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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第8期
脂肪酶（lipase，EC 3.1.1.3）又名甘油酯水解
酶，可以催化三酰基甘油酯水解、酯化、转酯和氨
解等反应［1］，广泛应用于有机合成、油脂化工、洗
涤剂以及食品、医药等领域。脂肪酶广泛存在于动物、
植物和微生物中，在脂质代谢中发挥着重要的作用。
由于微生物具有种类多、生长繁殖快及易发生遗传
变异的特点，微生物源脂肪酶比动、植物源脂肪酶
的性质更具多样性，更加适合于工业化生产。因此，
微生物是工业用脂肪酶的重要来源［2］。其中，南极
假丝酵母脂肪酶 B（CALB）应用最为广泛，它对水
溶性和非水溶性物质都表现出较高的催化活性［3］。
目前，对 CALB 的研究较为透彻，包括其氨基酸序列、
立体三维结构和催化机理等都已获得解析，同时该
酶的基因也已成功实现了克隆表达［4］。但是，天然
游离的 CALB 仍存在一定的缺陷，如热稳定性较差、
产量较低及无法回收利用等，使其在生产实践中的
应用受到限制 ；酶的固定化技术虽然可以解决以上
问题，但是传统的固定化方法成本高、固定化工艺
繁琐及效率低等不利因素的存在，是固定化酶的大
规模应用的重要的瓶颈问题。微生物细胞表面展示
收稿日期 : 2012-02-13
基金项目 : 国家自然科学基金项目（20976062）， 聊城大学博士科研究启动基金项目（31805）
作者简介 : 苏国栋 , 博士 , 讲师 , 研究方向 : 酶工程 ; E-mail: suguodong79@163.com
毕赤酵母展示表达南极假丝酵母脂肪酶 B
苏国栋1 张少平2 尹钰1 林影3
（1 聊城大学生命科学学院 生物工程实验室，聊城 252004 ；2 肇庆学院生命科学学院，肇庆 526061 ；
3 华南理工大学生物科学与工程学院，广州 510006）
摘 要： 将南极假丝脂肪酶 B（CALB）基因 N端和 C端，分别与酿酒酵母絮凝蛋白（Flo1p）絮凝结构域序列的Ｎ端（FS）
和Ｃ端（FL）融合，构建成脂肪酶毕赤酵母表面展示载体 KFS和 KFL，并转化毕赤酵母 GS115后获得重组子 KFS-CALB和 KFL-
CALB。免疫荧光检测证实脂肪酶已展示于毕赤酵母细胞表面。甲醇诱导 120 h后展示酶活性分别达到 286 U/g干细胞和 182 U/g干
细胞。酶的热稳定性较游离酶有较大提高，50℃孵育 4 h后 KFS-CALB菌株的残留酶活力仍保持初始酶活力 70%以上；KFL-CALB
在 50℃孵育 2 h后的酶活力也达到初始酶活力 50%，远远高于游离态的 CALB，其在 50℃孵育 0.5 h后仅残留 18%的初始酶活力。
关键词： 表面展示 脂肪酶 絮凝素 热稳定性
Display of Candida antarctica LipaseB on Cells Surface of Pichia pastoris
Su Guodong1 Zhang Shaoping2 Yin Yu1 Lin Ying3
（1College of Life Science，Liaocheng University，Laboratory of Bioengineering，Liaocheng 252004；2College of Life Science，Zhaoqing
University，Zhaoqing 526061；3School of Bioscience and Bioengineering，South China University of Technology，Guangzhou 510006）
Abstract: P. pastoris display vectors of lipase were constructed by fusing N-terminal and C-terminal of FLO-flocculation domain to
N-terminal and C-terminal of Candida antarctica LipaseB, respectively. The recombinant vectors were named KFS and KFL, respectively,
and then transformed into P. pastoris GS115. The recombinants were named KFS-CALB and KFL-CALB. The fluorescence microscopy of
immunolabeled P. pastoris revealed the lipase was displayed on the cell surface. The hydrolysis activity of lipase displayed on P. pastoris cell
surface reached 286 U/g dry cell and 182 U/g dry cell after 120 h of induction. The thermalstability of displayed lipase was improved comparing
with free lipase which only 18% of initial activity after incubation at 50℃ for 0.5 h, the residual activity of KFS-CALB was above 70% of
initial activity after incubation at 50℃ for 4 h, and the residual activity of KFL-CALB was above 50% of initial activity after incubation at
50℃ for 2 h.
Key words: Surface display Lipase Flocculation protein Thermostability
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第8期108
技术，为功能酶的固定化提供了一种新的基于基因
体外重组技术的生物学方法。
微生物细胞表面展示技术是通过将目的外源
蛋白基因序列与特定的锚定蛋白基因序列融合后导
入微生物宿主细胞融合表达，融合蛋白在锚定蛋白
的引导下定位于微生物的细胞壁表面，并使外源目
的蛋白保持相对独立的空间构象和原有的生物学活
性［5］。酵母展示系统是比较理想的、应用较广泛
的展示系统，其优势在于遗传操作方便，能对表达
的外源蛋白进行折叠、糖基化等翻译后修饰，因而
适宜表达真核蛋白。目前已有多种工业酶（如脂肪
酶、纤维素酶等）被成功展示在酿酒酵母细胞表面。
Shiraga［6］将米根霉脂肪酶（ROL）固定在酿酒酵母
表面，发现酶的催化活性比目前商业出售的酶高出
3-6 倍，Han 等［7］将米黑根毛酶脂肪酶（RML）固
定在酿酒酵母和毕赤酵母表面，并在无溶剂体系中
合成己酸乙酯 ；Su 等［8］利用 α-凝集素将 CALB 固
定在毕赤酵母细胞上，并催化合成乙酸乙酯等短链
酯，其催化活性是同类商业化酶的 2-3 倍。Kondo
和 Ueda 等［5， 9］利用絮凝素的 N 端（FS）和 C 段（FL）
序列在酿酒酵母中成功展示 CALB，而利用絮凝素
的 FS 和 FL 序列在毕赤酵母中展示 CALB 的研究目
前还未见报道。
本研究采用表面展示技术，利用酿酒酵母絮凝
蛋白 Flo1p 的 N 端絮凝功能区、C 端 GPI 锚定信号
分别构建了 N 端锚定（目的蛋白 C 端游离）、C 端锚
定（目的蛋白 N 端游离）两套毕赤酵母表面展示系
统。首次将南极假丝酵母脂肪酶 B 全基因在这两套
毕赤酵母展示系统中表达，筛选出高活性菌株，并
进行发酵表达，进一步考察利用絮凝素不同的功能
域编码区展示脂肪酶的活性与热稳定性。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌 种 和 质 粒 大 肠 杆 菌 （E.coli） DH5α 由
本室保存 ；毕赤酵母 GS115 和质粒 pPIC9K 购自
Invitrogen 公司 ；pPIC9K-CALB 和 pKFS 载体质粒由
本实验室构建 ；酿酒酵母 MT8-1 由日本京都大学
Ueda 教授惠赠。
1.1.2 酶与试剂 PrimeSTAR HS DNA 聚合酶、T4
DNA 连接酶、DNA Marker 和限制性内切酶购于
TaKaRa 公司 ；酵母培养用 YNB、蛋白胨购自 Difco
公司 ；酵母抽提物购于 Oxford 公司 ；硝基仲丁酸酯
pNPB（C4）购自 Sigma 公司 ；引物合成及 DNA 测
序鉴定由上海生工生物技术公司完成。其他化学试
剂均为国产或进口分析纯试剂。
1.2 方法
1.2.1 南极假丝酵母脂肪酶表面展示载体的构
建 絮凝素 N 端序列展示载体 KFS 由实验室构建，
为获得 FLO 絮凝结构域 C 端序列，以珠磨法［10］提
取絮凝酵母 ATCC 60715 的基因组 DNA，并以该基
因组为模板，设计引物，上游引物 FL-Mlu ：5-ATC-
TACGCGTATGCAATACAAAATCATTAG-3（下划线
部分为 MluⅠ限制性酶切位点）下游引物 FL-Not ：
5-ATTAGCGGCCGCTTAACAGTTGAGCAAATC-3
（下划线部分为 NotⅠ限制性酶切位点）。PCR 产物
和经实验室改造的载体 pPIC9K（添加 MluⅠ酶切位
点）分别经 MluⅠ和 NotⅠ酶切后连接、转化，构
建的毕赤酵母展示载体命名为 pKFL。
再根据 NCBI 报道的 CALBLF058 全基因序列，
设计引物，以实验室构建改造的 pPIC9K-CALB 质
粒为模板，扩增不包含前导肽的成熟基因，再选取
EcoR Ⅰ和 MluⅠ（下划线标出）作为酶切位点在分
别在展示载体 pKFS 和 pKFL 上引入 CALB 基因，为
便于检测在上游引物中添加 FLAG 标签（斜体部分）。
根据 DNAStar 软件设计引物如下 ：5-ATTGGAATTC-
GATTACAAGGATGACGACGATAAGCTGCCTTCCGGTT-
CGGACCTG-3；5-ATTAACGCGTTCAGGGGGTGAC-
GATGCCG-3。PCR 产物经 EcoRⅠ和 MluⅠ双酶切
与纯化后，分别于经过 EcoRⅠ和 MluⅠ双酶切的载
体 pKFS 及 pKFL 连接并过夜转化，构建南极假丝酵
母脂肪酶 B 的展示载体分别命名为 pKFS-CALB 和
pKFL-CALB。重组质粒经酶切验证并进一步序列测
定验证以确保编码框的正确。
1.2.2　酵母转化及筛选　将上述构建成功的质粒
pKFS-CALB 和 pKFL-CALB 用 SacⅠ酶切线性化后
转化毕赤酵母 GS115，转化采用电转化法的替代方
法，具体参照 BD YeastmakerTM Yeast Transformation
System 说明书的修改版本。转化子利用不含 His 的
2012年第8期 109苏国栋等 ：毕赤酵母展示表达南极假丝酵母脂肪酶 B
MD 培养基进行筛选，阳性克隆再用含有 1.0% 三丁
酸甘油酯 MD 平板筛选具备水解活力的菌株。
1.2.3　诱导表达　将重组毕赤酵母GS115-KFS-CALB
和 GS115-KFL-CALB 分别接种于 20 mL 含有 0.5% 甘
油的 BMGY 培养基中，28℃，250 r/min 振荡培养 24
h，收集菌体并在 BMMY 培养基中继续培养，每隔
24 h 向培养基中加入终浓度 1.0% 的甲醇，继续在
28℃，250 r/min 条件下振荡培养 120 h，分别在 0、
24、48、72、96 和 120 h 取样测定酶活力。
1.2.4　表面展示脂肪酶的免疫荧光检测　取上述诱
导表达 120 h 的细胞培养物离心收集菌体，用 PBS
洗涤细胞 3 次，将细胞用 200 μL 含 1% BSA 的 PBS
重悬封闭酵母细胞，加入 1 μL 鼠源 Flag 单抗（0.2
g/L），37℃温育 2-3 h。PBS 洗涤 3 次，200 μL PBS
（1% BSA）悬浮，加 1 μL Alexa fluor 488 goat anti-
mouse IgG antibody （2 g/L），37℃温育 1 h，PBS 洗涤
2次再用PBS稀释至适宜浓度，在荧光显微镜下观察，
激发光波长为 488 nm。
1.2.5　表面展示脂肪酶活性的定量测定　离心收集
发酵液中的重组毕赤酵母菌体，用 PBS 洗涤两次，
然后用 PBS 稀释至适宜的浓度用于酶活性检测。展
示 CALB 的酶活力测定采用吸光度法并略作修改。
将对硝基苯酚仲丁酸酯底物溶于 4.85 mL 异丙醇中，
添加 125 μL Triton X-100 作乳化剂制备浓度为 1.25
mmol/L 的底物溶液。将 5 μL 含有上述 KFS-CALB 和
KFL-CALB 的混悬液和 50 μL 底物溶液与 900 μL 100
mmol/L Tris-HCl 缓冲液混合，配制体积为 1 mL 的酶
活力测定体系，于适当的温度反应5 min后终止反应，
测量 OD405。1 个酶活力单位定义为每分钟水解底物
对硝基苯酚酯生成 1 μmol 对硝基苯酚所需的酶量。
1.2.6　表面展示脂肪酶热稳定性的测定　 离心收集
甲醇诱导 120 h 的 GS115-KFS-CALB 和 GS115-KFL-
CALB，PBS洗涤两次后重悬，于振荡条件下50℃孵育，
每 30 min 取 1 份细胞悬液，按 1.2.5 所述的方法测
定酶活力。以未经热处理酶活力为 100%，热处理
不同时间的酶活力与初始酶活力的比值作为相对酶
活力，并与游离的 CALB 的热稳定性进行对比，其
中游离 CALB 由本实验室构建的重组毕赤酵母分泌
表达。
2　结果
2.1　南极假丝酵母脂肪酶B表面展示载体的构建
以絮凝酵母 ATCC 60715 基因组 DNA 为模板，
PCR扩增得到1.2 kb表面展示载体蛋白FL编码基因，
将其克隆至毕赤酵母表达载体 pPIC9K AOX1 启动子
下游构建成毕赤酵母表面展示载体 pKFL。然后再以
质粒 pPIC9K-CALB 为模板，扩增得到 1.0 kb 的南极
假丝酵母脂肪酶 B 编码基因，将其克隆到表面展示
载体 pKFL 和实验室之前构建的 pKFS 上，并分别在
FL 序列、 FS 序列和 CALB 序列之间添加了 Flag 标签
编码序列以便于免疫荧光染色检测，构建成功脂肪
酶表面展示载体pKFS-CALB和pKFL-CALB，如图1-A
和 1-B。对构建成的载体进行酶切验证，用 MluⅠ
和 EcoR Ⅰ进行酶切，酶切产物电泳后可见两条带，
分子量大小分别为 10 kb 和 1.0 kb （图 2），酶切验
证结果与预期一致。测序结果表明编码框和设计
一致。
图 1 表面展示载体 pKFS-CALB（A）和
pKFL-CALB（B）的结构
A. 构建絮凝素 N 端絮凝功能域展示载体示意图 ；
B. 构建絮凝素 C 端 GPI 锚定域展示载体示意图
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第8期110
2.2　表面展示脂肪酶的免疫荧光检测
重组酵母GS115-KFL-CALB和GS115-KFS-CALB
在甲醇诱导下表达 GPI 锚定蛋白 FL 和絮凝功能域
FS 蛋白、 Flag 标签和 CALB 3 个片段的融合蛋白，
以抗 Flag 标签的鼠单克隆抗体结合展示于细胞表面
的融合蛋白内部的 Flag 标签。以 Alexa fluor 488 标
记山羊抗小鼠 IgG 抗体将信号放大，荧光显微镜下
可见整合 pKFL-CALB 和 pKFS-CALB 序列的重组毕
赤酵母细胞周围有明显的绿色荧光，但荧光在细胞
表面分布不均匀，且不同细胞个体间荧光强度差异
也较大 ；而整合空质粒 pPIC9K 的对照细胞表面没
有荧光（图 3），以上结果表明脂肪酶已成功展示于
毕赤酵母。
2.3　表面展示脂肪酶的活性检测
将转化 pKFL-CALB 和 pKFS-CALB 的菌株接种
于三丁酸甘油酯-MD 平板上，筛选水解圈大的重组
菌株，平板筛选结果见图 4，其中空载体 pPIC9K
转化对照菌株，菌落周围没有水解圈，重组酵母
GS115-KFL-CALB 和 GS115-KFS-CALB，菌落周围已
形成明显的水解圈，说明脂肪酶已成功展示于细胞
表面并具有水解短链脂肪酸酯的活性。在液体培养
发酵中检测毕赤酵母表面脂肪酶活性随时间的变化
情况，结果（图 5）显示，当诱导时间为 0-120 h 时，
酶活性随着诱导时间的延长而增加，120 h 酶活性达
到最大值 286 U/g 干细胞和 182 U/g 干细胞，然后开
始缓慢降低，酶活力的降低可能是由于展示在酵母
细胞表面的脂肪酶被发酵液中酵母自身释放出蛋白
酶水解的结果。以 FS 絮凝功能域为锚定蛋白展示
的 CALB 的水解活力高于 GPI 锚定功能域 FL 的水解
活力，可能是由于 FS 蛋白的亲水性远大于 FL 蛋白
的亲水性 ；也可能是 FS 与 CALB 形成的融合蛋白在
空间折叠时比 FL 与 CALB 形成的融合蛋白更容易使
CALB 的活性中心与底物结合。
图 2 展示载体 pKFL-CALB和 pKFS-CALB的酶切鉴定
M. DNA Marker ；1, 2. pKFL-CALB 经 MluⅠ和 EcoRⅠ酶切电
泳结果 ；3. pKFS-CALB 经 MluⅠ和 EcoRⅠ酶切电泳结果
a. GS115-pPIC9K 细胞 ；b. GS115-pPIC9K 细胞免疫荧光染色
照片 ；c. GS115-KFS-CALB 细胞 ；d. GS115-KFS-CALB 细胞免
疫荧光染色照片 ；e. GS115-KFL-CALB 细胞 ；f. GS115-KFL-
CALB 细胞免疫荧光染色照片
图 3　 毕赤酵母表面展示南极假丝酵母脂肪酶 B的
免疫荧光检测
图 4　表面展示 CALB三丁酸甘油酯-MD平板检测
A. 空载体 pPIC9K 转化 GS115 的重组菌株 ; B. 重组酵母 GS115-
KFL-CALB 菌株 ; C. 重组酵母 GS115-KFS-CALB 菌株
图 5 诱导时间对毕赤酵母表面展示脂肪酶活力的影响
2. 4　毕赤酵母表面展示CALB的热稳定性
展示在酵母表面的南极假丝酵母脂肪酶 B 和
2012年第8期 111苏国栋等 ：毕赤酵母展示表达南极假丝酵母脂肪酶 B
游离脂肪酶热稳定性的比较，见图 6。游离脂肪酶
50℃处理 0.5 h 后，酶活力降低到初始活性的 18%，
2 h 后，几乎检测不到酶活性 ；而以絮凝功能域 FS
表面展示的脂肪酶在 50℃处理 4 h 后，依然保持相
当于初始值 70% 以上的活性，以 GPI 锚定区域的
FL 蛋白展示的 CALB 在 50℃处理 2 h 后也依然残留
50% 的初始酶活力。以上结果表明利用毕赤酵母展
示固定 CALB 大大的提高了该酶的热稳定性，为其
进一步的应用奠定基础。
细胞的不同，微生物细胞表面展示系统可分为噬菌
体展示系统、细菌展示系统和酵母展示系统。酵母
细胞体积较大，细胞表面有刚性的细胞壁，机械强
度大，因此更适合作为表面展示的宿主细胞。近年
来，酵母细胞表面展示技术是发展较快的一种真核
蛋白表达系统［12］。与酿酒酵母相比，毕赤酵母由于
发酵密度高，并且以廉价的甲醇为碳源，在工业化
生产中更具优势［13］。目前，最为常见的酵母细胞表
面展示表达系统包括 ：凝集素展示系统和絮凝素展
示系统［14］。絮凝素 Flo1p 是酵母细胞表面类似凝集
素的细胞壁蛋白，在细胞表面的絮凝反应中起着主
要作用。Flo1p 有两个细胞壁结合结构域，一个是 N
端的絮凝功能结构域，能识别细胞壁中的 α-甘露聚
糖组分并与之非共价结合 ；另一个是 C 端的 GPI 锚
定蛋白附着信号［15］。
本研究中表面展示的载体蛋白分别利用絮凝功
能结构域和絮凝 GPI 锚定域，将南极假丝酵母脂肪
酶Ｂ与絮凝功能结构域 FS 的 C 端融合和 GPI 锚定
域FL的N端，分别使融合蛋白锚定于酵母细胞壁上，
C 端和 N 端的脂肪酶可以与底物充分接触完成催化
反应。免疫荧光和 MD 水解平板检测结果表明脂肪
酶已成功展示于细胞表面并保持活性。本研究中表
面展示脂肪酶的酶活力最高可达 286 U/g 干细胞，远
高于已有的相关利用酵母展示脂肪酶的报道［16］；虽
然与相同条件下表达游离脂肪酶相比产量依然偏低，
但脂肪酶的热稳定性较游离酶已大幅度提高。推测
其热稳定性提高的原因一方面可能由于锚定蛋白将
脂肪酶固定在细胞表面即将酶进行固定化而使其稳
定性提高 ；另一方面，可能不同细胞展示方式对脂
肪酶 CALB 在空间构象的影响导致其稳定性的提高
和差异。成功构建的 GS115-KFS-CALB 重组菌株，
在水解活力和热稳定性方面展现其潜在的应用价值。
如果尝试利用定向进化手段对 CALB 基因进行改造，
提高其酶活力和热稳定性，同时再进一步的优化相
关发酵表达条件，表面展示酶的活性和热稳定性还
可能进一步的提高。
4　结论
本试验分别克隆絮凝素 N 端和 C 端基因序列
并构建 KFS-CALB 和 KFL-CALB 展示载体，并在毕
图 6 毕赤酵母表面展示脂肪酶的热稳定性
3　讨论
南极假丝酵母脂肪酶 B （CALB） 应用最为广泛，
它对水溶性和非水溶性物质都表现出较高的催化活
性。CALB 的结构是一典型的 α/β 水解酶类似折叠，
活性位点位于蛋白结构的中心，由催化三联 Ser105-
Asp187-His224、1 个氧负离子洞及 1 个特异性底物结
合口袋构成［11］。在 CALB 的活性位点附近的保守序
列 Thr-x-Ser-x-Gly，与大多数脂肪酶不同的是 CALB
的活性中心并没有被螺旋片段 （又称为“盖子”） 埋
藏，因此，CALB 无界面活性。这些优越的性能使
CALB 在工业催化与医药生产领域拥有巨大的应用
潜力［4］。然而，游离态的南极假丝酵母脂肪酶 B 的
热稳定性差，一般在 30-40℃，并且游离酶回收困
难，不利于反复利用，这些问题都限制了其工业应
用。 利用材料作为载体生产的固定化酶虽然可以在
一定程度解决上述问题，但也存在载体与试剂较贵、
成本高、固定化效率低下、工程投资大、酶活力回
收低等限制因素。利用微生物细胞表面展示技术将
功能酶在细胞表面固定，微生物细胞既可作为酶的
表达宿主，又能充当酶的固定化载体，免去了酶的
表达、纯化和固定等繁琐的操作，简化了生产表达
的环节，大大降低了生产成本。 根据展示酶的宿主
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第8期112
赤酵母中分别成功展示表达了脂肪酶 CALB ；脂肪
酶 CALB 的水解活力分别为 286 U/g 干细胞和 182
U/g 干细胞。进一步对展示酶的热稳定性进行研究
结果发现，在 50℃孵育 2 h 后 KFS-CALB 菌株的热
稳定性是 KFL-CALB 菌株 1.5 倍，远高于游离态的
CALB。
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（责任编辑 李楠）