全 文 ：·技术与方法·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第9期
收稿日期 : 2012-01-05
基金项目 : 新药创制重大专项课题（2008ZX09204-004）, 浙江省科技重大专项社会发展项目（2008C03004-1）
作者简介 : 蔡成平 , 男 , 硕士研究生 , 研究方向 : 生物化工 ; E-mail: caicp19870204@hotmail.com
通讯作者 : 郑裕国 , 教授 , 研究方向 : 生物催化与生物转化 ; E-mail: zhengyg@zjut.edu.cn
微生物次级代谢产物是人类广泛利用的生物资
源，而自然界中的微生物在长期的进化过程中形成
了严密地反馈抑制、阻遏等代谢调控机制，不会过
量生产超过其自身生长以及代谢所需的酶类或代谢
产物。在不损及微生物基本生命活动的前提下，采
用各种改良策略和手段，改变微生物的遗传结构和
代谢控制机制，使之成为目标次级代谢产物的过量
生产的“浪费型”菌株，对于实现工业化应用具有
重要的意义。经典的物理化学等改良方法虽简单有
效，无需了解其遗传背景，至今依然被广泛使用，
但是耗时长、效率低 ；而基因工程、代谢工程等新
一代育种方法虽高效，目标明确，但需掌握复杂的
遗传信息，代谢调控机制采用一些高新技术，因而
限制其广泛使用。因此，采用简单而高效的方法对
具有工业价值的微生物进行改造，充分挖掘其潜力
对于开发新药物和实现其产业化具有极其重要意义。
自 1996 年 Shima 等［1］发现向变铅青链霉菌
（Streptomyces lividans TK24 Str-6）核糖体中引入某些
点突变（第 88 位 Lys 被 Glu 取代，即 K88E 突变株），
显著地提高了放线菌紫红素（Act）的生产。随后大
量的研究表明，通过向微生物核糖体或 RNA 聚合
酶中引入特定的突变（通常会表现出特定的抗生素
核糖体工程与微生物次级代谢产物合成
蔡成平 王远山 郑裕国
（浙江工业大学生物工程研究所 教育部生物转化与生物净化工程中心，杭州 310014）
摘 要： 核糖体工程通过对微生物次级代谢产物合成相关基因表达的两个重要元件——核糖体或 RNA聚合酶进行修饰和改
造，带来其结构和功能上的改变，进而影响次级代谢产物的合成。因此，向核糖体组成元件中引入特定的突变就能够有效地调节
次级代谢产物的合成，通过该技术改造有重要商业价值的工业微生物，提高其次级代谢产物（如抗生素）的合成能力，对于微生
物次生代谢产物研发及产业化具有重要的科研与经济价值。
关键词： 核糖体工程 核糖体 RNA聚合酶 次级代谢产物
Ribosome Engineering and Microorganism Secondary Metabolite
Production
Cai Chengping Wang Yuanshan Zheng Yuguo
（Institute of Bioengineering，Zhejiang University of Technology；Engineering Research Center of Bioconversion and Biopurification，Ministry
of Education，Zhejiang University of Technology，Hangzhou 310014）
Abstract: Ribosome and RNA polymerase are ribosomal components and play pivot role in microbial secondary products biosynthesis by
regulating relevant genes expression. By modifying the ribosome and RNA polymerase，ribosome engineering，a promising breeding method，
will changes their structure and function，which subsequently influence the secondary metabolites synthesis. Researches have demonstrated
that specific mutations of ribosome and RNA polymerase can efficiently regulate the microbial secondary metabolite synthesis. Overproduction
of valuable microbial secondary metabolites such as antibiotics has been accomplished by ribosome engineering. This is helpful for research and
development of microbial secondary metabolites.
Key words: Ribosome engineering Ribosome RNA polymerase Secondary metabolite
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第9期52
抗性）会激活次级代谢产物生物合成相关基因，最
终导致次级代谢产物的过量表达。基于这些发现，
Ochi 等［2，3］提出了“核糖体工程”的概念，通过对
核糖体和 RNA 聚合酶进行修饰和改造，激活细胞自
身潜能，导致次级代谢产物过量表达，细胞分化，
产生毒素等。目前，核糖体工程已广泛应用于菌种
改良、植物育种、无细胞翻译系统和治疗肺结核等
方面。其中引入特定的抗生素抗性突变，筛选高效
抗性突变株，提高次级代谢产物产量是其应用最为
广泛的一个领域。
1 ppGpp与应急反应
1.1 应急反应与ppGpp合成
微生物在长期的自然进化过程中形成了复杂的
环境适应系统，该系统能够快速感应周围环境变化
并迅速将信息传递至胞内，通过调节自身生命活动，
引起一系列的生理应答反应以应对外界环境变化，
这种应答机制被称作应急反应［4，5］。
通常情况下，由于微生物体内存在（p）ppGpp
焦磷酸酶的水解作用，胞内小分子鸟苷四磷酸
ppGpp（图 1）含量较低，一旦受到环境压力刺激时，
其大量积累触发应急反应。在大肠杆菌中氨基酸匮
乏时，微生物体内会出现大量的脱酰 tRNA，低亲和
力地结合到核糖体 A 位点，导致核糖体受阻。随后
RelA（由 relA 编码的 ppGpp 合成酶）检测核糖体
受阻，被核糖体延伸突出的 3mRNA 激发。在核糖
体 L11 蛋白存在的条件下，RelA 结合到核糖体上，
以 ATP 与 GTP/GDP 为底物合成 ppGpp 和 AMP（图
1）。与此同时，RelA（而不是核糖体 A 位点上
的 tRNA）重新被释放，与下一个核糖体结合重复
ppGpp 合成过程，直到胞内积累的 ppGpp 水平足以
引发应急反应，激发次级代谢产物合成。而一旦度
过匮乏状态，与核糖体 A 位点高亲和力的氨酰 tRNA
取代低亲和力的脱酰 tRNA，受阻的核糖体开始恢
复，重新开启翻译过程。当 relA 或 relC（编码核糖
体 L11 蛋白）突变，氨基酸匮乏时 ppGpp 不能够大
量合成，导致其次级代谢产物合成能力的丧失［6-8］。
与 RelA 同源且具有类似催化功能的 SpoT 具有
ppGpp 合成和水解双重功效［9］，通过控制其活性可
以控制 ppGpp 水解和合成的平衡，进而控制 ppGpp
含量，决定是否启动应急反应。SpoT 与磷酸盐、金
属离子、碳源或脂肪酸匮乏有关，在脂肪酸缺乏时，
原本结合在 SpoT 的 C 端金属依赖磷酸水解酶区域
（TGS）的酰基载体蛋白 ACP（脂肪酸代谢关键辅因
子）经修饰后结合在 TGS，激活 SpoT 的活性。但是
其合成 ppGpp 机制尚不清楚，还有待进一步研究。
1.2 （p）ppGpp调节机制
大量研究表明，作为“magic spots”和胞内信
号素［5］，应急反应中积累的 ppGpp 能够从正反两
方面调控基因翻译控制细胞应对新环境。一方面，
ppGpp 能够结合的靶位点 RNA 聚合酶 β-亚基［10］，
调控 RNA 聚合酶抑制 rRNA 的合成［11，12］。而在
图 1 应急反应与 ppGpp合成［7］
2012年第9期 53蔡成平等 ：核糖体工程与微生物次级代谢产物合成
DNA 复制形成复制叉过程中诱导积累 ppGpp，通过
与 DNA 引发酶直接结合，干扰后随链和前导链合成
抑制 DNA 复制［13］。除此之外，ppGpp 还能够干扰
核糖体上翻译延伸因子 EF-Tu 和 EF-G 以及翻译引
发因子 IF 抑制蛋白质合成［14］，并扮演 GTP 竞争者
角色，竞争性抑制次黄嘌呤核苷酸脱氢酶（IMPDH）
和腺苷酸基琥珀酸合成酶（AdSS）等关键酶活性，
从而调节嘌呤核苷酸类的合成。另一方面，积累的
ppGpp 能够作用于 RNA 聚合酶，调节 RNA 聚合酶
合成氨基酸和次级代谢产物，形成孢子，感染宿主［15］
（图 2）。因此，研究 ppGpp 调控的机制有助于开发
新的微生物次级代谢途径调控方式，通过激活沉默
图 2 应急反应中 ppGpp的作用机制［14］
基因，引发次级代谢产物过量生产。
2 核糖体工程与次级代谢产物合成机制研究
微生物通常在进入生长稳定期后开始合成次级
代谢产物，其次级代谢产物生物合成相关基因的表
达决定于翻译机器——核糖体。微生物核糖体除了
表达蛋白外，其上还存在多种感知周围环境，调节
自身生长的重要位点和多种抗生素结合位点。通过
对抗生素抗性机制的研究表明，作用位点与 ppGpp
邻近的抗生素利福平以及作用位点在核糖体上的抗
生素（链霉素、庆大霉素、巴龙霉素和硫链丝菌肽）
等都能模拟 ppGpp 的作用，使微生物产生类似应急
反应的现象，核糖体结构的改变带来蛋白合成能力
的改变，微生物次级代谢产物的调控途径受到影响，
提高微生物代谢产物合成能力。核糖体工程主要围
绕核糖体和 RNA 聚合酶两个重要靶目标进行修饰和
改造，以抗生素抗性突变为外在特征，向其合成相
关基因中引入特定的点突变或缺失突变，核糖体结
构的改变引起蛋白合成能力的改变，进而影响微生
物次级代谢产物的合成（图 3） ［2，3，16］。核糖体工程
通过抗生素抗性突变菌株的筛选，调节微生物次级
代谢产物的合成，对于具有重要经济价值工业微生
物的改良具有重要意义，而且由于操作简单，无需
了解遗传背景，易于与其他改良方法联合使用，使
得其能够作为一种“理性化”育种方法而被广泛引用。
2.1 核糖体S12蛋白基因突变与链霉素抗性
原核生物核糖体由 30S 和 50S 大小亚基组成，
30S 小亚基在 mRNA 的指引下负责遗传信息的解码，
并与大亚基 50S 一起参与多肽链的合成，而 30S 小
亚基上的核糖体 S12 蛋白处在核糖体两个大小亚基
接口处，靠近解码区域中心，在决定同源 tRNA 选
择效率，增强 mRNA 翻译精确性过程中扮演重要角
色［17，18］。研究发现，S12 蛋白基因（rpsL）突变（通
常伴随着高链霉素浓度抗性突变）集中在 S12 的循
环结构中的两个保守区域 ：区域 I（TPKKPNS，氨
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基酸残基）和区域 II（RVKDLPGVR），大多数 rpsL
突变发生在区域 I 内。在放线菌遗传学研究的模式
菌株天蓝色链霉菌［Streptomyces coelicolor A3（2）］
和其近缘种变铅青链霉菌（S. lividans 66），虽然 S.
lividans 66 存在放线紫红素生物合成基因，但只有
在引入特定的调节基因或特殊的培养条件下才能产
生放线紫红素中，通过向引入抗生素抗性突变获得
6 株突变株 ：K43N、K43R、K43T、K88E、K88R 和
P91S。这些突变株突变位点都位于保守区域内，其
中只有 S. coelicolor A3（2） 的 rpsL突变株 K88E 和
P91S 位于区域 II，二者激活天蓝色放线紫红素和
十一烷基灵菌红素。为了进一步研究该区域其他位
点突变是否能激活 S. lividans抗生素生产能力，鉴
于并非所有突变都涉及到抗性突变，因此采用定点
突变技术构建 8 株（K43R、R86L、V87K、R94G、
K88G、D89R、L90K 和 G92D）不同的 rpsL突变基
因至单拷贝载体上并转化至野生型 S. lividans TK21。
结果显示，突变株 L90K 和 R94G 激活了 S. lividans
的十一烷基灵菌红素合成能力，且其十一烷基灵菌
红素产生能力高于 K88E 突变株［19］。
rpsL突变引起次级代谢产物的过量生产是因为
其引起核糖体 S12 蛋白结构发生改变，导致一些次
级代谢产物相关基因被激活或过量表达。当 relA 基
因发生突变时，微生物胞内便不能合成 ppGpp，其
次级代谢产物也不能生产，但是如果在该 relA突变
株中 rpsL 基因（编码核糖体蛋白 S12）引入链霉素
抗性突变后，会发现在 ppGpp 合成能力在没有恢复
的情况下就能恢复次级代谢产物合成能力。通过对
S. lividans 链霉素抗性突变株 K88E 研究发现，在生
长稳定期胞内会出现异常蛋白表达，并且在氨基酸
匮乏、低 Mg2+ 离子浓度环境压力下，其核糖体 70S
复合体结构稳定性提高，导致异常蛋白表达，进一
图 3 核糖体工程激活细胞潜能［2］
2012年第9期 55蔡成平等 ：核糖体工程与微生物次级代谢产物合成
步研究还发现突变株 K88E 在稳定期核糖体循环因
子 RRF 表达的增强同样会导致异常蛋白表达。在
rpsL突变株 K88E 中，其核糖体 70S 复合体结构稳定
性提高和核糖体循环因子 RRF 水平的升高会增强蛋
白合成，异常蛋白表达增强，导致放线紫红素生物
合成基因簇中特殊的代谢途径调节基因 ActII-ORF4
的激活与表达，引发放线紫红素大量合成［2， 3， 19-22］
（图 4）。
图 4 rpsL突变导致抗生素过量合成［3］
而低浓度链霉素抗性突变是因编码 16S rRNA 甲
基化转移酶（包含 S-腺苷甲硫氨酸结合区域）rsmG
基因突变引起的，rsmG 基因突变导致 16S rRNA 上
的一个保守的鸟苷甲基化 G527 位置甲基化功能缺
失。rsmG突变株与 rpsL突变株一样表现出蛋白质合
成活性，同时胞内 S-腺苷甲硫氨酸合成酶活性增强，
ActII-ORF4 表达增强，导致抗生素的过量产生［23］。
rsmG突变株的自发突变率（10-6）约为 rpsL突变
（10-8-10-9）的 100-1 000 倍。研究还发现组合 rpsL
和 rsmG突变对于提高次级代谢产物合成具有协同效
应，这为通过修饰核糖体进一步提高次级代谢产物
合成能力提供了一种新的策略［24］。
2.2 RNA多聚酶β-亚基基因突变与利福平抗性
RNA 聚合酶是转录中较重要的一个酶，它由
两个相同 α 亚基、一个 β 亚基和一个 β亚基组成的
（α2ββ）结构的复合酶，通过与不同的 σ 因子结合，
识别不同的转录结合位点而发挥 RNA 聚合酶的功
能。作为基因表达的重要元件，RNA 聚合酶是表达
调控的关键靶位。研究报道，RNA 聚合酶是 ppGpp
调控的目标，ppGpp 敏感性区域靠近位于 RNA 聚
合酶活性中心 β-亚基上利福平结合区域（Rif-cluster
I，通常情况下利福平自发抗性突变发生在此区域），
Rif 中的某些突变必然会影响 Rif-cluster I 和 RNA 聚
合酶的活性以及其邻近的 ppGpp 结合区域的功能，
最终影响到受ppGpp 调控启动的次级代谢过程［25-27］。
已有研究报道，在多种微生物中 RNA 聚合酶 β-
亚基编码基因 rpoB 中利福平抗性突变激活次级代谢
产物的生产［25-31］。relA 或 relC（rel）突变会造成胞
内无法合成 ppGpp，会损及其调控启动次级代谢能
力，导致次级代谢产物能力丧失。而在 S. coelicolor
A3（2）中引入利福平抗性突变，激活了放线紫红
素的合成。研究发现，从恢复了放线紫红素合成能
力的 rel 突变株中分离得到利福平抗性突变株，rel
和利福平抗性双重突变株增强了特定途径的调节基
因 ActII-ORF4 表达，而在正常情况下 rel突变株中
ActII-ORF4 表达应减少，而且在营养丰富的培养基
中双重突变株表现出比亲本更低的 RNA 合成速率，
扮演“应急”RNA 聚合酶角色。结果表明，RNA 聚
合酶中特定的突变会模拟 ppGpp 的结合方式而不需
要依赖于 ppGpp 来激活抗生素的合成（图 5），揭示
了一类由利福平抗性突变激发的、不依赖于 ppGpp
的次级代谢途径启始机制［2， 3， 15， 26， 27］。在 S. lividans
中引入利福平抗性突变可以激活放线紫红素，十一
烷基灵菌红素和钙依赖型的抗生素（CDA）的合成，
同样，在 Bacillus subtilis 中引入利福平抗性突变能够
显著激活氨基糖苷类抗生素 Neotrehalosodiamine （3，
3-diamino-3，3-dideoxy-α，β-trehalose，NTD）的合
成［26， 27］，这为通过调节核糖体激活次级代谢产物生
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第9期56
产提供了新的理论模式。
2.3 核糖体其他元件突变与抗生素抗性
除了链霉素和利福平作用位点外，核糖体上还
存在多种抗生素作用点，这些作用位点的突变同样
会激活次级代谢产物生产。夫西地酸是一类甾体结
构的抗生素，其抗性突变通常是由 fusA（编码延伸
因子 EF-G）的点突变引起的，它主要是通过抑制细
菌 EF-G-GTP 复合体的解离而抑制蛋白质合成，进
而影响次级代谢产物合成。研究表明，其作用机制
可能与链霉素不同［32，33］。庆大霉素是一类氨基糖
苷类抗生素，其抗性突变是由编码核糖体 L6 蛋白的
rplF 基因突变引起的［34］。硫链丝菌素抗性是由编码
核糖体蛋白 L11 基因点突变引起，而大多数巴龙霉
素突变通常位于 16S rRNA 基因中，林可霉素则是由
于核糖体蛋白 S7，L14 和 L15 突变引起的［34-36］。
3 核糖体工程激活次级代谢产物合成
在核糖体中引入特定抗生素抗性突变，激活次
级代谢产物合成是核糖体工程研究和应用最为广泛
的一个领域，目前主要采用单一、组合多种抗生素，
自身抗性以及定点突变技术对核糖体进行修饰改造，
获得次级代谢产物激活的突变株，提高次级代谢产
物的合成能力。通常用于获得抗性突变的抗生素有
链霉素、庆大霉素、巴龙霉素、硫链丝菌素、夫西
地酸、卡那霉素、氯霉素、林可霉素、大观霉素和
新霉素［2，3，16］。
核糖体工程是抗生素抗性为外在特征，直接从
含药抗性平板中筛选形态改变，代谢产物生产等抗
图 5 非 ppGpp依赖的抗生素合成［2］
性突变株（突变频率一般比较低，约为 10-8-10-10），
采用合适的培养基和培养条件进行培养，通过多轮
筛选，可获得次级代谢产物过量表达的突变株。如
需进一步研究其突变株的突变机制，可采用定点突
变、PCR 定量分析等技术对突变株最有可能的突变
基因和其表达的蛋白进行研究分析，确定其抗性突
变与核糖体修饰之间的关系，进而为次级代谢产物
合成开辟新的通道。
链霉素抗性由于具有广谱性、正突变率和增产
百分率高等特点，因此常用作首选抗生素。已有大
量文献报道，通过采用链霉素抗性筛选提高其抗生
素合成能力的有博来霉素、 阿维菌素、 纳他霉素、卑
霉素、万古霉素、恩拉霉素、诺西肽和多杀菌素等［37］。
采用利福平抗性突变的有：3，3-Neotrehalosadiamine
（NTD）［26，27］、西奈芬净（nucleoside sinefungin）［31］、
红霉素（erythromycin）、放线紫红素、十一烷基灵菌
红素和钙依赖型的抗生素［15，28，29］等，除了链霉素
与利福平外，其他抗生素如庆大霉素［38］，巴龙霉素
也可以用来提高放线紫红素、十一烷基灵菌红素和
钙依赖型的抗生素等抗生素的合成，其他的一些自
产抗生素抗性如金霉素、土曲霉酸激活了其抗生素
的合成能力［37］。
研究表明，组合抗生素作用于核糖体会产生协
同或叠加效应，因此采用 2 种或 2 种以上筛选具有
多重抗性突变的高产菌株，是提高产能更为有效的
抗性筛选方法［2，3，34，39，40］。以 S. coelicolor A3（2）
为原始出发菌株，分别从链霉素、利福平、庆大
霉素抗性平板筛选提高 1.6-3 倍的高产突变株（突
变率为 5%-10%），以上述单一抗性高产突变株为
出发菌株，组合上述 3 种抗生素中的 2 种进行筛
选，获得了产量进一步提高的双重抗性突变高产菌
株（1.7-2.5 倍），最后以双重抗性菌株为出发菌株，
组合上述 3 种抗生素进行筛选，获得了比原始出
发菌株高 48 倍的三重抗性高产突变株［39］，而在 S.
coelicolor A3（2）中组合链霉素、庆大霉素等 7 种或
8 种抗生素进行筛选，获得 Act 产量提高的多重突变
株，相对于原始出发菌株提高了 180 倍［34］，极大程
度地提高次级代谢产物，为育种工作者提供借鉴。
核糖体工程操作简单，易于和一些物理化学育
种方法相结合，更加有助于获得高产突变株。因此，
2012年第9期 57蔡成平等 ：核糖体工程与微生物次级代谢产物合成
在育种工作中应用广泛，如结合化学诱变进行筛选
的有南昌霉素 A、赤霉素、小诺霉素和梅岭霉素等；
而与物理诱变相结合的有去甲基万古霉素 ；复合方
式诱变的有梧宁霉素、土曲霉酸等［37］，这些都大大
拓展了核糖体工程的应用范围。但是目前，核糖体
工程主要应用于原核微生物尤其是放线菌的育种，
而在真核生物育种领域的应用还有待进一步研究。
4 结语
核糖体工程通过改造或修饰基因表达的重要元
件核糖体和 RNA 聚合酶，通过对其结构的改造带来
功能上的改变，调节微生物次级代谢途径，这对于
了解微生物的调控机制，提高有商业价值的次级代
谢产物具有重要意义。基于抗生素与核糖体组成元
件上一些特殊的位点之间相互作用，并以抗生素抗
性突变筛选为指针，筛选高产突变菌株，其操作简便、
无需要特殊设备、不需要菌株遗传背景知识等特点，
是一种具有广泛应用前景的推理育种方法。崔承彬
等［41］利用核糖体工程在转化无活性菌株产生活性
产物，拓展药源微生物菌株资源领域的研究所取得
的成绩展现出巨大的潜在应用前景。由于微生物代
谢机制非常复杂，核糖体工程调控机制尚不明确，
还有待科研工作者深入研究。随着一些高新技术的
采用，相信不久的将来，核糖体工程将会作为一门
新的工程技术在充分挖掘微生物潜能，调控微生物
次级代谢产物生产方面扮演重要角色，并在科研与
生物产品产业化应用领域发挥更大的作用。
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（责任编辑 狄艳红）