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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2015, 31(8):225-230
毒死蜱是一种世界范围内广泛使用的有机磷杀
虫剂，早在 1965 年毒死蜱就被引入美国市场并且广
泛应用于农业生产和家庭害虫的防治［1］。2008 年 1
月，我国政府彻底禁止了对硫磷等 5 种高毒有机磷
农药的生产和使用，毒死蜱作为高毒有机磷农药的
替代品应用日益广泛［2］。毒死蜱的大规模应用，也
使其逐渐成为人体健康和环境污染研究领域的重点
关注对象。尽管毒死蜱属于中等毒性农药，但是其
对多数水生生物仍具有较高毒性，一些发达国家已
经开始禁用或者限制使用毒死蜱［3］。
农作物病虫害防治过程中，使用的农药大部分
会进入农田土壤，并且通过渗透、排水等方式转移
至地下水或河流，造成水体污染［4］。有研究指出，
在相对集中的玉米种植区，径流水带入河水中的毒
收稿日期 ：2014-12-09
基金项目 ：国家自然科学基金项目（31170119），中国农业科学院基础研究基金项目（0042014006，0042012003，0042011006）
作者简介 ：余凯敏，男，硕士研究生，研究方向 ：微生物分子生物学与基因工程 ；E-mail ：kmyu1989@gmail.com
通讯作者 ：闫艳春，女，博士，教授，研究方向 ：微生物分子生物学与基因工程 ；E-mail ：yanyanchun@caas.cn
毒死蜱的环境生物学效应分析
余凯敏  冯为民  李国超  张家禹  刘丽丽  闫艳春
（中国农业科学院研究生院，北京 100081）
摘 要 ： 高毒有机磷农药禁用以后，毒死蜱作为其替代品逐渐开始大规模应用。毒死蜱在水中降解缓慢，因此在水中的残
留会对水生生物及其他生物造成潜在危害。为探究低浓度毒死蜱的内分泌干扰效应，使用流式细胞仪分析了其对人子宫内膜癌细
胞 HEC-1B 生长周期的影响。为探究高浓度毒死蜱的生物毒性，将斑马鱼胚胎暴露在不同浓度的毒死蜱（0、1.0、2.0、3.0 和 4.0
ppm）中 60 h，发现毒死蜱能导致斑马鱼胚胎的死亡和严重畸形，并且胚胎存活率与处理浓度呈负相关，畸形率与处理浓度呈正相关。
最后，检测了毒死蜱处理后斑马鱼胚胎中 5 种神经系统发育相关基因的表达情况。结果表明，低浓度毒死蜱具有内分泌干扰效应，
高浓度毒死蜱会影响斑马鱼神经系统的正常发育。
关键词 ： 毒死蜱 ；环境生物学效应 ；斑马鱼胚胎 ；神经发育毒性 ；内分泌干扰效应
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.08.033
An Analysis of Environmental and Biological Effects of Chlorpyrifos
Yu Kaimin Feng Weimin Li Guochao Zhang Jiayu Liu Lili Yan Yanchun
（Graduate School，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081）
Abstract ： With the prohibition of high-toxicity organophosphorous pesticides, the chlorpyrifos as their substitute has been used in a
large-scale. The residue of chlorpyrifos, degrading slowly in the water, may cause the potential damages to aquatic organisms and others. To
investigate the endocrine disrupting effects of low-concentration chlorpyrifos, flow cytometry was used to analyze the growth cycle of endometrial
cancer cell HEC-1B of human. Moreover, zebrafish embryos were selected for chlorpyrifos exposing treatment 60 h at various concentrations of
0, 1.0, 2.0, 3.0 and 4.0 ppm. It was found that the chlorpyrifos caused the zebrafish embryos to death and significant embryonic malformation, the
survival rate of the embryos was inversely proportional to chlorpyrifos’ concentration, and the malformation rate was proportional to chlorpyrifos’
concentration. Further, the mRNA expression levels of 5 neurodevelopment maker genes in the chlorpyrifos-treated zebrafish embryos were
detected. These results showed that chlorpyrifos of low-concentration acted as endocrine disruptor, and chlorpyrifos of high-concentration affected
the normal development of nerve system.
Key words ： chlorpyrifos ；environmental and biological effects ；zebrafish embryo ；developmental neurotoxicity ；endocrine
disrupting effect
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.8226
死蜱浓度可达 0.1 μg/L［5］，大豆种植区地表水毒死
蜱浓度最高达 10.8 μg/L［6］，而在肯尼亚的 Naivasha
湖中毒死蜱的浓度高达 26.6 μg/L［7］。由于毒死蜱在
水中降解的速度缓慢，且会随着水体的转移而造成
二次污染，因此其在水中的残留会对水生生物及其
他生物造成潜在的危害。
斑马鱼具有体型小、易于培养、产卵量大、胚
胎易于观察和显微操作等特点，并且斑马鱼胚胎和
幼鱼对有害物质非常敏感，因此常用于研究环境物
质对发育的影响及作用机制［8-10］。基于这些优势，
斑马鱼已经成为一种公认的发育生物学和毒理学研
究模式生物。由于毒死蜱在水环境中具有难以降解
的特性，因此水生模式生物斑马鱼也成为本研究的
理想模型。本研究首先胁迫处理人子宫内膜癌细胞
（HEC-1B）进行流式细胞分析，确定低浓度毒死蜱
的内分泌干扰物效应，然后分析毒死蜱对斑马鱼的
急性毒性和可能的神经发育毒性，旨在探究水环境
残留的毒死蜱所具有环境生物学效应。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 化 学 试 剂 毒 死 蜱（O，O-二 乙 基 -O-3，5，
6- 三氯 -2- 吡啶基硫代磷酸酯，chlorpyrifos，CPF）
购自于中国山东省天成生物科技有限公司，纯度
≥ 98% ；17β-雌二醇（E2）购自于 Sigma 公司，纯
度≥ 98%。荧光染料碘化丙啶（Propidium Iodide，
PI）购自于 Sigma 公司。MEM 细胞培养液、牛血清、
胰酶、PBS 购自 BD 公司。本研究中其他化学试剂
均属于分析纯级别，各种试剂先配制母液保存，使
用前配制相应浓度的工作液。
1.1.2 实验材料 本研究使用的 AB 型野生斑马鱼购
自于国家斑马鱼资源中心（China Zebrafish Resource
Center，CZRC），人子宫内膜癌细胞株 HEC-1B 购自
于中国医学科学院肿瘤细胞库。
1.2 方法
1.2.1 癌细胞的培养和处理 HEC-1B 在 MEM 培养
液中采用开放式单层贴壁培养，培养条件为 37℃，
5% CO2，饱和湿度。加受试物前 4 d 将细胞用 PBS
洗涤后改为在无酚红 MEM 培养液中培养，目的是耗
尽细胞内储存的雌激素。设置空白对照组，雌激素
对照组（E2）：终浓度为 0.05 ppm ；毒死蜱梯度处理
组（CPF）：终浓度分别为 0.05、0.01 和 0.005 ppm。
将 HEC-1B 细胞接种于 5 mL 培养瓶，培养 24 h 待细
胞贴壁后，加入受试物处理 72 h，用胰酶消化收集
细胞，充分吹打，制成单细胞悬液。
1.2.2 细胞周期分析 使用 PI（碘化丙啶）染色法
检验细胞周期。收集胰酶消化的 HEC-1B 细胞，使
用预冷 70% 乙醇于 4℃固定一晚。离心收集细胞，
使 用 50 μg/L 的 PI 溶 液 4℃ 避 光 染 色 30 min，PBS
洗涤两遍后 40 μm 筛网过滤，制成单细胞悬液。使
用流式细胞仪（BD FACSJazz，USA）在 488 nm 波
长下观察细胞周期分布及亚二倍体细胞所占比例，
每个样本检测 3 次。数据使用流式细胞分析软件
FlowJow 7.6.1 分析。
1.2.3 斑马鱼养殖 本研究使用的 AB 型野生斑马
鱼，其养殖方法和胚胎收集按照本实验室的传统方
法进行。即野生型（AB 品系）斑马鱼养殖在封闭
的贯流系统（北京爱生公司）中，自来水经过活性
炭过滤，控制水温（28±0.5）℃，光照黑暗比例
14∶10。斑马鱼每天喂食 3 次，食物为丰年虫幼虫。
将产卵用的成鱼按照 2∶1 的比例装入盒中准备收集
受精卵。挑选发育正常（无畸形）的 0.5-1.0 hpf 的
胚胎，随机分装于一次性培养皿中（50/个）。
1.2.4 毒死蜱对斑马鱼的毒性测试 以定时更换处
理液的方式，使用毒死蜱对斑马鱼胚胎进行毒性处
理，设计 4 个毒死蜱实验浓度，分别为 0、1.00、2.00、
3.00 和 4.00 ppm，每个浓度 3 个平行处理，每个处
理的培养皿中分别加入 50 个发育正常的胚胎和 40
mL 处理液。由于毒死蜱难溶于水，易溶于有机溶
剂这一特征，故选用丙酮作为助溶剂。在处理液中，
丙酮的最高浓度为 0.1%。我们以前的研究表明，低
浓度（<0.1%）的丙酮不会影响实验结果。
1.2.5 斑马鱼胚胎形态学观察 毒死蜱暴露处理后，
每 12 h 对斑马鱼胚胎进行一次镜检（奥林巴斯公司，
日本）观察。将斑马鱼胚胎放入加有 3% 亚甲基纤
维素的双凹载玻片中，明场观察并且拍照记录。统
计分析胚胎的孵化率、畸形率和死亡率。
1.2.6 神经系统相关基因的表达 毒死蜱暴露处理
后，收集胚胎并且加入 TRIzol 试剂 -80℃保存。每
种浓度的胚胎分别取 30 枚保存，一式 3 份。使用
2015,31(8) 227余凯敏等：毒死蜱的环境生物学效应分析
TRIzol 试剂提取总 RNA，总 RNA 浓度在 260 nm 下
估算，质量则通过 OD260/OD280 比率验证。使用 0.8%
琼脂糖凝胶电泳、溴化乙锭染色进行总 RNA 的进一
步验证。单链 cDNA 的合成按照试剂盒（PrimeScr-
iptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser，TaKaRa，
Japan）说明书进行。以 β-actin 作为内参调整数据，
使用 Primer Premier 5 软件设计引物（表 1），PCR 扩
增程序为 ：95℃ 10 min ；95℃ 30 s，57℃ 30 s，72℃
1 min。基因表达的差异倍数通过 2- △△ Ct 方法计算。
3 组平行均进行表达量检测。
表 1 引物序列
基因名 引物序列（5-3） 产物长度 /bp 登录号
β-actin 正向 TCTGGTGATGGTGTGACCCA 141 NM_131031.1
反向 GGTGAAGCTGTAGCCACGCT
neurog1 正向 TGCACAACCTTAACGACGCATTGG 116 NM_131041
反向 TGCCCAGATGTAGT GTGAGCGAA
elavl3 正向 AGACAAGATCACAGGCCAGAGCTT 107 NM_131449
反向 TGGTCTGCAGTTTGAGACCGTTGA
nkx2.2a 正向 CGGCAAACCTTGCCATACGCTAAA 113 Dr.75083
反向 GCGCGTTATATTGCATGTGCTGGA
nestin 正向 ATGCTGGAGAAACATGCCATGCAG 80 XM_001919887
反向 AGGGTGTTTACTTGGGCCTGAAGA
gfap 正向 GGATGCAGCCAATCGTAAT 97 NM_131373
反向 TTCCAGGTCACAGGTCAG
1.2.7 统计分析 使用 Levene 检验方法检测数据的
方差齐性，并且使用 SPSS19.0（美国 SPSS 公司）进
行单因素方差分析（one-way ANOVA）和 Duncan 法
多重比较分析。认定 P<0.05 作为统计显著性的标准，
所有值表示方法均为平均值 ± 标准误（x
-
±s）。
2 结果
2.1 低浓度毒死蜱的毒性
2.1.1 毒死蜱对 HEC-1B 细胞周期的影响 为了进
一步研究毒死蜱的内分泌干扰效应，选用人子宫内
膜癌细胞（HEC-1B）进行胁迫处理。考虑到癌细
胞的耐受性，因此选用相对较低的浓度进行暴露处
理。通过碘化丙啶染色和流式细胞仪检测，并且通
过 FlowJow 分析。对照组的细胞增殖系数 PI（prolif-
erous index，PI）为 22.17，雌二醇 E2 对照组 PI 为
41.19， 毒 死 蜱 0.05、0.01 和 0.005 ppm 处 理 组 的
增 殖 系 数 PI 分 别 为 36.55、34.74 和 30.96（ 表 2）。
对 比 各 组 增 值 系 数，E2 ＞ CPF0.05 ＞ CPF0.01 ＞
CPF0.005 ＞ CK。
2.1.2 毒死蜱对斑马鱼胚胎孵化的影响 考虑到毒
死蜱在水环境中的溶解度仅为 1.2 ppm，因此使用较
低的实验浓度。使用梯度浓度 CPF（0、0.10、0.25、
0.50、0.75 和 1.00 ppm）暴露处理斑马鱼胚胎 48 h
后，出现了一个有趣的现象，即处理组胚胎比对
照组快，并且胚胎的孵化率与暴露浓度成正比（未发
表），同时低浓度处理组很少出现胚胎发育畸形。
表 2 低浓度毒死蜱对 HEC-1B 细胞周期的影响
试剂 剂量 /ppm G0/G1/% S/% G2/M/% PI/%
CK 0 77.83±0.68 10.84±0.32 11.33±0.36 22.17±0.68
E2 0.05 58.81±0.50 24.91±0.86 16.28±0.55 41.19±0.50
CPF 0.05 63.45±0.34 19.16±0.05 17.39±0.29 36.55±0.34
0.01 65.24±0.15 18.64±0.05 16.11±0.11 34.74±0.15
0.005 69.04±0.33 15.38±0.14 15.59±0.18 30.96±0.33
注 ：细胞增殖系数 PI 的计算方法为 ：PI=（S+G2/M）/（G0/G1+S+G2/M）×100%，所有数据表示为 ：x
-±s
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.8228
2.2 高浓度毒死蜱的毒性
2.2.1 毒死蜱对斑马鱼的致死作用 采用梯度浓度
的毒死蜱（0、1.00、2.00、3.00 和 4.00 ppm）对斑
马鱼胚胎进行处理，每 12 h 进行一次处理液更换和
胚胎观察，记录各时段胚胎及幼鱼的存活情况，对
正常幼鱼和死亡幼鱼进行拍照记录（图 1-A 和图
1-B）。处理 60 h 后，毒死蜱 0、1.00、2.00、3.00 和 4.00
ppm 处 理 组 存 活 率 分 别 为 98.9%、91.1%、48.4%、
37.8% 和 23.3%（图 1-C）。
100
C
BA
80
60
40
20
0
0 1.00
**
***
***
2.00 3.00 4.00༴⨶⎃ᓖppmᆈ⍫⦷%
A：对照组胚胎存活并发育成正常幼鱼（40×）；B：处理组死亡幼鱼（40 ×）；
C ：各处理组的胚胎存活率。数据包括 x-±s。数值相对于对照组的显著差异
用星号表示（one-way ANOVA，* P<0.05，** P<0.01，*** P<0.001），下同
图 1 毒死蜱的致死作用
2.2.2 毒死蜱对斑马鱼的致畸作用 梯度浓度的毒
死蜱处理胚胎时，处理 48 h 后孵化的幼鱼就会出现
体轴弯曲、心包囊肿等畸形现象（图 2-A 和图 2-B），
统计该时段的幼鱼出现各畸形的数目并计算平均畸
形率。处理 48 h 后，毒死蜱 0、1.00、2.00、3.00 和
4.00 ppm 处 理 组 体 轴 弯 曲 的 比 例 分 别 为 3.3%、
14.6%、23.9%、37.1% 和 36.8%（ 图 2-C）， 即 随 着
浓度的提高，斑马鱼幼鱼出现畸形的比例也随之提
高。而心包囊肿的畸形现象出现的比例相对较低，
并且该现象出现的时间相对较晚。
2.2.3 毒死蜱对斑马鱼的神经毒性 考虑到毒死蜱
具有神经毒性，因此选取斑马鱼的 5 种神经发育标
志基因作为参考，从基因的转录水平探究其神经发
BA
50C
40
30
10
20
0
0 1.00
**
*
*** ***
2.00 3.00 4.00༴⨶⎃ᓖppm⮨ᖒ⦷
%
A ：幼鱼出现体轴弯曲（箭头所指，40×）；B ：幼鱼出现心包囊肿（箭头所
指，40×）；C ：处理 48 h 后幼鱼的畸形率
图 2 毒死蜱的致畸作用
育毒性。使用 60 h 半致死浓度的毒死蜱（2.00 ppm）
处理斑马鱼胚胎 48 h 后，收集胚胎，提取总 RNA
进行荧光定量 PCR 分析，得到各组基因表达量变化。
本研究选取的神经标志基因包括 neurog1、elavl3、
nkx2.2a、nestin 和 gfap，相对于空白对照组分别上调
1.30、0.58、1.46、1.58 和 0.42 倍（图 3）。
3.0
2.5
2.0
1.0
1.5
0.5
0
CK neurog1
*
*
* *
elavl3 nkx2.2a nestin gfapḷᘇสഐmRNA㺘䗮
ᐞᔲؽᮠ
图 3 神经标志基因 mRNA 表达量的变化
3 讨论
随着毒死蜱的广泛应用，对其毒理的研究也越
来越多样化。2007 年美国环保署（US EPA）公布首
批 73 种化学物质进行内分泌干扰物检测（Endocrine
Disruptor Screening Program，EDSP）， 其 中 就 包 括
2015,31(8) 229余凯敏等：毒死蜱的环境生物学效应分析
毒 死 蜱［11］。 内 分 泌 干 扰 物（endocrine disrupting
chemicals，EDCs）是指干扰生物体内维持内稳态及
调节生殖、发育过程的天然激素的正常体内代谢过
程的外源性物质［12］，包括农药、洗涤剂、杀菌剂、
化妆品、合成雌激素等一系列化合物［13］。一些研究
表明，毒死蜱对雄性小鼠具有内分泌干扰效应，导
致精子异常或死亡［14］。同时，毒死蜱也会对雌性小
鼠生殖器官造成永久伤害［15］。而在我们之前的研究
中，低浓度的毒死蜱能加快斑马鱼胚胎的孵化，可
能是毒死蜱的一种内分泌干扰效应。为了验证毒死
蜱的这种作用，本研究选用人子宫内膜癌细胞 HEC-
1B 进行低浓度毒死蜱胁迫处理，结果发现毒死蜱处
理组的细胞增殖系数高于空白对照组，并且同等浓
度下其增殖效应不及雌二醇，即毒死蜱具有类雌激
素的作用，因此证明毒死蜱具有内分泌干扰物效应。
动物实验是有毒物质毒性测试、新药开发等过
程中的一个重要环节［16］。本研究选用的模式生物斑
马鱼，其胚胎发育早期对环境毒性物质具有相当强
的敏感性，并且产生不同的形态学病变［17-19］。在本
研究中，梯度浓度的毒死蜱处理斑马鱼胚胎后，其
存活率随着处理浓度的上升而降低，并且 60 h 的半
致死浓度约为 2 ppm。毒死蜱不仅会导致斑马鱼胚
胎的死亡，还会造成存活胚胎发育的畸形，并且这
种畸形的比例与处理浓度正相关。斑马鱼毒性测试
结果表明，高浓度的毒死蜱对斑马鱼具有较强的毒
性，并且会导致斑马鱼胚胎的死亡和发育畸形。
研究表明，毒死蜱及其代谢产物能够抑制乙酰
胆碱酶，从而阻止乙酰胆碱的降解，造成神经递质
在突触的累积，导致持久的受体刺激和神经相关信
号通路的异常［20，21］，这也是毒死蜱毒杀害虫的主要
方式。研究发现，毒死蜱能够影响小鼠脑部的发育、
造成小鼠中枢神经系统损伤［22，23］。同时，应用基因
芯片技术对处理前后的大鼠脑干和前脑进行转录谱
分析，发现差异基因主要参与神经细胞的生长、分
化，神经递质合成等过程［24］。因此，为了判断毒死
蜱对斑马鱼的神经系统的发育毒性，本研究选取了
5 种斑马鱼神经系统发育相关的标志基因，试图从
转录水平进行探究。neurog1（ngn1）是神经前体细
胞的标志基因，在斑马鱼胚胎受精 24 h 后主要分布
于前脑、中脑、后脑、脊髓、耳部和鳃背基板处［25］。
elavl3 是最早期的神经元标志物之一，在神经系统广
泛表达，是神经元决定的标志［26］。nkx2.2a 在哺乳
动物和斑马鱼的背腹侧神经系统的形成与功能中起
重要作用［27］。nestin 是一种中等纤维蛋白，它在哺
乳动物神经前体细胞中高表达，已被广泛用作神经
前体细胞的标志分子［28］。gfap 为神经胶质细胞的标
志基因，于胚胎受精 12 h 后在脑中表达，15 h 至成
鱼在神经胶质细胞中持续表达［29］。而本研究中，2
ppm 毒死蜱处理斑马鱼胚胎 48 h 后，5 种标志基因
的 mRNA 表达量基本都出现明显上调，造成神经系
统发育相关基因的表达紊乱，从而影响神经系统正
常发育，也可能是造成斑马鱼胚胎出现畸形的原因。
4 结论
低浓度的毒死蜱具有内分泌干扰效应，能够加
速胚胎的孵化脱膜，同时也能提高癌细胞的增殖系
数，促进细胞的生长和分裂。通过斑马鱼的急性毒
理研究，证明水环境中高浓度的毒死蜱主要表现为
神经毒性，能够造成胚胎的畸形和死亡，并且显著
影响神经系统相关基因的表达量。
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（责任编辑 马鑫）