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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2015, 31(5):167-172
亚硝酸盐是氮循环的一部分，也是氨转化为硝
酸盐过程中的中间产物［1］。在水产养殖的过程中，
亚硝酸盐是养殖水体中的主要污染之一，它对养殖
对象有一定的毒害作用。水体中亚硝酸盐超过一定
浓度会导致鱼类缺氧甚至窒息死亡［2，3］。可见，亚
硝酸盐已成为严重影响水质的因素之一。因此，去
除水体中的亚硝酸盐对水质调控具有重要的意义。
生物脱氮是目前水处理领域中关注和研究的热
点［4］。传统方法中，一般是使用硝化细菌进行脱氮，
但是硝化细菌生长缓慢，培养困难，而且价格高［5］，
因此，亟待开发新的、高效的脱氮菌。根瘤菌的发
现并证实其与豆科植物的共生有固氮作用已有上百
年的历史［6］，但其脱氮作用目前鲜有相关报道。关
于应用根瘤菌的脱氮是对传统理论的丰富和突破。
本研究以某污水处理厂的活性污泥为分离源，
通过富集和分离纯化等步骤，分离到一株具有去除
收稿日期 ：2014-09-05
基金项目 ：上海高校知识服务平台上海海洋大学水产动物遗传育种中心项目（ZF1206）
作者简介 ：罗小溪，女，硕士研究生，研究方向 ：水产微生物，微生物制剂研究与应用 ；E-mail ：446039386@qq.com
通讯作者 ：高建忠，男，副教授，研究方向 ：水产动物医学，微生物制剂研究与应用 ；E-mail ：jzhgao@shou.edu.cn
新型脱氮菌 Rhizobium radiobacter 的分离鉴定及其硝化
特征分析
罗小溪 高建忠 陈再忠 于永亮
（上海海洋大学水产与生命学院，上海 201306）
摘 要 ： 旨在从污水处理厂中分离和鉴定具有硝化能力的脱氮菌。采用富集培养、平板划线分离菌株，命名为 N312，并通
过形态观察、16S rDNA 基因序列分析及 Biolog 鉴定，利用正交试验法对该菌株的培养基配方进行优化。结果表明，分离获得具有
硝化能力的自养脱氮菌，初步鉴定属于放射型根瘤菌（Rhizobium radiobacter），为革兰氏阴性杆菌，菌落圆形，乳白色，6 d 内亚硝
酸盐去除率达到 100%，通过正交试验初步得到最佳培养基配方为 NaNO2 1.5 g，Na2CO3 1.5 g，MgSO4·7H2O 0.25 g，FeSO4·7H2O 0.2
g，KH2PO4 0.5 g。菌株 N312 是一株具有研究价值的自养脱氮菌。
关键词 ： 脱氮菌 ；16S rDNA ；Biolog ；正交试验 ；硝化速率
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.05.026
Isolation and Identification of Novel Denitrifier Strain Rhizobium
radiobacter and Its Nitrifying Characterisation
Luo Xiaoxi Gao Jianzhong Chen Zaizhong Yu Yongliang
（College of Fisheries and Life Science，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306）
Abstract: In order to screen and identify new strain with nitrification, a denitrifier was isolated from sewage treatment plant. The strain
named N312 isolated by enrichment and plate culture was identified based on its morphology characteristics, 16S rDNA gene sequence analysis
and Biolog. The conditions of medium composition were optimized by orthogonal experiment. The autotrophic denitrifier strain N312 was isolated
and identified as Rhizobium radiobacter, which was rod, Gram-negative, colony round and white. The results indicated that the nitrite removal
efficiency by the strain could reach 100% after 6 days. The best medium was NaNO2 1.5 g, Na2CO3 1.5 g, Mg2SO4·7H2O 0.25 g, FeSO4·7H2O 0.2
g，KH2PO4 0.5 g. Strain N312 is a new autotrophic denitrifier with a highly research value.
Key words: denitrifier ；16S rDNA ；Biolog ；orthogonal experiment ；nitrification rate
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.5168
亚硝态氮能力的细菌，命名为菌株 N312。根据其形
态、16S rDNA 基因序列和 Biolog 鉴定系统，探讨该
菌株的分类学地位，旨在为水族箱和养殖水体亚硝
态氮处理的实际应用提供有效菌源。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试验材料 供试水样采自 2014 年 4 月上海市
某污水处理厂的污水。试验于上海海洋大学观赏水
族实验室进行，菌株 N312 从污水中筛选分离得到。
1.1.2 试验试剂 UNIQ-10 柱式细菌基因组 DNA 抽
提试剂盒、PCR Master Mix（2×）、PCR 引物、胶回
收试剂盒购于生工生物工程（上海）股份有限公司，
其他试剂（分析纯）购于国药集团化学试剂有限公司。
1.1.3 富集培养基［7］ NaNO2 1.0 g，Na2CO3 1.0 g，
MgSO4·7H2O 0. 5 g，FeSO4·7H2O 0.4 g，蒸馏水 1 L
定容，KH2PO4 0.5 g 单独灭菌。
1.1.4 分 离 培 养 基 NaNO2 0.5 g，Na2CO3 0.5 g，
MgSO4·7H2O 0.015 g，MnSO4·H2O 0.005 g，K2HPO4 0.5
g，NaH2PO4 0.5 g，蒸馏水 1 L 定容，固体培养基加
琼脂粉 2%。
1.1.5 自 配 废 水 组 成 NaNO2 1.0 g，Na2CO3 1.0 g，
MgSO4·7H2O 0.5 g，FeSO4·7H2O 0.4 g，蒸馏水 1 L
定容，KH2PO4 0.5 g 单独灭菌。
1.2 方法
1.2.1 菌株的富集 取 10 mL 污泥样品加到经灭菌
（1×105 Pa、30 min）处理分装有 100 mL 上述富集
培养基的 250 mL 锥形瓶中，28℃、150 r/min 摇床
中振荡培养，富集培养 5 d，设计对照组，做 2 个平
行。每隔 24 h 定期检测 NH4
+-N 和 NO2
--N 含量。当
检测亚硝酸氮含量接近 0 时，添加 20 mL 富集培养基。
每处理重复 3 次。
1.2.2 菌株的分离纯化 取 NO2
--N 减少快的富集培
养液，采用平板划线进行分离培养，28℃恒温、黑
暗培养，观察有乳白色菌落后，挑取单菌落至分离
平板，重复划线分离 3 次，得到纯培养。将此单菌
接种到上述富集培养基中，28℃、150 r/min 摇床中
振荡培养，每隔 24 h 检测培养基上清液的 NH4
+-N
和 NO2
--N。
1.2.3 水质检测方法［8］ NO2
--N 的测定采用 N-（1-
萘基）- 乙二胺分光光度法，NH4
+-N 的测定采用纳
氏试剂分光光度法。
1.2.4 16S rDNA 的 PCR 扩增、克隆与测序 参考黄
毅［9］的方法，采用 UNIQ-10 柱式细菌基因组 DNA
抽提试剂盒提取细菌总 DNA。通用引物，正向引物
27F 为 5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3， 反 向 引
物 1492R 为 5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3。
PCR 反应体系（50 μL）：PCR Master Mix（2×）
25 μL，引物 27F（0.2 μmol/L）1 μL，引物 1492R（0.2
μmol/L）1 μL，模板 DNA 1 μL，ddH2O 22 μL。
PCR 反应条件 ：94℃预变性 5 min ；94℃变性
30 s，55℃退火 30 s，72℃延伸 90 s，循环 30 次 ；
72 ℃ 终 延 伸 10 min。PCR 扩 增 产 物 经 1.5% 琼 脂
糖凝胶电泳检测后，采用胶回收试剂盒（San Prep
Column DNA Gel Extraction Kit，Sangon Biotech）进行
回收。纯化后的目的片段连接到 pMD18-T 载体，转
化到大肠杆菌 TOP10 菌株中。经过蓝白斑筛选，培
养菌液，利用 M13 通用引物进行 PCR 扩增检测，取
阳性克隆送生工生物工程（上海）股份有限公司。
1.2.5 系统发育分析 测序结果在 GenBank 核酸数
据库中进行检索［10］，选取同源性最高的序列并通
过 MEGA5.0 软件进行比对和系统发育分析，构建进
化树。
1.2.6 Biolog 鉴定 挑取单个纯化菌种接种到 Biolog
专用接种液 IF-A 中，制成一定细胞浓度的菌悬液，
用 Turbidimeter 进行校准，使细胞浓度在 92%-96%
范围内，然后用移液枪将菌悬液按每孔 100 μL 转接
GenIII 微孔板的 96 个孔内，做好标记然后放到 33℃
恒温生化培养箱培养 4-6 h 和 16-24 h 时在读数仪上
读取菌株的代谢指纹特征，在 Biolog 数据库中进行
相似性比对，查找最接近的结果。
1.2.7 培养基正交优化试验 为了研究菌株 N312
营养因子需要的影响，设计 L9（3
3）培养基正交试
验，3 个关键因素分别为氮源、碳源和无机盐。其中，
氮源（NaNO2）取 0.5、1.0 和 1.5 g，碳源（Na2CO3）
取 0.5、1.0 和 1.5 g，无机盐（MgSO4·7H2O）取 0.25、
0.5 和 0.75 g。以硝化速率为依据，检验培养菌株
N312 的最佳培养基。
2015,31(5) 169罗小溪等：新型脱氮菌 Rhizobium radiobacter 的分离鉴定及其硝化特征分析
2 结果
2.1 形态观察结果
由图 1 可知，菌株 N312 在分离培养基上的菌
落为乳白色，表面光滑，不透明，边缘整齐。革兰
氏染色得到菌株 N312 形态（图 2），为革兰氏阴性，
油镜下观察为短杆状，单个排列。
中进行检索，菌株 N312 与 Rhizobium sp. 同源性最
高，GenBank 数据库登录号为 KM047639。从中选取
同源性最高的 4 株菌株的 16S rDNA 基因序列进行比
对并构建系统发育树。结果（图 5）显示，N312 与
Rhizobium radiobacter GCIZ（AM157353）在同一分支
上，一致性达到 100%。
图 1 菌株 N312 筛选验证图
图 2 细菌的革兰氏染色结果（1 000×）
2.2 硝化速率结果
在自配废水中培养 6 d 后，菌株 N312 对水体中
的 NO2
--N 有显著的去除效果，如图 3 所示，NO2
--N
浓度不断减少，尤其在第 6 天基本能将初始浓度为
0.458 g/L 的 NO2
--N 彻底去除，去除率达到 100%，
同时不累积氨氮。表 1 显示，培养第 1 天硝化速率
最低，由于该菌生长速度缓慢，还未达到脱氮的最
佳效果。第 6 天硝化速率达到 0.076 g/（L·d）。
2.3 菌株PCR扩增、克隆与测序结果
克隆后，利用 M13 通用引物进行 PCR 扩增，
经琼脂糖凝胶电泳检测，约在 1 800 bp 处有一明亮
的条带（图 4）。测序结果经在 GenBank 核酸数据库
表 1 自配废水中菌株 N312 的硝化作用结果
时间 /d
NO2
--N 浓度 /
（g·L-1）
硝化速率 /
［g·（L·d）-1］
NO2
--N
去除率 /%
0 0.458 - 0.000
1 0.442 0.016 3.493
2 0.419 0.020 8.515
3 0.407 0.017 11.135
4 0.303 0.039 33.843
5 0.093 0.073 79.694
6 0.000 0.076 100.000
0
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
0.35
0.40
0.45
0.50
0 1 2 3 4 5 6 7
N
O
2-
-N
⎃ᓖ g·L-1 ᰦ䰤/d
图 3 菌株 N312 的 NO2
--N 降解曲线
2000
bpbp
1 2 M
1000
750
500
250
100
1797
1 ：菌株 N312 的 16S rDNA 条带 ；2 ：稀释 10 倍的菌株 N312 的
16S rDNA 条带 ；M ：DNA Marker
图 4 菌株 N312 的 16S rDNA 基因电泳图
2.4 Biolog全自动微生物鉴系统结果
Biolog GenIII 微孔板可以对微生物进行 94 种表
型测试，其中包括 ：71 种碳源利用测试（图 6-图7，
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.5170
1-9 列 ） 以 及 23 种 化 学 敏 感 性 测 试（ 图 6-图7，
10-12 列）。微生物在测试板上所显示出的“表型
指纹”被用来在种的水平上鉴定该微生物，结果显
示 3 个重要参数 ：可能性（PROB）、相似性（SIM）
和位距（DIST）。培养 4-6 h，ID 框中显示“No ID
Yet”，表示结果不能匹配得很好。如图 6 所示，培
养 6 h，该菌株只与 F11 孔中的四唑紫发生阳性反应。
培养 16-24 h 后，鉴定结果显示为绿色状态栏（Spe-
cies ID），可知，菌株 N312 得到匹配好的结果（图
7）。鉴定结果表明，菌株 N312 最具可能性为 Rhizo-
bium radiobacter，PROB 值为≥ 0.5、SIM 值为 0.535
和 DIST 值为 6.922，是较为可信的鉴定结果。
2.5 培养基配方优化结果
通过 L9（3
3）培养基正交试验，结果（表 2）
表明，不同的培养基对菌株 N312 的硝化速率有显
著影响。表现最强的是 7 号培养基，硝化速率达到
197.142 mg/L，硝化速率最弱的是 2 号培养基，仅
有 26.094 mg/L。由极差 R 值的大小可以判断，影响
菌株 N312 硝化速率的 3 种因素的强弱顺序 ：NaNO2
>MgSO4·7H2O >Na2CO3。由下表 2 可得知，培养基
配方组合最佳培养基为 NaNO2 1.5 g，Na2CO3 1.5 g，
MgSO4·7H2O 0.25 g。
表 2 培养基配方正交优化结果
处理号
因素 硝化速率 /
［mg·（L·d）-1］NaNO2/g Na2CO3/g MgSO4·7H2O/g
1 0.5 0.5 0.25 37.505
2 0.5 1.0 0.5 26.094
3 0.5 1.5 0.75 36.063
4 1.0 0.5 0.5 87.993
5 1.0 1.0 0.75 85.108
6 1.0 1.5 0.25 129.825
7 1.5 0.5 0.75 197.142
8 1.5 1.0 0.25 186.563
9 1.5 1.5 0.5 181.755
Mean 1 33.221 107.547 117.964
Mean 2 100.975 99.255 98.614
Mean 3 188.487 115.881 106.104
Range 155.266 16.626 19.350
3 讨论
目前，集约化、高密度和高产出的水产养殖
模式的转变，带来一系列严重的问题 ：大量水产动
物粪便、残饵、分泌物的累积，造成水体中含氮污
染物的累积，导致水产动物的病害甚至死亡，提
高了养殖成本，减少了收益［12，13］。亚硝酸盐是养
殖水体中的主要污染之一，传统的生物脱氮是在好
氧条件下，采用硝化细菌将亚硝态氮氧化为硝态
氮［14，15］。已有报道利用硝化细菌［16］、地衣芽孢杆
菌［17］、不动杆菌［18］、Pseudomona sputida［19］、假单
胞菌［20］、反硝化细菌［21］等细菌进行生物脱氮，尽
管这些细菌能够脱氮，但是在其产物和脱氮能力上
N312 KM047639
Rhizobium radiobacter GCIZ AM157353
Rhizobium pusense BN-23 AB969785
Agrobacterium sp. 2329 X174206
Rhizobium sp. K1-6 KJ631290 10098
0.05
79
图 5 菌株 N312 基于 16S rDNA 基因系统发育树
图 6 菌株 N312 的 Biolog 代谢指纹特征图
图 7 菌株 N312 的 Biolog 代谢指纹特征图
2015,31(5) 171罗小溪等：新型脱氮菌 Rhizobium radiobacter 的分离鉴定及其硝化特征分析
存在差异。从已有研究来看，大部分脱氮细菌是异
养细菌和去除氨氮作用，自养的硝化细菌却存在生
长缓慢，培养困难，价格高等缺陷。本研究报道的
Rhizobium radiobacter 菌株 N312 为首次报道的具有
自养硝化作用的新型脱氮菌，并且在好氧条件下具
有较强的亚硝酸盐脱除能力，为水族箱和养殖水体
亚硝态氮处理的实际应用提供有效菌源。
本试验以 NaNO2 为唯一氮源，以 Na2CO3 为唯
一碳源，培养 2 d，NO2
--N 浓度不断减少，这与魏
巍等［22］发现的好氧反硝化细菌 Rhizobium sp. 生长
规律相一致，培养过程未出现氨氮及硝态氮的累
积，表明菌株 N312 具有硝化能力。利用细菌 16S
rDNA 基因序列的保守性，进行 PCR 扩增并 TA 克
隆，通过 16S rDNA 序列分析只能鉴定到属的水平，
而 Biolog 全自动微生物鉴定系统却能鉴定到种水平，
并具有准确、快捷、简便等优点［23］，进一步保证
了鉴定结果的可信度。N312 在培养 4-6 h 和 16-24
h 的读数不一致，是由于菌株的生长状况不同造成
的［24］，该菌株在接种后期利用微孔中单一碳源代谢
表现活性较强。总体来看，16S rDNA 基因序列分析
与 Biolog 鉴定结果一致。
本研究报道的 Rhizobium radiobacter 菌株 N312
的自养型硝化微生物，在 6 d 内亚硝酸盐去除率达到
100%。魏巍等［22］却认为根瘤菌 Rhizobium sp. 具有
异养硝化作用，氨氮去除率达到 58.17%，同时还能
实现同步硝化反硝化。刘钰莹等［25］通过贝洛氏法
对氨氮进行测定，发现中华根瘤菌 NP1（Sinorhizobium
sp. NP1）具有去除氨氮能力。本文研究的菌株 N312
具有自养硝化作用，能去除亚硝酸盐。首次通过培
养基配方的优化得到菌株 N312 最佳培养基 ：NaNO2
1.5 g，Na2CO3 1.5 g，Mg2SO4·7H2O 0.25 g，为未来
对该菌种制剂的研制提供理论依据。
因此，本研究筛选得到的放射型根瘤菌是自养
脱氮菌，具有去除亚硝酸盐功能，该功能在国内外
未见报道，为新生物制剂的研发提供新的菌源。下
一步将对其作用机理进行深入研究，为水族箱和养
殖水体中亚硝态氮处理的实际应用提供理论依据，
为水体营养化，污水处理施用的可行性研究提供理
论及试验支持。
4 结论
本研究从污水处理厂的活性污泥中分离筛选出
一株具有硝化能力的脱氮菌，通过富集培养、平板
划线分离菌株，命名为 N312，并进行形态观察，经
16S rDNA 基因序列分析和 Biolog 鉴定得到该菌株
属 于 放 射 型 根 瘤 菌（Rhizobium radiobacter）， 为 革
兰氏阴性杆菌，菌落圆形，乳白色。菌株 N312 在
自配废水条件下，6 d 亚硝酸盐去除率达到 100%。
利用正交试验法对该菌株的培养基配方进行优化
得到最佳培养基配方为 NaNO2 1.5 g，Na2CO3 1.5 g，
MgSO4·7H2O 0.25 g，FeSO4·7H2O 0.2 g，KH2PO4 0.5
g。研究表明菌株 N312 在水质处理中具有良好的应
用前景，是一株具有研究价值的自养脱氮菌。
参 考 文 献
［1］ 陈薇 , 刘清术 , 许丽娟 , 等 . 两株以亚硝态氮为氮源的异养硝
化细菌的分离及鉴定［J］. 生命科学研究 , 2012, 16（6）：489-
495.
［2］Soucek DJ, Dickinson A. Acute toxicity of nitrate and nitrite to
sensitive freshwater insects, mollusks, and a crustacean［J］.
Archives of Environmental Contamination and Toxicology, 2012, 62
（2）：233-242.
［3］ Frances J, Allan GL, Nowak BF. The effects of nitrite on the
short-term growth of silver perch（Bidyanus bidyanus）［J］.
Aquaculture, 1998, 163（1）：63-72.
［4］ 余润兰 , 苗雷 . 异养硝化细菌 Alcaligenes sp. S3 除氮特性及动
力学［J］. 环境工程学报 , 2012, 6（3）：869-872.
［5］ 罗小溪 , 高建忠 , 陈再忠 . 硝化细菌富集培养及应用研究进
展［J］. 水产科技情报 , 2013, 40（6）：320-323.
［6］ 韩华君 , 张磊 , 张琴 , 等 . 土壤中根瘤菌定殖研究进展［J］. 土
壤 , 2008, 40（2）：174-180.
［7］ 陈绍铭 , 郑福寿 . 水生微生物学实验法［M］. 北京 ：海洋出版
社 , 1990.
［8］ 国家环境保护总局 . 水和废水监测分析方法［M］. 第 4 版 . 北
京 ：中国环境科学出版社 , 2002 ：258-282.
［9］ 黄毅 . 硝化细菌对淡水水族箱水质和异养细菌类群变化的影
响［D］. 上海 ：上海海洋大学 , 2013.
［10］ Altschul SF, Madden TL, Schäffer AA, et al. Gapped BLAST
and PSI-BLAST ：a new generation of protein database search
programs［J］. Nucleic Acids Research, 1997, 25（17）：3389-
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.5172
3402.
［11］ Shishehchian F, Yusoff F, Shariff M. The effects of commercial
bacterial products on macrobenthos community in shrimp culture
ponds［J］. Aquaculture International, 2001, 9（5）：429-436.
［12］ 雷霁霖 . 中国海水养殖大产业架构的战略思考［J］. 中国水
产科学 , 2010, 17（3）：600-609.
［13］ Bitra A, Hussain B, Tanwar AS, et al. Identification of function and
mechanistic insights of guanine deaminase from Nitrosomonas eur-
opaea ：role of the C-terminal loop in catalysis［J］. Biochemistry,
2013, 52（20）：3512-3522.
［14］ Sayavedra-Soto L, Hommes N, Alzerreca J, et al. Transcription of
the amoC, amoA and amoB genes in Nitrosomonas europaea and
Nitrosospira sp. NpAV［J］. FEMS Microbiology Letters, 1998,
167（1）：81-88.
［15］ 南晓梅 , 宋新山 , 赵晓祥 . 硝化细菌包埋固定化条件的研
究［J］. 应用化工 , 2014, 43（2）：200-202.
［16］ 曾庆武 , 梁运祥 , 葛向阳 . 反硝化细菌的分离筛选及其反硝
化特性的初步研究［J］. 华中农业大学学报 , 2008, 27（5）：
616-620.
［17］ 王景峰 , 金敏 , 谌志强 , 等 . 1 株好氧脱氮菌的筛选与脱氮特
性研究［J］. 环境科学 , 2011, 32（8）：2409-2413.
［18］ Kim M, Jeong SY, Yoon SJ, et al. Aerobic denitrification of
Pseudomonas putida AD-21 at different C/N ratios［J］. Journal of
Bioscience and Bioengineering, 2008, 106（5）：498-502.
［19］ 韩丽华 , 张绍璐 . 好氧脱氮菌群的筛选驯化及 PCR-DGGE 分
析［J］. 东北林业大学学报 , 2011, 39（8）：90-93.
［20］ 邢国伟 , 李彦芹 , 李凤超 , 等 . 一株反硝化细菌与光合细菌对
养殖海水的净化效果［J］. 生物技术通报 , 2014（3）：151-
154.
［21］ 魏巍 , 黄廷林 , 苏俊峰 , 等 . 1 株贫营养好氧反硝化菌的分离
鉴定及其脱氮特性［J］. 生态环境学报 , 2010, 19（9）：2166-
2171.
［22］ 杜昕波 , 赵耘 , 李伟杰 , 等 . 利用 BIOLOG 系统对不同种类细
菌鉴定的研究［J］. 中国兽药杂志 , 2008, 42（9）：31-33.
［23］ 张朝正 , 郭兰珍 . 利用 16S rDNA 序列分析和 Biolog 快速鉴定
方法鉴定产脂肪酶菌株［J］. 河北工业大学学报 , 2009, 38（5）：
52-55.
［24］ 刘钰莹 , 邱枫 , 宋琴 , 等 . 中华根瘤菌 NP1 氨单加氧酶基因的
克隆与功能鉴定［J］. 中国生物化学与分子生物学报 , 2010,
26（8）：768-775.
（责任编辑 马鑫）