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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第12期
随着转基因植物种植面积的增长，全球公众对
于转基因植物及其产品的安全性倍加关注，为加强
转基因生物的安全监管，保护消费者的知情权，全
球已有 50 多个国家颁布实施了转基因生物标识制
度［1］。为确保转基因生物标识制度的顺利实施，转
基因生物及其产品检测方法的研究和标准化十分重
要。在转基因产品检测过程中，PCR 技术因其灵敏
度高、重现性好等特性，应用最为广泛［2］。以 PCR
技术为基础的转基因检测，根据其检测特异性的高
低分为筛选、基因特异性、构建特异性和转化体特
收稿日期 ： 2013-07-04
基金项目 ：国家自然科学基金项目（31271810），国家转基因生物新品种培育重大专项（2013ZX08012-003）
作者简介 ：李俊，女，硕士，研究实习员，研究方向 ：基因工程与转基因检测 ；E-mail ：lijuner126@126.com
通讯作者 ：吴刚，男，博士，副研究员，研究方向 ：基因工程与转基因检测 ；E-mail ：wugang1976@gmail.com
Barnase 基因定性 PCR 检测方法及其标准化
李俊  沈旻伟  武玉花  吴刚
（中国农业科学研究院油料作物研究所 农业部油料作物生物学与遗传育种重点实验室，武汉 430062）
摘 要 ： Barnase 基因编码核糖核酸酶，在基因工程育种中通常被用于创建雄性不育系。为了满足转 barnase 基因作物安全
监管的需要，建立了 barnase 基因普通 PCR、实时荧光 PCR 检测方法，具有良好的扩增特异性和检测灵敏度。barnase 基因定性
PCR 检测方法经过了国内 8 家有资质的实验室的循环验证，结果表明该方法能够特异性检测样品中 barnase 基因，检测灵敏度均
达到 0.10% 以上，且检测结果具有良好的重复性和重现性。符合标准方法检测特异性强、灵敏度高、重复性好的要求，为我国转
barnase 基因作物检测和转基因生物安全管理制度的实施提供了相应的技术支撑。
关键词 ： 转基因检测 Barnase 基因 普通 PCR 实时荧光 PCR 循环验证
Development and Standardization of Qualitative PCR Detection
Method Targeting barnase Gene
Li Jun Shen Minwei Wu Yuhua Wu Gang
（Oil Crops Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences，Wuhan 430062）
Abstract:  Barnase gene, encoding a ribonuclease, is usually used for developing male sterility line in genetic engineering research. In
order to meet the requirements of safety regulation of transgenic crops, the conventional PCR and real-time PCR detection methods targeting the
barnase gene were developed, displaying exollent amplification specificity and test sensitivity. The qualitative methods targeting barnase gene
were validated by 8 certified laboratories, results showed that this method could specifically detect the barnase gene from testing samples with
satisfactory detection sensitivity of about 0.1%, fine repeatability and reproducibility, meeting the performance criteria of standard methods. This
study established a suitable method for detection of the transgenic crops harboring the barnase gene, providing technical support for the safety
management of transgenic crops in China.
Key words:  GMO detection Barnase gene Conventional PCR Real-time PCR Validation
异性检测 4 个层次［3，4］。其中转化体特异性检测方
法特异性最高［5］，目前我国已经针对批准进口和在
国内取得安全证书的转基因品种建立了完善的转化
体特异性检测标准体系。但在检测工作中，只采用
转化体特异性检测方法进行检测非常耗时耗力。为
了提高检测效率，通常先采用筛选或基因特异性检
测方法对样品进行初步的筛查检测，然后有针对性
的采用转化体特异性检测方法对样品进行身份鉴定。
因此，以转基因品种中的目的基因为检测靶标建立
基因特异性检测标准，不仅会提高检测工作的效率，
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第12期130
而且会进一步完善我国现行的标准体系。
Barnase 基因来源于解淀粉芽孢杆菌（Bacillus
amyloliquefaciens），编码区长 330 bp，编码一种含
110 个氨基酸残基的核糖核酸酶［6］。这种小分子
的 RNA 酶，在细胞中表达可以非特异性降解胞内
RNA，产生强烈的细胞毒性，其在特异细胞中的表
达通常都会导致宿主细胞死亡［7］。Barnase 基因这一
特性，已经在控制肿瘤细胞的再生以及病毒复制等
领域得到应用［8］。在植物研究领域，barnase 基因最
为重要和最为成功的应用还是通过其在花粉绒毡层
中的特异表达导致花粉败育，进而培育出转基因植
物雄性不育系［9］。自从 Mariani 等［10，11］首次获得烟
草和甘蓝型油菜雄性不育系植株之后，barnase 基因
在转基因育种中获得广泛应用，陆续有育种家将该
基因转化到不同植物中并成功获得转基因雄性不育
性植株，如棉花［12］、白菜［13］、花椰菜和菊苣［14］等。
现在，通过组合使用转化 barnase 基因的雄性不育系、
转 barstar 基因的育性恢复系和非转基因受体育性保
持系，已经成功实现了三系配套的杂交育种［15，16］。
例 如， 拜 耳 公 司（Aventis CropScience） 将 barnase
基因转化到油菜中，培育出了雄性不育转基因油菜
MS1、MS8、Phy14、Phy23、Phy35 和 Phy36， 并 利
用雄性不育系 MS1 和 MS8 培育出耐除草剂甘蓝型油
菜杂交种 MS1×RF1、MS1×RF2 和 MS8×RF3 ；另
外， 将 barnase 基 因 转 化 到 玉 米 中， 培 育 出 玉 米
雄 性 不 育 品 系 MS3 和 MS6［17］；荷 兰 Bejo 种 子 有
限公司（Bejo Zaden BV）将 barnase 基因导入到菊
苣（Cichorium intybus Chicory） 中 培 育 出 了 菊 苣 雄
性不育系 RM3-3、 RM3-4、RM3-6［18］。目前，含有
barnase 基因的转基因作物已经在多个国家被批准商
业化种植和销售，如商业化的转基因杂交油菜品种
MS1×RF1、MS1×RF2 和 MS8×RF3［9］。
国内的一些研发者将 barnase 基因转化到黑杨、
西瓜、玉米、水稻及甘蓝等植物中，获得了育性改
变的转基因植物［19-24］。Barnase 基因在三系配套育
种中应用潜力巨大，研制标准化的 barnase 基因检
测方法，可有效监管转 barnase 基因的转基因作物。
潘良文等［25，26］为检测抗草丁膦油菜籽，初步研究
了 barnase 基因的检测方法，但未考察该方法的扩
增特异性及检测灵敏度等参数。迄今为止，国内外
尚未建立 barnase 基因标准化的检测方法。本研究将
以 barnase 基因作为检测靶标，建立特异性强、灵敏
度高、重复性好的 barnase 基因定性 PCR 检测方法，
并使其标准化，为监管转 barnase 基因作物服务。
1 材料与方法
1.1 材料
转 基 因 材 料 种 子 粉 末 均 由 农 业 部 科 技 发 展
中 心 提 供， 包 括 转 基 因 油 菜 MS1、MS8、RT73、
RF1、RF3、OXY235、Topas19/2 和 T45 ； 转 基 因
棉花 Mon531、Mon1445 和 Mon88913 ；转基因玉米
Mon88077，Bt176、Mon863 和 GA21 ；转 基 因 大 豆
Mon89788、A2704-12 和 GTS-40-3-2 ；转基因水稻科
丰 6 号和 TT51-1。非转基因玉米苏玉糯 1 号，非转
基因油菜中油 821，非转基因棉花中棉 35，非转基
因大豆中豆 29，非转基因水稻明恢 63 均由本实验
室保存。
1.2 方法
1.2.1 植物基因组 DNA 提取 用 QIAGEN DNeasy
Plant Mini Kit（No.69104，Qiagen，Germany） 试 剂
盒提取种子粉末基因组 DNA，具体操作步骤详见说
明书。提取的 DNA 用超微量分光光度计 NanoDrop
2000（Thermo，USA）检测纯度和浓度。
1.2.2 PCR 反应体系及反应条件 普通 PCR ：根据
barnase 基因的核苷酸序列，用 Primer Premier 5.0 设
计正向、反向普通 PCR 引物各 5 条（表 1），并委托
上海生工生物技术公司合成。以转基因油菜 MS8 质
量百分含量为 0.5% 的油菜基因组 DNA 为模板，将
表 1 中的正向引物和反向引物进行两两组合，进行
PCR 扩增，每个反应设置 2 个重复，筛选扩增条带
最亮、重现性最好的引物组合。普通 PCR 反应体系：
50 ng 基 因 组 DNA 1.0 μL，10×PCR buffer 2.5 μL，
25.0 mmol/L MgCl2 1.8 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2.0 μL，
10 μmol/L primer 0.5 μL，1 U/μL Taq DNA 聚合酶 0.5
μL，加 ddH2O 至总反应体积为 25 μL。普通 PCR 反
应条件为 94℃变性 5 min ；94℃变性 30 s，58℃退火
30 s，72℃延伸 30 s，共进行 35 次循环 ；72℃延伸
7 min。用琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 产物，根据电泳
结果筛选出最佳扩增引物组合。设置不同的 Mg2+ 浓
度、退火温度梯度优化反应体系，确定普通 PCR 最
2013年第12期 131李俊等 ：Barnase 基因定性 PCR 检测方法及其标准化
佳反应体系和反应条件。PCR 反应体系中，Mg2+ 浓
度尤为重要，直接影响引物的扩增特异性，以及酶
的催化能力的准确性［27］。本研究设置 1.5、1.6、1.8、2.0
mmol/L 4 个 Mg2+ 浓度梯度进行 PCR 分析。在 PCR
反应条件中以退火温度（Tm）最为重要，在 Tm 值
允许的范围内，适当提高反应的退火温度可使 PCR
产物的特异性增强［27］。根据引物设计时设置的 Tm
值范围，共设计了 52℃、54℃、56℃、58℃、60℃
5 个退火温度，进行 PCR 分析。
实时荧光 PCR ：用 Beacon Designer 2.0 设计实
时荧光 PCR 引物和探针序列（表 1），并委托上海
生工生物技术公司合成。实时荧光 PCR 反应体系 ：
50 ng 基 因 组 DNA 1.0 μL，10×PCR buffer 2.0 μL，
25.0 mmol/L MgCl2 2.4 μL，10 mmol/L dNTPs 0.6 μL，
10 μmol/L primer 0.4 μL，10 μmol/L probe 0.2 μL，5
U/μL SH Taq DNA 聚合酶 0.16 μL，加 ddH2O 至总反
应体积为 20 μL。实时荧光 PCR 反应程序为 95℃、
3 min ；95℃、15 s，60℃、1 min，循环数 45 ；在第
二阶段的退火延伸（60 ℃）时段收集荧光信号。
表 1 引物及碱基组成
目标 引物名称 引物序列（5-3）
定性 PCR 检测 Barnase-F1 TGACGGGGTTGCGGATTATCT
Barnase-F2 AAATCAGAAGCACAAGCCCTC
Barnase-F3 ACGGGGTTGCGGATTATCT
Barnase-F4 GGTTGCGGATTATCTTCAG
Barnase-F5 GGGGTTGCGGATTATCTTC
Barnase-R1 TAAAGGTCTGATAATGGTCCG
Barnase-R2 TTTTGTAAATCAGCCAGTCGC
Barnase-R3 GGGAGTTTGCCTTCCCTGTTT
Barnase-R4 ATCAGCCAGTCGCTTGAGTAA
Barnase-R5 CCGTTGTTTTGTAAATCAGCC
qBarnase-F AATCAGAAGCACAAGCCCTCG
实时荧光 PCR 检测 qBarnase-F1 ATCAGAAGCACAAGCCCTCG
qBarnase-F2 CAAAATCAGAAGCACAAGCCCTC
qBarnase-R AGTTTGCCTTCCCTGTTTGAGAA
qBarnase-R1 GAGTTTGCCTTCCCTGTTTGAG
qBarnase-R2 GGAGTTTGCCTTCCCTGTTTG
qBarnase-P FAM-TGTCTCCGCCGATGCTTTTC-
CCCG-BHQ1
1.2.3 循环验证试验 邀请国内有资质的 8 家实验
室，采用本研究建立的普通 PCR 和实时荧光 PCR
方法对统一制备的样品进行检测 ：（1）阳性对照，
0.5% 转基因油菜 MS8 ；（2）阴性对照，非转基因油
菜中双 9 号 ；（3）特异性测试样品 ：1% 转基因油
菜 MS8，1% 转基因油菜 MS1，转基因混合样（转基
因油菜 GT73、T45、RF1，转基因水稻 TT51，转基
因大豆 GTS-40-3-2，转基因玉米 MON810 和转基因
棉花 MON1445 混合，每个转化体质量分数为 1%），
非转基因混合样（非转基因油菜、水稻、高粱、大
麦、黑麦、棉花、玉米、大豆，各 1 个品种等量混
合）；（4）普通 PCR 方法灵敏度测试样品，0.4% 转
基因油菜 MS8 ；（5）实时荧光 PCR 方法灵敏度测试
样品，0.05% 转基因油菜 MS8 ；（6）加工品测试样
品，用转基因油菜 MS8 与非转基因水稻、玉米、大
豆混合后制成 MS8 质量分数为 5% 的样品，在高压
灭菌锅中高温高压处理 10 min。
2 结果
2.1 检测靶标序列的确定
将 barnase 基因的编码序列（GenBank Accession
No. M14442.1） 在 NCBI 数 据 库 中 进 行 Blast 检 索，
发现该序列与数据库中登记的所有序列完全同源
（100% identity），但构建到载体上的序列均少了 5
端信号肽序列 ；分析转基因油菜 MS1、MS8 中的
barnase 基因序列发现，转基因油菜中 barnase 基因
序列同样在 5 端少了信号肽序列，但序列完全相同。
因此本研究确定将不包含 5 端信号肽序列的 336 bp
的序列作为 barnase 基因的检测靶标（图 1）。
2.2 Barnase基因普通PCR方法的建立
用 25 个 引 物 组 合， 以 转 基 因 油 菜 MS8 质 量
百分含量为 0.5% 的油菜基因组 DNA 为模板，对
barnase 基因进行 PCR 扩增，每个反应进行两次重复，
选择重现性好、特异性高、扩增条带最清晰的引物
组合。根据电泳结果（图 2），初步筛选出了 5 个引
物 组 合 ：Barnase-F4/R2、Barnase-F4/R3、Barnase-
F5/R2、Barnase-F5/R3、Barnase-F5/R5，扩增产物大
小均在 150-300 bp 之间。
为了进一步筛选出最佳引物组合，用非转基因
油菜的基因组 DNA 梯度稀释转基因油菜 MS8 的基
因组 DNA，稀释后的 MS8 基因组 DNA 的质量分数
分别为 10%、1%、0.5%、0.25% 和 0%。以梯度稀
释的基因组 DNA 作模板，用筛选出 5 个引物组合分
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第12期132
2.3 Barnase基因实时荧光PCR方法的建立
在 barnase 基因的靶标序列上设计探针 qBarnase-
P，然后在探针序列的两侧分别设计 3 条正向引物
和 3 条反向引物。将 3 条正向引物和 3 条反向引物
2 3 4 5 6 7 8 910 111213 1415 1617 181920 M 2122232425M
500
bp
250
1
2 3 4 5 6 7 8 910 111213 1415 1617 181920 M 2122232425M
500
bp
250
1
M ：DL2000 Marker（TaKaRa）；1 ：Barnase-F1/R1 ；2 ：Barnase-F1/R2 ；3 ：
Barnase-F1/R3 ；4 ：Barnase-F1/R4 ；5 ：Barnase-F1/R5 ；6 ：Barnase-F2/R1 ；7 ：
Barnase-F2/R2 ；8 ：Barnase-F2/R3 ；9 ：Barnase-F2/R4 ；10 ：Barnase-F2/R5 ；
11 ：Barnase-F3/R1 ；12 ：Barnase-F3/R2 ；13 ：Barnase-F3/R3 ；14 ：Barnase-
F3/R4 ；15 ：Barnase-F3/R5 ；16 ：BarnaseF4/R1 ；17 ：Barnase-F4/R2 ；18 ：
Barnase-F4/R3 ；19 ：Barnase-F4/R4 ；20 ：Barnase-F4/R5 ；21 ：Barnase-
F5/R1 ；22 ：Barnase-F5/R2 ；23 ：Barnase-F5/R3 ；24 ：Barnase-F5/R4 ；25 ：
Barnase-F5/R5 ；共有 25 个引物组合，每个引物组合设置 2 个平行
图 2 Barnase 基因引物初步筛选
500
bp
250
500
bp
250
2 3
A B C D E
A B C D E
4 5 M1 2 3 4 5 M1 2 3 4 5 M1 2 3 4 5 M1 2 3 4 5 M1
2 3 4 5 M1 2 3 4 5 M1 2 3 4 5 M1 2 3 4 5 M1 2 3 4 5 M1
利用梯度稀释的 MS8 基因组 DNA 做模板，测试 barnase 基因候选引物组合
的灵敏度，每个模板设置 2 个平行。1-5 分别对应质量分数为 10%、1%、0.5%、
0.25% 和 0% 的 MS8 基 因 组 DNA ；A-E 分 别 对 应 引 物 组 合 BarnaseF4/R2、
BarnaseF4/R3、BarnaseF5/R2、BarnaseF5/R3 和 BarnaseF5/R5
图 3 Barnase 基因候选引物组合灵敏度测试
500
bp
250
500
bp
250
2 3 4 5 876 M1
2 3 4 5 8 9 1076 M1
A
B
A ：Mg2+ 浓度的优化，M ：marker DL2000（TaKaRa））；1，2 ：1.5 mmol /L ；3，
4 ：1.6 mmol/L ；5，6 ：1.8 mmol/L ；7，8 ：2.00 mmol/L ；B ：退火温度的优化 ；
M ：marker DL2000（TaKaRa）；1，2 ：52℃ ；3，4 ：54℃ ；5，6 ：56℃ ；7，8 ：
58℃ ；9，10 ：60℃
图 4 Barnase 基因检测体系的优化
图 1 Barnase 基因定性 PCR 引物位置图，箭头代表最佳引物的设计位置和方向
别进行 PCR 扩增，设置两个平行，考察这 5 个引物
组合的扩增灵敏度。凝胶电泳结果（图 3）表明引
物组合 Barnase-F5/R5 的扩增灵敏度最高，重现性最
好，当 DNA 模板浓度低至 0.25% 时，依然有清晰的
扩增条带，扩增产物 277 bp ；而其他的引物组合的
扩增灵敏度只能达到 0.5% 或 1%，而且重现性较差。
为获得 Barnase-F/R 引物对最佳反应体系，分
别对 Mg2+ 浓度、退火温度进行比较优化。PCR 检测
结果表明引物组合 Barnase-F5/R5 在 4 个 Mg2+ 浓度
梯度下，均有良好的扩增，而且扩增结果没有差异
（图 4-A）。因此反应体系中采用终浓度为 1.8 mmol/L
Mg2+ 浓度。在 5 个退火温度下均能检测出 barnase 基
因，而且在不同的退火温度下，扩增结果没有显著
差异，因此选用 58℃退火。
2013年第12期 133李俊等 ：Barnase 基因定性 PCR 检测方法及其标准化
两两配对组合 9 对引物，分别与探针 qBarnase-P 组
合，以 0.5 ng 的 MS8 基因组 DNA 为模板，进行实
时荧光 PCR 扩增，每个反应设置两个平行。根据
扩增曲线，筛选出在相同条件下扩增信号最强的引
物探针组合。结果（图 5）显示，引物 / 探针组合
qBarnase-F/qBarnase-R/qBarnase-P 与其他组合相比，
扩增信号最强，且 重复性良好。因此将引物 / 探针
组 合 qBarnase-F/qBarnase-R/qBarnase-P 用 于 barnase
基因的实时荧光 PCR 检测。
2.4 Barnase基因检测方法的验证
2.4.1 普通 PCR 特异性检测 ：分别以转基因油菜
MS1，转基因油菜 MS8，转基因油菜混样（RT73、
RF1、RF3、OXY235，Topas，T45），5 大 非 转 基 因
作物混样（玉米、大豆、棉花、油菜和水稻），转基
因棉花混样（Mon531、Mon1445、Mon88913），转基
因 玉 米 混 样（Mon88077，Bt176、Mon863、GA21），
转 基 因 大 豆 混 样（Mon89788、A2704-12、GTS-40-
3-2）和转基因水稻混样（科丰 6 号和 TT51-1）共 8
份基因组 DNA 作为 PCR 扩增的模板，进行 PCR 扩增。
扩增结果（图 6）显示，转基因油菜 MS1 和 MS8 中
均扩增出单一清晰的条带，而其他 6 份混样均无扩
增，表明引物组合 Barnase-F5/R5 能从测试样品中特
异性的检测出 barnase 基因。
灵敏度检测 ：用非转基因油菜的基因组 DNA
梯度稀释转基因油菜 MS8 的基因组 DNA，梯度稀
释样品的质量分数依次为 10%、2%、1%、0. 5%、
0. 25% 和 0%。用梯度稀释的 DNA 进行 PCR 扩增，
结果（图 7）表明，在质量分数为 0.25% 以上的样
品中均能特异性地扩增到 barnase 基因的预期 DNA
片段。转化 barnase 基因的转基因植物由于纯合致死，
在繁殖过程中，必须用非转基因植株与其杂交才能
保留转基因的种子，因此收获的种子中转基因成分
的含量为 25%（1/4）。本研究中转基因油菜 MS8 中
barnase 基因的检出下限是 0.25%，相当于 0.05% 的
纯合体，符合定性 PCR 方法对检测灵敏度的要求
（0.1%）。将 barnase 基因普通 PCR 方法的相对检出
下限定为 4 g/kg（相当于 0.1% 的纯合体）。
10
9
8
7
6
5
R
FU
10^
3
4
3
2
1
0
0 10 20 30
Cycles
40 50
Barnase-F/R/P
图 5 Barnase 基因实时荧光定量 PCR 方法引物 / 探针组合
筛选
加工品检测 ：将 MS1 油菜籽与大豆、玉米和水
稻混合，油菜籽的质量百分比分别为 1% 和 2%。将
混好的样品放在高压灭菌锅中在 121℃、0.2 MPa 下
灭菌 25 min，以模拟加工品的加工过程。然后将高
温高压处理过的样品进行研磨并提取基因组 DNA。
以 提 取 的 基 因 组 DNA 做 模 板， 用 普 通 PCR 引 物
进行 PCR 扩增，每个样品设 4 个平行。扩增结果
（图 8）显示，2% 的样品有 3 个平行反应有扩增，
1% 的样品 4 个平行反应均有扩增。表明引物组合
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
500
250
M ：marker DL2000（TaKaRa）；1，2 ：MS1 ；3，4 ：MS8 ；5，6 ：转 基 因 油
菜混样（RT73、RF1、RF3、OXY235，Topas，T45）；7，8 ：5 大作物非转
基因作物混样（玉米、大豆、棉花、油菜和水稻）；9，10 ：转基因棉花混
样（Mon531、Mon1445、Mon88913）；11，12 ：转基因玉米混样（Mon88077，
Bt176、Mon863、GA21）；13，14 ：转 基 因 大 豆 混 样（Mon89788、A2704-
12、GTS-40-3-2）；15，16 ：转基因水稻混样（科丰 6 号和 TT51-1）
图 6 Barnase 基因普通 PCR 检测方法特异性检测
500
250
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 1516 17 18 19 20 21 2223 24
每个模板设 4 次平行。M ：marker DL2000（TaKaRa）；1-4 ：MS8 质量分数
为 10% ；5-8 ：MS8 质量分数为 2% ；9-12 ：MS8 质量分数为 1% ；13-16 ：
MS8 质量分数为 0.5% ；17-20 ：MS8 质量分数为 0. 25% ；21-24 ：MS8 质量
分数为 0%
图 7 Barnase 基因普通 PCR 检测方法灵敏度检测
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第12期134
灵敏度检测 ：用超纯水梯度稀释转基因油菜
MS8 的基因组 DNA，浓度依次为 5、0.5、0.05、0.025
和 0 ng。用梯度稀释的基因组 DNA 作模板进行实时
荧光 PCR 扩增，每个反应设置 3 个平行。结果（图
10）表明，在 MS8 基因组 DNA 模板浓度为 0.025 ng
加工品检测 ：用实时荧光 PCR 方法扩增高温高
压处理样品的基因组 DNA，这两份样品中 MS1 基
因组 DNA 的质量百分比分别为 1% 和 2%，每个反
应设置 4 个平行。扩增结果（图 11）显示，两个
样品均有 barnase 基因的扩增曲线。表明实时荧光
PCR 引物探针组合能够稳定的检测深加工产品中的
barnase 基因。
500
250
M 1 2 3 4 5 6 7 8
M ：marker DL2000（TaKaRa）；1-4 ：2% MS1 加工品的 4 个平行 ；5-8 ：1%
MS1 加工品的 4 个平行 .
图 8 Barnase 基因普通 PCR 检测方法加工品测试
及以上的样品中均有明显的扩增曲线，表明该检测
方法的检测灵敏度达到 0.25 g/kg，符合定性 PCR 方
法对检测灵敏度的要求（0.1%）。根据检测结果，将
barnase 基因实时荧光 PCR 方法的相对检测下限定为
0.5 g/kg。
5000
4000
3000
2000R
FU
1000
0
0 10 20
MS8
MS1
30
Cycles
40 50
图 9 Barnase 基因实时荧光 PCR 检测方法特异性检测
5000
4000
3000
2000
R
FU
1000
0
0 10 20
5 ng
0.5 ng
0.05 ng
0.025 ng
30
Cycles
40 50
图 10 Barnase 基因实时荧光 PCR 检测方法灵敏度检测
2.5 Barnase基因检测方法循环验证
普通 PCR 方法 ：在特异性检测中，8 家验证单
位只从油菜样品 MS1、MS8 中检测出预期 DNA 片段，
其他样品中未检测出预期 DNA 片段，表明本研究建
立的 barnase 基因普通 PCR 检测方法具有良好的扩
增特异性 ；灵敏度检测中，8 家单位在 0.4% 的转基
因油菜 MS8 样品中均能检测出预期 DNA 片段，表
明 barnase 基因的普通 PCR 检测方法符合灵敏度要
求 ；加工品测试中，6 家验证单位在 MS8 油菜加工
4000
3000
2000R
FU
1000
0
0 10 20
2%
1%
30
Cycles
40 50
图 11 Barnase 基因普通 PCR 检测方法加工品测试
BarnaseF/R 能够稳定地检测深加工产品中的 barnase
基因。
2.4.2 实时荧光 PCR 特异性检测 ：用引物 / 探针
组 合 qBarnase-F/qBarnase-R/qBarnase-P 扩 增 转 基 因
油菜 MS1，转基因油菜 MS8，转基因油菜混样（RT73、
Rf1、Rf3、OXY235，Topas，T45），5 大作物混样（玉米、
大豆、棉花、油菜和水稻），转基因棉花混样（Mon531、
Mon1445、Mon88913），转基因玉米混样（Mon88077，
Bt176、Mon863、GA21），转基因大豆混样（Mon89788、
A2704-12、GTS-40-3-2）和转基因水稻混样（科丰 6
号和 TT51-1）共 8 份样品的基因组 DNA，每个样品
设置 3 个平行。扩增结果（图 9）显示，转基因油
菜 MS1 和 MS8 的 3 个平行 PCR 反应均有明显的扩
增曲线，而其他 6 份混样均无扩增曲线，表明实时
荧光 PCR 反应的引物 / 探针组合能特异性的检测出
barnase 基因。
2013年第12期 135李俊等 ：Barnase 基因定性 PCR 检测方法及其标准化
品中检出预期 DNA 片段，两家单位在 MS8 油菜加
工品中未检出预期 DNA 片段，表明 barnase 基因的
普通 PCR 检测方法适用于油菜加工品的测试。
实时荧光 PCR 方法 ：特异性检测中，8 家验证
单位在检测特异性测试样品时，只在油菜样品 MS1
和 MS8 中有明显的扩增曲线，且 Ct 值小于 40，其
它样品中没有明显的扩增曲线，表明 barnase 基因的
实时荧光 PCR 检测方法具有很高的特异性 ；灵敏度
检测中，8 家单位在 0.05% 及以上含量的转基因油
菜 MS8 样品中均有明显的扩增曲线，且 Ct 值小于
40，表明 barnase 基因的实时荧光 PCR 检测方法的
灵敏度符合要求 ；加工品测试中，8 家单位在 MS8
油菜加工品中均有明显的扩增信号，表明 barnase
基 因 的 实 时 荧 光 PCR 检 测 方 法 可 用 于 加 工 品 的
检测。
8 家验证单位的特异性检测结果和灵敏度测试
结果非常吻合，表明研制的 barnase 基因定性 PCR
检测方法具有良好的重复性和重现性，而且适用于
加工品的检测。
3 讨论
转基因生物安全监管工作中，通常以常用的调
控元件和目的基因作为筛查检测的靶标，筛查检测
能够大大提高检测效率。基因特异性 PCR 检测以插
入外源基因的特异性 DNA 片段作为目的检测片段，
目前已建立了多种外源目的基因的特异性 PCR 检测
方法，如 bar、PAT 和 CP4-EPSPS 等基因［28］。前期，
曾有 barnase 基因定性 PCR 检测方法和定量 PCR 检
测方法的报道［25，26］，但先前建立的 barnase 基因
PCR 检测方法未对其检测特异性、灵敏度、重复性
等参数进行系统考察。
本研究展现了研制 barnase 基因检测标准的完
整过程。首先以缺少 5 端信号肽序列的 336 bp 的
barnase 基因序列为检测靶标，设计不同正向引物和
反向引物，将正、反向引物两两组合进行 PCR 扩
增， 筛 选 出 最 佳 引 物 组 合 BarnaseF/BarnaseR ；然
后优化了最佳引物的 PCR 反应条件如 Mg2+、退火
温度，最终确定了最佳引物对、最适反应体系及反
应条件。然后，采用优化的反应条件，对引物对
BarnaseF/BarnaseR 的扩增特异性、灵敏度和重复性、
适用性进行了分析，分析结果满足标准方法的要求，
从而初步建立了 barnase 基因普通 PCR 检测方法。
此外本研究还建立了 barnase 基因的实时荧光 PCR
方法，进行特异性、灵敏度、加工品检测测试，测
试结果符合标准方法的要求。最后，邀请 8 家国内
具有资质的实验室对本研究建立的方法进行循环验
证，循环验证结果表明，本研究建立的 barnase 基因
普通、实时荧光 PCR 检测方法特异性强、灵敏度高、
重复性好，具有合理性、准确性、可操作性的优点，
因此本研究建立的定性、定量 PCR 方法可以作为检
测转 Barnase 基因的标准方法。在基因工程育种中，
雄性不育 barnase 基因通常与育性恢复基因 Barstar
配对使用，建议在实际检测中将 barnase 基因检测方
法与 barstar 基因检测方法组合采用。
4 结论
通过引物组合筛选、PCR 反应条件和反应体系
优化、特异性分析、灵敏度测试、加工品检测等实
验，建立了 barnase 基因定性 PCR 检测方法。该检
测方法特异性强、灵敏度高、重复性好，具有合理性、
准确性等优点，可以作为检测 barnase 基因的标准方
法，为监测转 barnase 基因作物服务。
致谢 ：
农业部科技发展中心基因检定处组织了本方法
的循环验证，农业部转基因植物环境安全监督检验
测试中心（上海市农业科学院）、农业部转基因生物
产品成分监督检验测试中心（天津市农业科学院）、
农业部转基因生物生态环境安全监督检验测试中心
（农业部环境保护科研监测所）、 农业部转基因植物
环境安全监督检验测试中心（中国农业科学院植物
保护研究所）、农业部转基因植物用微生物环境安全
监督检验测试中心（中国农业科学院生物技术研究
所）、农业部农产品及转基因产品质量安全监督检验
测试中心（浙江省农业科学院）、农业部转基因动物
及饲料安全监督检验测试中心（中国农业科学院北
京畜牧兽医研究所）、农业部转基因植物环境安全
监督检验测试中心（吉林省农业科学院）共 8 家第
三方检测机构参加了本方法的循环验证试验，特此
致谢。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第12期136
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（责任编辑 李楠）