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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第2期
蛋白质谷氨酰胺酶（EC 3.5.1.44）是一种催化
水解蛋白质肽链中谷氨酰胺侧链残基中的酰胺基，
并释放出氨的酶。蛋白质谷氨酰胺酶在细胞中广泛
存在，对蛋白质在转录后的修饰加工过程中起作用，
如调节蛋白质的正确折叠，并在蛋白质的肽链断裂
和蛋白质老化等生理过程中也发挥作用［1］。许多植
物种子的蛋白质中含有较多的谷氨酰胺残基，以给
种子发芽提供丰富的氮源，如大豆蛋白、谷物蛋白
等。这些植物蛋白在食品工业中有广泛的应用，但
收稿日期 ：2013-08-01
基金项目 ：自然科学基金项目（81072422），国家大学生创新创业训练计划项目（1310269039），上海市大学生创新基金项目（KY2012-60S）
作者简介 ：关静，女，研究方向 ：食品微生物 ；E-mail ：k378897850@163.com
通讯作者 ：高红亮，副教授，研究方向 ：微生物学，食品化学、食品添加剂 ；E-mail ：hlgao@bio.ecnu.edu.cn
微生物蛋白质谷氨酰胺酶的初步分离纯化
关静  孙仁强  宋佳雯  黄迪  成楠  岑院汉凤  张扬  陈曦乐   
赵怡姗  朱晨旦  郑烨  康立  高红亮
（华东师范大学生命科学学院，上海 200241）
摘 要 ： 蛋白质谷氨酰胺酶可以特异性地水解蛋白质和多肽的谷氨酰胺残基，研究了产吲哚金黄杆菌产生的微生物蛋白质
谷氨酰胺酶的代谢曲线和初步的分离纯化。发酵过程中 pH 升高，氨浓度增加，到 14 h 时酶活达到最高为 0.359 U/mL。发酵液离
心去上清液经 3 kD 滤膜超滤 4 倍时，纯化倍数和得率都最高。超滤液加入 4 倍体积无水乙醇沉淀蛋白质，酶的得率最高为 72.7%。
沉淀用缓冲液复溶后，经过 SP-Sepharose Fast Flow 离子交换层析分离，得到单一峰。经过多步纯化后酶得率为 31.72%，纯化倍数
为 124 倍，经 SDS-PAGE 电泳鉴定为单一条带，分子量约为 20 kD。
关键词 ： 微生物蛋白质谷氨酰胺酶 超滤 乙醇沉淀 离子交换层析 SDS-PAGE
Extraction and Purification of Microbial Protein—Glutaminase
Guan Jing Sun Renqiang Song Jiawen Huang Di Cheng Nan Ceng yuan Hanfeng Zhang Yang Chen Xiyue
Zhao Yishan Zhu Chendan Zheng Ye Kang Li Gao Hongliang
（School of Life Science，East China Normal University，Shanghai 200241）
Abstract:  Protein glutaminase（PG）is an enzyme that catalyzes the specific hydrolysis of glutaminyl residues in proteins and peptide.
The metabolic pattern of Chryseobacterium indologenes in PG synthesis and primary purification of PG were studied. The pH value and ammonia
concentration increased during the fermentation. The maximal PG activity reached 0.359 U/mL for 14 hours culture. The efficiency of purification
and yield of PG were maximal when culture borth was centrifuged and the supernatant was concentrated for four times by ultrafiltration with 3 kD
cut-off membrane. Ultrafiltrate was precipitated by 4 times volumes ethanol and the maximal yield of PG was 72.7%. Precipitated PG by ethanol
was dissolved in PBS buffer and further purified by SP-Sepharose Fast Flow ion-exchange chromatography. A single peak was got in elution
profile. The final yield of PG was 31.72% and the PG was purified 124 times after multiple purification steps. The purified sample contained a
single band in SDS-PAGE and corresponding molecular weight was about 20 kD.
Key words:  Microbial protein glutaminase Ultrafiltration Ethanol precipitation Ion-exchange chromatography SDS-PAGE
是蛋白质中的高谷氨酰胺含量导致了其在弱酸性环
境中（大多数食品系统的 pH 范围）溶解性很低，
限制了其应用范围。2000 年日本学者 Yamaguchi［2］
发现了一种由微生物产生的新的脱酰胺基酶，微生
物蛋白质谷氨酰胺酶。该酶是由从土壤中分离出一
株 金 黄 杆 菌 Chryseobacterium proteolyticum 产 生 的。
Yamaguchi 等对该酶进行了分离纯化和酶学性质的
研究，其等电点为 10，分子量为 20 kD 左右。该酶
仅作用于蛋白质或短肽的谷氨酰胺基团，而对天冬
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第2期162
酰胺残基或游离谷氨酰胺没有影响，不会导致蛋白
质肽链的交联和水解［1］。Yong 等［3，4］用该酶分别
脱去部分玉米胶蛋白和小麦蛋白的氨基，其溶解性
都得到了提高。用蛋白质谷氨酰胺酶脱去植物蛋白
中的谷氨酰胺残基，增加了带有负电荷的羧基，从
而降低了蛋白质的等电点，增加了蛋白质在弱酸性
环境中的溶解性［1］，同时蛋白质的乳化性、发泡性
和凝胶性等都有所增加。因此，在食品行业蛋白质
脱氨基作用被认为是一种改善植物蛋白功能特性的
好方法［5］。
本实验室从土壤中筛选出了一株产吲哚金黄杆
菌（Chryseobacterium indologenes），通过发酵和活性
测定，证明其能够产生微生物蛋白质谷氨酰胺酶，
进一步通过超滤、乙醇沉淀和离子交换层析，初步
分离得到蛋白质谷氨酰胺酶。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌 株 产 吲 哚 金 黄 杆 菌（Chryseobacterium
indologenes）华东师范大学微生物实验室分离并保存。
1.1.2 主要试剂 Cbz-Gln-Gly 购自上海西格玛公
司 ；蛋白含量测定试剂盒购自碧云天生物技术有限
公司 ；乙醇、苯酚、硝普钠等常规试剂为分析纯，
购自上海化学试剂公司 ；大豆蛋白胨、多聚蛋白胨
生化纯，购自上海生工生物科技有限公司 ；酵母提
取物，购自安琪酵母有限公司。
1.1.3 培养基 种子培养基（1 000 mL）蛋白胨 10
g，酵母提取物 2 g，MgSO4·7H2O 1 g，pH7.0 ；发
酵培养基（1 000 mL）乳糖 5 g，多聚蛋白胨 10 g，
Na2HPO4·H2O 1.7 g，MgSO4·7H2O 0.25 g，KH2PO4 0.25
g，FeSO4·7H2O 0.05 g，pH7.2。
1.1.4 主要仪器 冷冻离心机（Thermo electron cor-
poration）；恒温调速回旋式摇床（哈尔滨东明医疗器
械 厂 ）；超 滤 仪（Advanced MidJet Lab System，GE
Healthcare）；层 析 系 统（AKTA purify，GE Health-
care）；721 分光光度计（上海第三分析仪器厂）。
1.2 方法
1.2.1 培养方法 种子培养 取 0.6 mL 冻存于-80℃
的种子接种于 30 mL 种子培养基，200 r/min 30℃恒
温培养 10 h ；发酵培养 取培养好的种子以 2% 接种
量接种于发酵培养基，200 r/min 30℃恒温培养，期
间取样测定各种参数。分离纯化的发酵液是培养 12
h 后的发酵液。
1.2.2 发酵液粗酶液的制备 发酵液 8 500 r/min，
4℃离心 15 min，取上清液为酶的粗提液。
1.2.3 蛋白质谷氨酰胺酶的分离纯化
1.2.3.1 酶的超滤 以 3 kD 的滤膜进行超滤。超滤
压力为 15 psi，流速为 1.67 mL/min。PG 酶的分子量
约为 20 kD［1］，能透过滤膜的为透过液，不能透过
的为截留液。
1.2.3.2 乙醇沉淀 以体积比为 1∶4（截留液∶无
水乙醇）向截留液中缓慢添加无水乙醇（-20℃预
冷），-20℃静置 1 h。
1.2.3.3 沉淀复溶 乙醇沉淀后的样品 8 500 r/min，
4℃冷冻离心去上清，沉淀用 pH6.5 的 PBS 缓冲液
复溶。
1.2.3.4 离子交换层析 复溶后的样品经过 0.22 μm
滤 膜 过 滤 后 用 SP-Sepharose Fast Flow 离 子 交 换 树
脂进行层析，起始缓冲液为 20 mmol/L pH 值为 6.5
的 PBS 缓冲液，洗脱液为 20 mmol/L pH 值为 6.5 的
PBS 缓冲液中加入 1 mol/L NaCl 溶液。洗脱速度 2
mL/min 起始 NaCl 浓度为 0 mol/L，终点 NaCl 浓度为
0.25 mol/L，洗脱 10 个柱体积，根据 A280 来收集含
蛋白的吸收峰。
1.2.4 SDS-PAGE 电泳 采用 SDS-聚丙烯酰胺凝胶
电泳，浓缩胶浓度为 4%，分离胶浓度 10%，分别
取 80 μL 样品于 1 mL 离心管中，加入 20 μL 样品缓
冲液，沸水浴加热 5 min。用微量移液枪加样，每孔
加样 20 μL。
1.2.5 酶活测定方法［2］ 100 μL 底物溶液（含有 10
mmol/L Cbz-Gln-Gly 和 175.6 mmol/L 磷酸钠的缓冲液）
与 10 μL 酶液混合均匀，37℃温浴 30 min，然后加
入 100 μL 12% 的三氯乙酸终止反应。对照反应是先
加入三氯乙酸后再加入酶液。18 000 g 离心 5 min。
上清液中释放的氨用卢玉棋［6］的方法检测。酶活单
位定义为 ：上述条件下每分钟释放 1 μmol 氨的量为
一个酶活单位。
1.2.6 蛋白含量测定方法 采用碧云天生物技术有
限公司试剂盒，以牛血清白蛋白为标准蛋白，按照
说明书的方法进行测定。
2014年第2期 163关静等 ：微生物蛋白质谷氨酰胺酶的初步分离纯化
2 结果
2.1 蛋白质谷氨酰胺酶发酵生产的代谢曲线
试验首先分析了产吲哚金黄杆菌生长代谢规
律。从图 1 可以看出，该菌延滞期较短，接种 4 h
后进入对数期，12 h 后进入稳定期，最终发酵液
OD600 可达到 2.0。发酵液的 pH 值随着发酵时间的
延长不断升高，18 h 时 pH 值达到最高 8.6。发酵液
中氨增加的趋势和 pH 升高的趋势基本一致，这是
因为发酵液中的蛋白质谷氨酰胺酶分解蛋白质产生
氨，氨浓度不断增加，同时也导致了 pH 值不断升
高。蛋白质谷氨酰胺酶的酶活随着发酵时间延长而
增加，到 14 h 达到最大 0.359 U/mL，随后酶活略有
下降。
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18
7.0
7.5
8.0
8.5
9.0
p
H
pH
OD600nm䞦⍫ਁ䞥⏢≘⎃ᓖ
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
O
D
60
0n
m
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
0.35
0.40
䞦⍫
U/m
L
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
ਁ䞥
⏢≘
⎃ᓖ
μg
/m
L
ਁ䞥ᰦ䰤h
图 1 蛋白质谷氨酰胺酶发酵曲线
2.2 纯化条件的优化
2.2.1 超滤浓缩倍数的优化 发酵液离心后，取上
清液为粗酶液，用 3 kD 的超滤膜，以不同的浓缩倍
数对粗酶液进行超滤。由表 1 可以看出，粗酶液经
超滤浓缩 4 倍后，得率、比活和纯化倍数均最高，
比活为 0.519 U/mg，纯化了 2.65 倍，纯化效果最好。
因此超滤粗酶液过程中，采取浓缩 4 倍为最佳条件。
2.2.2 乙醇沉淀比例的优化 分别按不同体积比向
超滤后的截留液中加入预冷的无水乙醇进行沉淀，
以未加入无水乙醇的截留液的相对酶活为 100%，相
对酶活为沉淀复溶后酶液的总酶活占截留液总酶活
的百分比。由图 2 可知，当截留液和无水乙醇的体
积比为 1∶4 时，蛋白质谷氨酰胺酶的相对酶活最高，
为 72.73%，表明酶沉淀较为完全，因此 1∶4 的体
积比为最佳沉淀比例。
表 1 超滤不同浓缩倍数的纯化结果
浓缩倍数
（倍）
总酶活
（U）
总蛋白
（mg）
比活
（U/mg）
得率
（%）
纯化倍数
（倍）
2 146.06 476.39 0.306 58.82 1.33
3 113.88 377.56 0.302 54.12 1.54
4 149.15 287.77 0.519 70.88 2.65
5 101.00 246.70 0.409 48.00 2.09
6 82.11 221.30 0.371 39.02 1.90
⴨ሩ
䞦⍫
%
1ĩ3 1ĩ4 1ĩ5ᡚ⮉⏢оᰐ≤҉䞷Ⲵ∄ֻV/V
70
80
90
60
50
40
30
20
10
0
图 2 乙醇分级沉淀酶活得率
2.3 离子交换层析
对乙醇沉淀复溶液进行洗脱，随着 NaCl 浓度
的升高，电导也随之升高，结合在层析柱上的蛋白
随之被不断洗下来，最终得到单一的洗脱峰。蛋白
浓度（OD280nm）在第 5 管收集组分的位置达到最高，
为 52.12 mAU，与此相对应的第 5 管收集的酶活也
达到最高，为 18.03 U/mL（图 3）。在峰尖位置，电
导达到 7.40 mS/cm。
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
0
10
20
30
40
50
60
O
D
28
0n
m
mA
U

OD䞦⍫⭥ሬ
㓴࠶
0
5
10
15
20
25
30
䞦⍫
U/m
L
0
2
4
6
8
10
12
14
⭥ሬ
mS
/c
m

图 3 SP-Sepharose Fast Flow 离子交换层析
2.4 PG酶的分离纯化结果
经过上述步骤初步分离得到 PG 酶，由表 2 可知，
纯化后的酶，最终得率为 31.72%，纯化了 124.26 倍。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第2期164
表 2 蛋白质谷氨酰胺酶的纯化结果
纯化步骤
总酶活
（U）
总蛋白
（mg）
比活
（U/mg）
得率
（%）
纯化倍数
（倍）
粗酶液 135.46 1903.48 0.071 100.00 1.00
超滤 119.82 499.67 0.240 88.46 3.37
乙醇沉淀 87.14 42.16 2.067 72.73 29.05
离子交换 42.957 4.858 8.843 49.30 124.26
2.4 纯化产物的鉴定
粗酶液经超滤和乙醇沉淀复溶后的样品经 SDS-
PAGE 电泳鉴定，电泳结果如图 4 所示，粗酶液中
蛋白质谷氨酰胺酶的位置 20 kD 几乎没有条带，经
过超滤和乙醇沉淀后，该条带非常明显。
的酶目前报道比较多主要有谷氨酰胺转胺酶［7］、蛋
白酶［8］、肽谷氨酰胺酶［9］和蛋白质谷氨酰胺酶。谷
氨酰胺转胺酶和蛋白酶的主要酶促反应都不是谷氨
酰胺的脱氨基作用，用于植物蛋白脱氨时会有副作
用，并给食品带来不利的影响。肽谷氨酰胺酶虽然
可以专一性的脱氨，但是仅以多肽为底物进行反应，
对大分子量的蛋白质没有作用［9］。微生物蛋白质谷
氨酰胺酶可以专一性的催化蛋白质或多肽中的谷氨
酰胺残基脱氨，并且不具有蛋白酶和谷氨酰胺转胺
酶活性，因此应用前景非常广泛［1］，并应用于 α-玉
米蛋白［3］、小麦蛋［4］和大豆蛋白［10］，还有乳清蛋
白［11］和脱脂牛奶［12］等。
目前国内外对微生物蛋白质谷氨酰胺酶的分
离 纯 化 报 道 较 少， 仅 有 Yamaguchi 等［1］ 报 道 把
Chryseobacterium proteolyticum 发 酵 上 清 液 超 滤， 经
NaCl 沉 淀，Phenyl-Sepharose 疏 水 层 析，Sepcharyl
S-100 凝胶过滤层析后，酶最终纯化了 153 倍，得
率 为 30%， 经 SDS-PAGE 电 泳 鉴 定 为 单 一 条 带。
本研究收集产吲哚金黄杆菌的发酵上清液，经过
超 滤、 无 水 乙 醇 沉 淀、 缓 冲 液 复 溶 后， 经 过 SP-
Sepharose Fast Flow 离子交换层析分离，得到一个单
峰，纯化后的酶的得率为 31.72%，纯化倍数为 124
倍。经 SDS-PAGE 电泳鉴定为单一条带，分子量约
为 20 kD，这一研究结果与 Yamaguchi［1］报道相似。
Yamaguchi 分离纯化最后一步通过 Sephacryl S-100 得
到 26.2 U/mg，本文最后一步离子交换纯化后比活为
8.843 U/mg。
4 结论
通过超滤、无水乙醇沉淀、缓冲液复溶、离子
交换层析等步骤，对发酵液中微生物蛋白质谷氨酰
胺酶进行了初步分离纯化，最终得到纯酶，纯化后
的酶的得率为 31.72%，纯化倍数为 124 倍。
参 考 文 献
［1］ Yamaguchi S, Jeenes DJ, Archer DB. Protein-glutaminase from
Chryseobacterium proteolyticum, an enzyme that deamidates
glutaminyl residues in proteins ：purification, characterization and
gene cloning［J］. Eur J Biochem, 2001, 268 ：1410-1421.
［2］ Yamaguchi S, Masaaki Y. A Novel protein-deamidating enzyme from
116
66.4
45.0
35.0
25.0
18.4
kD M 1 2 3
M ：标准分子量蛋白 ；1 ：粗酶液 ；2 ：超滤液 ； 3 ：沉淀复溶液
图 4 纯化各步 PG 酶 SDS-PAGE
离子交换层析样品到 SDS-PAGE 图谱如图 5。
穿透峰中有多种蛋白质，而在收集峰中 20 kD 位置
明显的有一个条带。交换纯化后比活为 8.843 U/mg。
97.2
66.4
44.3
29.0
20.1
14.3
kD
M 1 2
M ：标准分子量蛋白 ；1 ：离子穿透峰 ；2 ：纯化后的 PG 酶
图 5 离子交换层析组分 SDS-PAGE
3 讨论
脱氨基是一种提高植物蛋白食品功能性的最有
价值的方法之一，脱氨后可以使蛋白质的溶解性、
乳化性、发泡性和凝胶性增加［2］，但化学脱氨基法
会引起蛋白质肽链断裂，导致蛋白质水解而失去功
能特性。酶法脱氨比化学法更为理想，底物专一性
强，反应条件温和，而且安全性高。对蛋白质脱氨
2014年第2期 165关静等 ：微生物蛋白质谷氨酰胺酶的初步分离纯化
Chryseobacterium proteolyticum sp. nov. a newly isolated bacterium
from soil［J］. Appl Envir Microb, 2000, 66（8）：3337-3343.
［3］ Yong YH, Yamaguchi S, Gu YS, et al. Effects of enzymatic
deamidation by protein-glutaminase on structure and functional
properties of α-zein［J］. J Agric Food Chem, 2004, 52 ：7094-
7100.
［4］ Yong YH, Yamaguchi S, Matsumura Y. Effects of enzymatic
deamidation by protein-glutaminase on structure and functional
properties of wheat gluten［J］. J Agric Food Chem, 2006, 54 ：
6034-6040.
［5］ Hamada JS. Deamidation of food proteins to improve functionality
［J］. Crit Rev Food Sci Nutr, 1994, 34 ：283-292.
［6］ 卢玉棋 . 水杨酸盐 2 次氯酸盐分光光度法测定水中氨氮［J］.
环境与健康杂志 , 1999, 16（5）：296-298.
［7］ Motoki M, Seguro K, Nio N, et al. Glutamine-specific deamidation of
aS1-casein by transglutaminase［J］. J Agric Biol Chem, 1986, 50 ：
3025-3030.
［8］ Kato A, Tanaka A, Lee Y, et al. Effects of deamidation with chymot-
rypsin at pH 10 on the functional properties of proteins［J］. J Agric
Food Chem, 1987, 35 ：285-288.
［9］ Kikuchi M, Hayashida H, Nakano E, et al. Peptidoglutaminase.
Enzymes for selective deamidation of γ-amido of peptide-bound
glutamine［J］. Biochemistry, 1971, 10 ：1222-1229.
［10］ Suppavorasatit I, De Mejia EG, Cadwallader KR. Optimization of
the enzymatic deamidation of soy protein by protein-glutaminase
and its effects on the functional properties of the protein［J］. J
Agric Food Chem, 2011, 59 ：11621-11628.
［11］ Matsumura Y, Yamaguchi S, Mori T. Action of protein-glutaminase
on r-Lactalbumin in the native and molten globule States［J］. J
Agric Food Chem, 2001, 49 ：5999-6005.
［12］ Miwa N, Yokoyama K, Wakabayashi H, et al. Effect of deamidation
by protein-glutaminase on physicochemical and functional
properties of skim milk［J］. Int Dairy J, 2010, 20（6）：393-399.

（责任编辑 李楠）