的纯化方法
目前很多重组淀粉样蛋白的可溶性表达可以通
过原核和真核表达系统实现，表达系统不同，获得
高纯度、高活性的目的蛋白的纯化策略也有所不同。
3.1 原核系统表达分泌型淀粉样蛋白的纯化
原核表达系统常用的为大肠杆菌表达系统，在
该系统里，胞外表达与胞内表达相比，重组蛋白分
泌到细胞周质或胞外培养基显示出许多优势。因此，
众多研究者都设法在原核表达系统里让目的蛋白分
泌到胞外，从而减少纯化的困难［21］。但是对于易于
聚集的淀粉样前体蛋白来说，研究者会面临更多的
纯化问题。利用原核分泌性表达蛋白，在策略上可
以分为两类 ：一类是不对靶蛋白进行修饰 ；另一类
是对靶蛋白进行分子改造。
Garai 等［22］为了纯化得到大量的可溶的 Aβ 多
肽，采用在大肠杆菌细胞表达 Aβ 融合蛋白，收集
菌体进行超声波破碎，适当处理后用镍柱（Ni-NTA）
进行纯化，结果显示，可溶性蛋白的量可达到 1.4
mg/mL，收率超过了 90%。然后用 Xa 因子蛋白酶切
割分开 Aβ 和 IFABP 蛋白，样品再经过 C18 HPLC
柱纯化，最后得到高纯度的可溶的 Aβ 肽。魏海燕
等［23］成功构建了 GST-Sup35NM 融合蛋白（Sup35p
为酵母朊病毒［PSI+］的单体形式）并在大肠杆菌
中进行了表达，为了得到较高纯度的 GST-Sup35NM
蛋白，破碎菌体后离心，将上清与 Ni2+-螯合琼脂糖
凝胶混合后置冰上孵育，缓慢振摇过夜，然后离心
收集 Ni2+-螯合琼脂糖凝胶，最后洗脱得到较高纯度
的目的融合蛋白。Barghorn 等［24］将重组的另一种
阿尔茨海默症病原蛋白 tau 在大肠杆菌细胞系 BL21
（DE3）中进行高效分泌性表达，在破碎细胞后，分
别利用高盐溶液及沸水浴处理，使除 tau 蛋白之外
的所有蛋白变性，离心后取上清液透析并上样于阳
离子交换柱，浓度梯度洗脱，精馏至终体积为 0.5-1
mL，其中包含 5-10 mg tau 蛋白。进一步通过凝胶
过滤可得到 99% 以上纯度的 tau 蛋白。综上所示，
淀粉样蛋白在原核细胞里的可溶性表达一般都是通
过对把蛋白进行修饰或者对靶蛋白进行改造。当对
目的蛋白进行纯化时，一般都要先获得纯化的融合
蛋白，然后切割融合蛋白获得目的蛋白，再进一步
进行纯化，就能获得高纯度，更接近天然活性的淀
粉样蛋白。从而有效避免了纯化过程中因纯化时间
过长而引起目的淀粉样蛋白的大量聚集。
3.2 真核系统表达分泌性淀粉样蛋白的纯化
原核表达系统虽然在淀粉样蛋白表达方面使用
广泛，但它还存在许多难以克服的缺点 ：该表达系
统无法对表达时间及表达水平进行调控 ；不能对表
达的蛋白质进行翻译后修饰 ；表达产物的生物活性
较低，这对于淀粉样蛋白的表达是较大的缺陷［25］。
真核表达系统具有翻译后的加工修饰体系，表达的
外源蛋白更接近于天然蛋白质。真核表达系统蛋白
表达水平高，生产成本低，越来越多的科研人员选
择真核系统表达目的蛋白［26］。基因工程中常用的真
核表达系统有酵母表达系统、昆虫细胞表达系统及
哺乳动物细胞表达系统。
3.2.1 酵母表达系统 在酵母表达系统中，将淀粉
样蛋白分泌到胞外，一方面有利于产物的提取与纯
化 ；另一方面可减轻宿主细胞的代谢负荷。为了提
高外源蛋白的分泌水平，一般情况下研究人员会在
表达载体中加入分泌信号序列。分泌信号可以是外
源蛋白自身的信号序列，也可为酵母菌的同源信号
序列，从而极大程度地降低了淀粉样蛋白的纯化难
度［27］。例如，本研究团队在表达载体中加入分泌信
号肽的编码序列，成功将重组鸡胱抑素淀粉样突变
体 I66Q 和鸡溶菌酶突变体分别在毕赤酵母、酿酒
酵母中进行分泌性表达。为得到高纯度重组鸡胱抑
素蛋白突变体 I66Q，将酵母培养液离心去除菌，经
过 10%、45% 和 60% 浓度的硫酸铵盐析，透析除盐
后，上样于 CM-Toyopearl 离子交换树脂，梯度洗脱
蛋白，得到纯度在 99% 以上的重组鸡胱抑素蛋白突
变体蛋白［28］。而在获取高纯度鸡溶菌酶突变体时，
通过离心收集培养基里的细胞上清液，然后用 CM-
Toyopearl 650 mol/L 柱子进行纯化，经过分布洗脱，
收集样品，除掉盐分之后，通过离心浓缩收集到高
浓度鸡溶菌酶突变体蛋白［29］。综上可看出，在酵母
表达系统中进行表达目的蛋白，为方便纯化，一般
通过加入分泌性信号序列，使目的蛋白分泌性表达，
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第10期72
纯化时可直接收集上清液，进行离子交换树脂或者
凝胶过滤层析纯化便可得到较高纯度目的蛋白。
3.2.2 昆虫细胞表达系统 昆虫细胞表达系统（即
杆状病毒表达系统）能容纳大分子外源基因的插入
片段，能同时表达多个基因，安全性好，表达水平高，
可进行翻译后加工，并且表达产物的异源性小，对
重组蛋白有进行定位的功能［30］。因此，昆虫细胞表
达系统在表达癌症相关基因或有潜在毒性的蛋白时
可能优于其他系统，也是一种较理想的真核表达系
统。例如，Panagotopulos 等［31］为建立大量生产和制
备载脂蛋白 A-I（ApoA I）载脂蛋白的方法，用重组
昆虫杆状病毒表达系统来高效表达了 ApoA I 载脂蛋
白。其纯化方法为 ：取悬浮培养细胞的上清液，加
入硫酸铵至终浓度为 0.1 mol/L，然后上样至 Phenyl
琼脂糖凝胶层析柱。分别用水、30% 丙二醇、70%
丙二醇分步洗脱，得到重组蛋白。纯化后分析显示
表达量接近 100 μg/mL。Redaelli 等［32］为了获得重
组人溶菌酶，采用在昆虫细胞系 Sf9 高效分泌表达
重组人溶菌酶，其采用自动高通量纯化方法如下 ：
包含重组蛋白的培养液上清经 PD-10 分子排阻层析
初步纯化，将所得高分子量组分转入 96 深孔平板应
用 IMAC 金属螯合亲和层析结合 MultiPROBE II HT
EX workstation 自动纯化重组蛋白。另一种方法是应
用 96 孔过滤平板使包被了 Ni-NTA 琼脂糖亲和纯化
基质的磁性颗粒与上清混合震荡，磁珠通过磁力架
被沉淀下来，后经两步洗脱法洗去杂质，最后可在
天然和变性条件下洗脱得到较高纯度目的蛋白。综
上所述，在昆虫表达系统进行重组蛋白表达纯化时，
因该系统表达水平高，未破坏蛋白质二级结构及三
维构象，纯化时大多采用粗提蛋白后，经凝胶过滤
层析等精制方法进行纯化，洗脱得到目的蛋白。
3.2.3 哺乳动物细胞表达系统 在基因工程领域，
哺乳动物细胞表达系统日益受到人们的重视。许多
重要的具有医疗价值的蛋白在大肠杆菌表达系统中
无生物活性或活性很低，这是由于在此系统中许多
真核蛋白不能完成翻译后修饰，如糖基化、酞胺化、
二硫键的正确连接和亚基的正确装配［33］。而哺乳动
物细胞表达系统能够指导蛋白质的正确折叠，提供
复杂的 N 型糖基化和准确的 O 型糖基化等多种翻译
后加工功能，因而表达产物在分子结构、理化特性
和生物学功能方面最接近于天然的高等生物蛋白质
分子［34］。Prelli 等［35］利用人肾细胞系 HEK293 进
行人胱抑素淀粉样突变体的大量表达，在培养完组
织细胞之后用磷酸缓冲液清洗细胞，过夜孵育，然
后离心过滤，低压冻干样品，用碳酸氢铵透析，最
后将上清液通过 DEAE-葡聚糖纤维素柱，浓度梯度
洗脱蛋白，可得到纯度 99% 以上的人胱抑素淀粉
样突变体。人胰岛淀粉样多肽（human islet amyloid
polypeptide，hIAPP）具有很强的错误折叠、形成淀
粉样蛋白聚集的倾向，是目前已知的淀粉样聚集性
最强的多肽之一。Zhang等［36］发现通过采用1，1，1，3，
3，3-hexaXuoro-2-propanol（HFIP）或者二甲基亚砜
（DMSO）溶解 IAPP 聚集体，然后采用双缓冲液系统，
用 HCl 作为离子配对试剂，用 Vydac C18 反相分析
柱进行纯化能够明显提高高聚集特性的 IAPP 纯度。
利用该系统进行淀粉样蛋白表达后进行纯化时，因
哺乳动物表达系统能够正确指导蛋白质的折叠，蛋
白质的构象也接近天然蛋白，无需变性、复性等操作，
纯化难度也会相对降低。
综上所述，在进行淀粉样蛋白的表达纯化时，
对于分子量较大的蛋白来说，其构象也相对较复杂。
在表达时，一般需要进行折叠修饰，才能接近或达
到天然构象。因此，真核分泌性表达系统成为这一
类蛋白体外表达的首选。在真核系统中表达，一般
都具有分泌性表达的特性，这也有助于易聚集的淀
粉样蛋白的纯化。对于纯化聚集性较强的蛋白，除
了要考虑纯化时，温度、pH 和浓度等的影响外，还
应该添加一些聚集抑制剂防止蛋白的聚集。
4 展望
淀粉样蛋白除了具有蛋白的一些共有性质外，
还具有易聚集的特性，因此对这类蛋白进行表达纯
化时，首要考虑的是如何既能避免这类蛋白的聚集，
又不影响其活性。在实际纯化操作中，每种蛋白质
都应该拥有自身的一套纯化方案。根据每一种蛋白
自身的特性，如大小、形状、电荷、疏水性、溶解
度和生物学活性等的差异，以及一些外部因素。如
纯化温度、pH 值、浓度等因素进行蛋白质纯化方案
的选择。这往往也需要组合多种纯化方法纯化一种
蛋白，以期望能够得到高产率、高纯度、有活性的
2012年第10期 73何剑为等 ：淀粉样蛋白纯化方法的研究进展
蛋白。淀粉样蛋白虽是一类特殊蛋白，但是其纯化
方案选择的过程是可以应用于整个蛋白纯化领域。
淀粉样蛋白纯化技术的进步也必将促进其他蛋白纯
化技术的进步。未来，随着淀粉样蛋白质纯化技术
的发展，必将不断促进对淀粉样蛋白质性质的研究，
与此同时，淀粉样蛋白质性质的研究也将反过来推
动蛋白质分离纯化技术的进步，两者的互相促进将
极大地推动蛋白质结构和功能研究。
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（责任编辑 狄艳红）