全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第4期
近年来，由于细菌多糖具有安全、无毒等理
化性质，使其在多个领域倍受青睐，尤其是在食
品、医药领域所具有的巨大应用价值引起人们的
广 泛 关 注［1］。 目 前， 许 多 细 菌 胞 外 多 糖 已 在 这
些领域作为胶凝剂、成膜剂、保鲜剂得到广泛应
用。目前研究的产胞外多糖细菌主要有醋酸杆菌
（Acetobacter）、 假 单 胞 菌（Pseudomonas）、 鞘 氨 醇
单 胞 菌（Sphingomonas）、 根 瘤 菌（Rhizobium）、 黏
细菌（Myxobacterium）、芽孢杆菌（Bacillus）、链球
菌（Streptococcus）、乳球菌（Lactococcus）和乳杆菌
收稿日期 ： 2013-10-09
基金项目 ： 国家自然科学基金项目（31270983，31070824），教育部留学回国人员科研启动基金资助项目第 45 批，山东省自然科学基金
（2009ZRB019SQ）
作者简介 ：黄怡诚，男，研究方向 ：糖生物学， E-mail ：61828624@qq.com ；刘旸同为本文第一作者
通讯作者 ：陈敏，博士，副教授，研究方向 ：糖生物学 ；E-mail ：chenmin@sdu.edu.cn
产胞外多糖植物内生菌的分离和鉴定
黄怡诚  刘旸  庞昕  马中瑞  韩东雷  陈敏 
（山东大学生命科学院 微生物技术国家重点实验室，济南 250100）
摘 要 ： 利用平板涂布法从胡萝卜、芦荟、土豆、地瓜和紫薯样品中分离得到 24 株细菌，利用苯酚硫酸法测定菌株胞外多
糖的产量，最终得到 3 株高产胞外多糖的细菌菌株 25-Z-1、25-Z-3 和 12-L-6。经 16S rDNA 序列测定及系统发育分析，从紫薯样品
中分离得到的 25-Z-1 与 Bacillus pumilus strain ST277 处于同一分支，相似性达到 100% ；25-Z-3 与 Bacillus cereus strain Se05 处于同
一分支，相似性达到 99% ；从芦荟中分离得到的 12-L-6 与 Bacillus sp. GZT 处于同一分支，相似性为 99%。在 LB 液体培养基中，
发酵温度 30℃，摇床转数 170 r /min 条件下，发酵 7 d 后胞外多糖产量可分别达 30.3 mg/L、29.1 mg/L 及 28.2 mg/L。
关键词 ： 植物内生菌 胞外多糖 16S rDNA
Isolation and Characterization of Endophytic Strains Producing
Exopolysaccharide
Huang Yicheng Liu Yang Pang Xin Ma Zhongrui Han Donglei Chen Min
（The State Key Laboratory of Microbial Technology，School of Life Sciences，Shandong University，Jinan 250100）
Abstract:  In this study, 24 strains were isolated from carrot, aloe, potato, sweet potato and purple potato. As screening by phenol-sulfuric
acid assay, three strains, 25-Z-1, 25-Z-3 and 12-L-6, were proved to be as high exopolysaccharide producing strains. The results of 16S rDNA
sequence determination showed that 25-Z-1 and 25-Z-3 isolated from purple potato was about 100% identity compared with Bacillus pumilus
strain ST277 and 99% identity compared with Bacillus cereus strain Se05, respectively. Meanwhile the 12-L-6 isolated from aloe identified as
Bacillus sp. GZT, with the similarity is of 99%. Culture in LB medium, 30℃ and 170 r/min for 7 d, yield of EPS could reach to 30.3 mg/L, 29.1
mg/L and 28.2 mg/L, respectively.
Key words:  Endophyte Exopolysaccharide 16S rDNA
（Lactobacillus）等［2，3］。但对植物内生菌胞外多糖
的研究甚少。
植物内生菌（Endophyte）是一种新的微生物资
源，具有潜在的应用价值。近年来，从植物内生菌
中寻找新的生物活性物质的研究成为热点［4］。植物
内生菌产生的生物活性物质往往是无毒无害的，具
备在食品和医药领域大规模生产的条件。因此，从
植物内生菌中开发产糖性状优良的菌株，将有助于
细菌多糖的相关研究，为工业化生产及多领域的应
用奠定理论基础。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第4期148
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 样品采集 供筛选分离产胞外多糖菌株的样
品包括胡萝卜、芦荟、土豆、地瓜和紫薯从市场购
买所得，带回实验室后，立即进行表面冲洗，消毒
等处理及内生菌分离。
1.1.2 主要试剂和仪器 PCR 所用引物由上海生物
工程技术公司合成 ；Buffer、dNTP、Taq 酶及其它
常规试剂均购自北京全式金生物技术有限公司 ；氯
化钠、磷酸二氢钾、无水硫酸镁、蔗糖、硝酸钠、
无水乙醇等药品均为国产分析纯。蛋白胨、酵母浸
粉和琼脂购自北京奥博星生物技术有限责任公司。
PTC2200 PCR 扩增仪，YLN-III 暗箱式紫外分析仪（北
京市亚力恩机电技术研究所），Model 680 酶标仪（伯
乐公司），小型高速冷冻离心机（德国 Eppendorf）。
1.1.3 培养基 初筛培养基（g/L）：蔗糖 15，蛋白
胨 3，酵母膏 2，NaNO3 0.5，MgSO4 0.5，K2HPO4 0.5，
NaCl 10，琼脂 15，pH7.0-7.2。
以上培养基均在 100 kPa 高压灭菌 20 min。
1.2 方法
1.2.1 菌种的分离与筛选 初筛 ：清水洗净植物样
品，75% 乙醇 1 min，1% 次氯酸钠 5 min，无菌水
漂洗 3-5 次。最后一次的漂洗水用于涂布平板。（验
证是否外周菌清洗干净）用剪刀或刀片将植物减碎，
或剥去表皮，将无表皮除贴于平板。或者将植物小
块直接放入 LB 培养基中，28℃培养 24-36 h 后，稀
释菌液，涂布平板［5，6］。复筛 ：将初筛选出的菌种，
进行复筛试验。运用酶标仪测量使它们的 OD 处于
相同数值，在初筛培养基上使用点种法，培养 2 d，
观察产糖圈大小［7］。
将初筛得到的产糖圈大的菌种接入含有 5 mL
LB 培养基的试管中，在 28℃，160 r/min 的摇床中
振荡培养 48 h，得到的发酵液 4 500 r/min 离心 15
min，取上清液加入 1 mL，加入 4 mL 无水乙醇沉淀
多糖，产生絮状沉淀，3 000 r/min 离心 10 min，用 2
mL 蒸馏水复溶多糖后［8］，使用苯酚-硫酸法测定总
糖量［9］。
1.2.2 苯酚硫酸法测定 标准曲线的制作 ：准确称
量 100 mg 葡萄糖于 100 mL 容量瓶中，加水至刻度，
分 别 吸 取 16、24、32、40、48、56、64 和 72 μL，
各以蒸馏水补足至 80 μL，然后加入 6% 苯酚 40 μL
及浓硫酸 200 μL，混匀冷却，室温放置 20 min 后于
490 nm 测光密度，横坐标为多糖微克数，纵坐标为
光密度值。
1.2.3 菌种鉴定
1.2.3.1 形态特征 将获得的目标菌株在 LB 固体培
养基上，30℃培养 24 h，同时观察记录菌落形态。
然后进行革兰氏染色，显微镜观察。取部分菌体送
山东师范大学生命科学学院电镜室进行扫描电镜观
察。同时，将 25-Z-1 菌株接种至半固体培养基，穿
刺培养，观察其运动情况以判断该菌是否着生鞭毛。
1.2.3.2 生理生化试验 分别从细菌的运动性、耐
盐性、酶反应、水解试验、碳源利用情况等几个方
面对 25-Z-1 菌株进行研究。NaCl 浓度为 7%，平行
3 组，无菌操作接种至细菌培养微孔板中，毎孔 200
μL。 使 用 Bioscreen 仪，37℃，200 r/min 培 养 4 d，
每间隔 30 min 对每孔菌液进行 600 nm 下的光密度
测量。数据同时传输到电脑上，自动绘制生长曲线，
以测定菌株的耐盐性。其他试验参考文献《常用细
菌系统鉴定手册》［10］和《伯杰氏手册》［11］，用细菌
生理生化微量鉴定管进行（广东环凯微生物科技有
限公司）。
1.2.3.3 16S rDNA 测序 使用 DNA 提取试剂盒进行
DNA 的提取。以提取的细菌总 DNA 为模板。16S rD-
NA 基因的 PCR 扩增引物采用细菌通用引物 ：F（5-
AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3），R（5-GGTTACC-
TTGTTACGACTT-3）［11］。扩增程序为：94℃预变性 5
min；55℃退火 1 min，74℃延伸 1.5 min，30 个循环；
74℃延伸 5 min，4℃保存［12］。PCR 产物用 DNA 纯
化试剂盒纯化后测序，将得到的 16S rDNA 序列在
NCBI 数据库上 BLAST 进行比对。采用 MEGA（vers-
ion 411）构建系统发育树，Neighbor-Joining 法对进
化树进行评估，进行亲缘关系和系统发育分析［13］。
2 结果
2.1 胞外多糖高产酵母菌株的分离筛选
从 5 种植物样品中共分离得到 24 株菌株，经初
筛、复筛得到胞外多糖高产菌株 3 株。部分结果（表
1）显示，经 7 d 的发酵后，菌株 25-Z-1、25-Z-3 和
2014年第4期 149黄怡诚等 ：产胞外多糖植物内生菌的分离和鉴定
12-L-6，胞外多糖产量较高，将这 3 株菌株作为复
筛入选菌株进行菌落的形态观察和菌种鉴定试验。
表 1 胞外多糖高产菌株的筛选结果
菌株 EPS（mg/L）
13-Z-2 11.9
13-Z-1 21.0
22-D-2 18.2
16-T-2 11.1
12-L-6 28.2
12-L-1 12.0
14-H-3 14.1
15-H-2 3.4
11-H-2 10.4
25-Z-3 29.1
25-Z-2 24.6
25-Z-1 30.3
2.2 菌落形态特征
经过筛选后，菌株 25-Z-3、25-Z-1 和 12-L-6 为
高产胞外多糖的入选菌株，在显微镜下观察，3 株
菌株均为直杆状。25-Z-1 菌体呈短杆状，染色均匀、
革兰氏染色阳性，不具运动性。将菌株在 LB 平板
上涂布培养分离 16 h 后，25-Z-3 和 25-Z-1 菌落直径
为 5.5-6.0 mm，12-L-6 菌落直径为 6.2-6.7 mm，菌
落形状均是圆形，表面光滑湿润，颜色呈白色。
海藻糖、D-果糖；不分解乳糖、甘露醇、D-纤维二糖、
N-乙酰葡糖胺、鼠李糖、D-棉子糖、阿拉伯糖、核糖、
山梨醇。不分解尿素，七叶苷（表 2，表 3）。
表 2 25-Z-1 菌株生理生化分析
生理生化特性 结果
运动能力 -
在 7%NaCl 条件下生长 +
氧化酶 -
V-P 试验 -
甲基红试验 -
L - 赖氨酸脱羧酶 -
鸟氨酸脱羧酶 -
β-半乳糖苷酶 +
L-精氨酸双水解酶 +
从 D-木糖产酸 -
从 N-乙酰 -D-葡糖胺产酸 +
水解尿素 -
水解七叶苷 -
＋ ：阳性 ；- ：阴性
2.5 菌株16S rDNA序列测定及系统发育分析
将提取的基因组 DNA 进行 PCR 扩增，并且纯化。
经 PCR 扩增，3 个菌株扩增出预期的 1 500 bp 左右
的 16S rDNA 片段。序列与 GenBank 数据库中收录
的 细 菌 的 16S rDNA 进 行 BLAST 分 析， 经 ClustalX
多序列联配，利用 MEGA 软件对菌株 25-Z-3、25-
Z-1、12-L-6 和模式菌株进行系统发育树的构建。结
果（图 3）表明，从紫薯样品中分离得到的 25-Z-1
与 Bacillus pumilus strain ST277 处 于 同 一 分 支，25-
Z-3 与 Bacillus cereus strain Se05 处于同一分支，相似
性达到 99% ；从芦荟中分离得到的 12-L-6 与 Bacillus
sp. GZT 处于同一分支，相似性为 99%。
图 1　菌株 25-Z-3、25-Z-1 和 12-L-6 在平板上的形态
25-Z-1
25-Z-3
12-L-6
2.3 菌株25-Z-1的形态特征
菌株 25-Z-1 在扫描电镜下观察的形态特征（图
2），菌体呈细短杆状，两端钝圆。
2.4 菌株生理生化分析
菌株 7% NaCl 条件下生长 ；不具有运动能力，
氧化酶、V-P 试验、甲基红试验、L- 赖氨酸脱羧酶、
鸟氨酸脱羧酶试验均为阴性，具有 β-半乳糖苷酶、L-
精氨酸双水解酶活性，不从 D-木糖产酸，但是从 N-
乙酰 -D-葡糖胺产酸。分解葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、
图 2 扫描电镜下菌株 25-Z-1 的形态特征（10 000×）
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第4期150
3 讨论
植物内生菌是多样性十分丰富的微生物类群，
分布于没有外在感染症状的健康植物组织内，并与
宿主植物协同进化，其存在和作用长期以来一直为
人们所忽视。近年来，植物内生真菌研究引起人们
的注意。目前尽管人们在植物内生菌的种类、代谢
产物、与宿主之间的相互关系等方面取得一些成果，
但研究还很不深入，特别是对内生菌的利用还不多。
紫薯（Ipomoea batataspoir），原名川山紫，属旋
花科一年生草本植物。紫薯含有一种多糖和蛋白质
混合物，称为黏蛋白，属胶原和黏多糖类物质，这
种物质可减轻疲劳，提高人体免疫力［15］，目前有关
紫薯内生菌的研究尚未见公开报道 . 对紫薯内生菌
进行了分离鉴定，研究其生物多样性、生物学特征，
阐明其与宿主植物的相互关系以及探索其实际应用
的可能性等，可以为更好地利用紫薯这一植物资源
提供科学依据。
在植物内生菌中，目前芽孢杆菌的许多种被列
为益生菌而常常用于发酵制备各种酶或其他代谢产
物。近些年来芽孢杆菌被用于生物农药，生物肥料，
果聚糖的生产等多个领域［16］。本研究中筛选得到
的芽孢杆菌从 16S rDNA 上看属于不同的芽孢杆菌，
25-Z-3 和 Bacillus cereus strain Se05 比较相近，Bacil-
lus cereus strain Se05 是一株植物内生菌，与 Bacillus
cereus ATCC 14579T（AE016877）同源性为 99.79%，
对植物病原菌具有拮抗作用［17］。12-L-6 所属的 Bac-
illus sp. GZT，具有降解 2，4，6-tribromophenol 的功
能［18］。产糖量最高的 25-Z-1 从 16S rDNA 看接近于
Bacillus pumilus，但在生理状态上仍然有所不同，因
此有待于进一步的鉴定。本菌株产胞外多糖的能力
较强，这一高产特性显示了在生产实际中有很好的
应用潜力，值得作进一步研究。另外，植物来源的
内生芽孢杆菌产生的胞外多糖有何特性，其分子结
构组成如何等，也有待进一步研究。
4 结论
利用平板涂布法从胡萝卜、芦荟、土豆、地
瓜和紫薯样品中分离得到 24 株细菌，利用苯酚硫
酸法测定菌株胞外多糖的产量，最终得到 3 株高产
表 3 25-Z-1 菌株碳源利用分析
碳源利用 结果
阿拉伯糖 -
核糖 -
D-山梨糖醇 -
鼠李糖 -
海藻糖 +
D-棉子糖 -
D-果糖 +
D-纤维二糖 -
N-乙酰葡糖胺 -
D-甘露糖 -
蔗糖 +
α-D-葡萄糖 +
乳糖 -
D-麦芽糖 +
＋ ：阳性 ；- ：阴性
gi|304441444| Bacillus sp. KMSII-3
gi|374086168| Bacillus subtilis strain CCTCC M2011162
gi|326786951 Bacterium 4D714
gi|475655750 Bacillus cereus strain SS263-34
gi|529485067 Bacterium A26(2013)
gi|333733230|gb| Bacillus sp. DB-6
gi|375004724 Bacillus cereus strain Se05
25-Z-3
gi|316890830|Bacillus sp. GZT
12-L-6
gi|256858076 Bacillus cereus strain VITSN04
gi|444304029 Bacillus anthracis str. Ames strain
gi|407946468 Bacillus weihenstephanensis strain A2-25c-6b
gi|4585728 Bacillus marinus strain DSM 1297
gi|164562281 Bacillus pumilus strain ST277
25-Z-1
40
99
65
63
66
4152
26
10
0
2
13
54
图 3 菌株 25-Z-3、25-Z-1 和 12-L-6 的 16S rDNA 系统发育树
2014年第4期 151黄怡诚等 ：产胞外多糖植物内生菌的分离和鉴定
胞外多糖的细菌菌株 25-Z-1、25-Z-3 和 12-L-6，并
对其进行分类鉴定。 经 16S rDNA 序列测定及系
统发育分析，从紫薯样品中分离得到的 25-Z-1 与
Bacillus pumilus strain ST277 处于同一分支，相似性
达到 100% ；25-Z-3 与 Bacillus cereus strain Se05 处于
同一分支，相似性达到 99% ；从芦荟中分离得到的
12-L-6 与 Bacillus sp. GZT 处于同一分支，相似性为
99%。 在 LB 液体培养基中，发酵温度 30℃，摇床
转数 170 r/min 条件下，发酵 7 d 后胞外多糖产量可
分别达 30.3 mg/L、29.1 mg/L 及 28.2 mg/L。
参 考 文 献
［1］ 文一 , 赵国华 . 一种新型微生物胞外多糖 --结冷胶［J］. 中国
食品添加剂 , 2003（3）：49-52.
［2］ Purama RK, Goswami P, Khan AT, et al. Structural analysis and pro-
perties of dextran produced by Leuconosto cmesenterides NRRLB 640
［J］. Carbohydrate Polymers, 2009, 76 ：30-35.
［3］ 江晓路 , 郭静 , 李蓉 . 拉恩氏菌 Rahnella sp. PJT 09 发酵产胞外
多糖的研究［J］. 中国海洋大学学报 , 2010, 40（8）：66-72.
［4］ 刘蕴哲 , 何劲 , 张杰 , 等 . 植物内生真菌及其活性代谢产物研究
进展［J］. 菌物研究 , 2005, 3（4）：30-34.
［5］ Evans NA, Hoyne PA, Stone BA. Characteristics and specificity of
the interaction of a fluorochrome from aniline blue（sirofluor）with
polysaccharides［J］. Carbohydrate Polymers, 1984, 4（3）：215-
230.
［6］ 叶凯贞 , 黎碧娜 , 王奎兰 , 等 . 多糖的提取 , 分离与纯化［J］.
广州食品工业科技 , 2004, 20（3）：144-146.
［7］ Wingendes J, Neu TR, Flemming HC. Microbial extracellular polym-
eric substances ：characterization, structure and function［M］.
NewYork ：Springer Press, 1999.
［8］ AlmironRoig E, Mulholland F, Gasson M, et al. The complete cps
gene cluster from Streptococcus thermophilus NCFB2393 involved in
the biosynthesis of a new exopolysacchaaride［J］. Microbiology,
2000, 146 ：2793- 2802.
［9］ Patel AK, Philippe M, Reeta RS, et al. Polysaccharides from
probiotics ：new developments as food additives［J］. Food Technol
Biotechnol, 2010, 48（4）：451-463.
［10］ 东秀珠 , 蔡妙瑛 . 常见细菌系统鉴定手册［M］. 北京 ：科学
出版社 , 2001.
［11］ 布坎南 RE, 吉本斯 NE, 等 . 伯杰细菌系统鉴定手册［M］. 第
八版 . 北京 ：科学出版社 , 1984.
［12］ Sutherland IW, Novel and established applications of microbial
polysaccharide［J］. Tibtech, 1998, 16（1）：41-46.
［14］ Saitou N, Nei M. The neighbor-joining method ：A new method for
recon-structing phylogenetic trees［J］. Mol Biol Evol, 1987, 4（4）：
406-425.
［15］ 李世敏 . 功能食品加工技术［M］. 北京 ：中国轻工业出版社 ,
2006.
［17］ Ma L, Cao YH, Cheng MH, et al. Phylogenetic diversity of bacterial
endophytes of Panax notoginseng with antagonistic characteristics
towards pathogens of root-rot disease complex［J］. Antonie Van
Leeuwenhoek. 2013, 103（2）：299-312.
［18］ Zu L, Li G, An T, Wong PK. Biodegradation kinetics and mechanism
of 2, 4, 6-tribromophenol by Bacillus sp. GZT ：a phenomenon of
xenobiotic methylation during debromination［J］. Bioresour Tec-
hnol, 2012, 110 ：153-9.
（责任编辑 李楠）