全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第3期
收稿日期 : 2011-08-15
作者简介 : 田颖新 , 女 , 硕士研究生 , 研究方向 : 肺炎衣原体 ; E-mail: yingxin0519@yeah.net
通讯作者 : 贾天军 , 男 , 博士 , 研究方向 : 肺炎衣原体与天然免疫 ; E-mail: jiatianjun@yahoo.com
HeLa细胞 cDNA文库及酵母双杂交诱饵载体
pGBKT7-CPn0308的构建
田颖新 王春苗 刘雪晴 贾晓晖 贾天军
（河北北方学院 病原生物学实验室，张家口 075000）
摘 要： 旨在利用酵母双杂交系统构建 HeLa细胞的 cDNA文库，并构建酵母双杂交诱饵载体 pGBKT7-CPn0308。从 HeLa细
胞中提取总 RNA，应用 SMARTTM技术，构建以 pGADT7-Rec为载体的 HeLa细胞酵母 GAL4 AD融合 cDNA文库。应用 PCR技术
扩增目的片段 CPn0308，并成功克隆该基因到诱饵载体 pGBKT7中，将重组质粒转化酵母菌株 AH109后，检测诱饵载体有无自激
活和细胞毒性作用。结果显示，文库展现良好的多态性，重组诱饵载体 pGBKT7-CPn0308不具有毒性且未自主激活报告基因，说
明该文库和诱饵质粒可用于酵母双杂交系统。
关键词： HeLa细胞 cDNA文库 pGBKT7-CPn0308 酵母双杂交 自激活
Construction of cDNA Library for HeLa Cells and A Bait Vector of
pGBKT7-CPn0308 in Yeast Two-hybrid System
Tian Yingxin Wang Chunmiao Liu Xueqing Jia Xiaohui Jia Tianjun
（Pathogenic Biology Laboratory，Hebei North University，Zhangjiakou 075000）
Abstract: It was to construct a yeast GAL4 fusion cDNA library for HeLa cells by yeast two-hybrid system and construct yeast two-
hybrid system bait vector of pGBKT7-CPn0308. A yeast GAL4 fusion cDNA library from HeLa cells was constructed. Total RNA of HeLa cells
was purified by using Trizol reagents, and the cDNAs of the mRNAs contained in the purified total RNA sample were synthesized by SMARTTM
technology, which were subsequently cloned into the plasmid pGADT7-Rec. CPn0308 gene was amplified by polymerase chain reaction（PCR）,
and successfully cloned into yeast two hybrid bait vector pGBKT7. These recombinant plasmids were transformed into yeast cells AH109, and
then self-activation and toxic action of the bait vector pGBKT7-CPn0308 were tested. Result showed the library show satisfactory polymorphism.
The pGBKT7-CPn0308 bait vector was identified that neither had the ability of self-activation nor yeast cell toxicity. Therefore, the constructed
library and pGBKT7-CPn0308 could be used in yeast two-hybrid system.
Key words: HeLa cells cDNA library pGBKT7-CPn0308 Yeast two-hybrid Self-activation
肺炎衣原体（chlamydia pneumoniae，CPn）是一
类革兰氏染色阴性、具有严格的活细胞内生长特性的
微生物。肺炎衣原体已被确定是呼吸道疾病的常见
病原体，并与动脉粥样硬化［1］、老年痴呆症［2］、淋
巴肉芽肿［3］、关节炎［4］和急性冠脉综合征［5］等有关。
包涵体是衣原体赖以生存和繁殖的微环境，衣原体
致病的关键特性之一是其具有阻止包涵体与宿主细
胞的溶酶体融合的能力［6, 7］，从而避免宿主细胞对
衣原体相关抗原的内源性途径的提呈而得以生存，
对包涵体膜蛋白进行深入研究有助于解释衣原体的
生理发育和致病机制，因而引起学者的极大关注。
1989 年 Fields 等［8］发明的酵母双杂交系统，
是一种直接在真核细胞内检测蛋白相互作用的方
法，在这套系统中，不仅能够确认蛋白的相互作
用，而且还能对得到的相互作用蛋白进行刻画。本
研究从 HeLa 细胞中提取总的 RNA，应用 SMARTTM
技术，构建以 pGADT7-Rec 为载体的 HeLa 细胞酵
母 Y187 的 cDNA 文库，以肺炎衣原体包涵体膜蛋
2012年第3期 149田颖新等 ：HeLa 细胞 cDNA 文库及酵母双杂交诱饵载体 pGBKT7-CPn0308 的构建
白 CPn0308 为诱饵基因，构建诱饵载体 pGBKT7-
CPn0308，并成功地转化酵母获得表达，旨在为利用
酵母双杂交技术寻找与 CPn0308 相作用的蛋白打下
基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 主要材料 HeLa 细胞、大肠杆菌 DH5α 为本
实验室保存 ；质粒 pGADT7-Rec、pGBKT7、酵母菌
株 AH109、Y187，酵母各种培养基及反转录引物和
酶购买于 Clontech 公司 ；质粒 pGBKT7 由华中师范
大学黎路林教授馈赠。
1.1.2 主要试剂 Trizol 试剂购自 Invitrogen 公司，限
制性内切酶 BamH Ⅰ（50 U/μL）、EcoR Ⅰ（50 U/μL），
T4 DNA 连接酶，dNTP（10 mmol/L），Taq DNA 聚合
酶为TaKaRa公司产品，DNA Marker购于碧云天公司。
文库多态性检测引物，CPn0308 扩增引物均由 Invitro-
gen 公司合成，序列如下 ：文库检测 5 Primer ：
5-TAATACGACTCACTATAGG-3；文库检测 3 Prim-
er：5-AGATGGTGCACGATGCACAG-3；CPn0308-P1：
5-TCCGAATTCATGGCTACAGTAGCACAAAC-3保护
性碱基 +EcoRⅠ+ 引物序列 ；CPn0308-P2 ：5-GCGG
GATCCTTATTTAGAGGAGTAACGAT-3保护性碱基+
BamHⅠ+ 引物序列。
1.2 方法
1.2.1 总RNA的纯化 取一瓶生长状态良好的HeLa
细胞，用 PBS 缓冲液漂洗细胞单层一次 ；在弃去缓
冲液后向培养瓶中加入 1 mL Trizol 试剂，5 min 后收
集细胞裂解液于 1.5 mL 的 EP 管中；加 200 μL 氯仿，
用力振荡，冰上放置 10 min，4℃，12 000 r/min 离心
15 min 后将上清移入新的 EP 管 ；加入 500 μL 异丙
醇，上下颠倒混匀后，-20℃放置 30 min；取出后 4℃，
12 000 r/min 离心 10 min，弃上清 ；加入 75% 的乙
醇洗涤 RNA，将乙醇倒掉，室温干燥，加 20 μL
的 DEPC 水溶解，取 7 μL 进行琼脂糖凝胶电泳。
1.2.2 cDNA 文库的构建
1.2.2.1 cDNA 第一链的合成 取 HeLa 细胞总 RNA
2 μL（约 2 μg），CDS Ⅲ引物（10 μmol/L）1 μL，灭
菌的三蒸水 1 μL 与 DEPC 处理的 PCR 管中，混匀
后 72℃温育 2 min 后迅速转置冰上冷却 2 min，然
后加入以下组分并混匀 ：5× 第一链缓冲液 2 μL，
DTT（100 mmol/L）1 μL，dNTP（10 mmol/L）1 μL，
MMLV 反转录酶 1 μL。将上述混合物置 42℃温育
10 min 后加入 SMART Ⅲ Oligo 1 μL，42℃温育 1 h，
然后 75℃温育 10 min 终止反应。取出后在反应混合
物中加入 1 μL RNaseH（2 U），37℃放置 20 min 以
降解 RNA。
1.2.2.2 LD-PCR合成双链cDNA 取cDNA第一链合
成产物 2 μL，依次加入以下组分 ：10 μL 10×Advan-
tage 2 PCR Buffer，2 μL 50×dNTP Mix，2 μL 5 PCR
Primer，2 μL 3PCR Primer，10 μL 10×Melting Solu-
tion，2 μL 50×Advangtage 2 Polymerase Mix 和 70 μL
Deionized H2O 混匀后按下列程序运行 ：95℃预变
性 30 s ；95℃变性 10 s，68℃延伸 6 min，以后每个
循环增加 5 s、共 20 个循环 ；最后 68℃延伸 5 min。
取 5 μL PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳检测双链合
成情况。采用 CHROMA SPINTM+TE-400 柱纯化双链
cDNA，去除 200 bp 以下的片段。
1.2.2.3 酵母双杂交 cDNA 文库的构建及多态性检
测 Y187 酵母感受态的制备 ：取冻存甘油菌接种于
YPDA 琼脂平板上，30℃倒置培养，挑取单个菌落（直
径 2-3 mm）接种于装有 3 mL YPDA 液体培养基的无
菌试管中，然后 30℃振荡培养 8 h。取 8 μL 培养物
接种于 50 mL 的 YPDA 液体培养基中，30℃振荡孵
育 16 h，至 OD600 达到了 0.19 时，室温 700×g 离心
5 min，弃上清 ；将沉淀重新悬浮于 100 mL YPDA，
30℃孵育 3.5 h（OD600 为 0.486），在室温下 700×g
离心 5 min，弃上清 ；将沉淀重新悬浮于 60 mL
灭菌的去离子水中，700×g 离心 5 min，弃上清 ；
将沉淀重新悬浮于 3 mL 1.1×TE/LiAc 溶液，分装在
两个 1.5 mL 离心管，14 000 r/min 离心 15 s，弃上清；
将沉淀重新悬浮于 600 μL 1.1×TE/LiAc 溶液。
同源重组及转化 ：将以下组分加入 50 mL 灭
菌 离 心 管 中 ：20 μL dscDNA、10 μL pGADT7-Rec
（0.5 μg/μL）、20 μL Herring Tests Carrier DNA（已变
性）、600 μL 酵母 Y187 感受态细胞，2.5 mL PEG/
LiAc 溶液，轻轻混匀 ；30℃孵育 45 min 后加入
160 μL DMSO，42℃水浴 20 min，离心弃上清 ；用
3 mL YPD Plus Liquid medium 溶液重悬沉淀，30℃、
240 r/min 振荡孵育 90 min ；700×g 离心 5 min，弃
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第3期150
上清 ；加 7.5 mL 0.9% NaCl 溶液重新悬浮沉淀，取
15 μL 按 1 10、1 100、1 1 000、1 10 000 稀 释，
各取 100 μL 稀释液分别涂布于 120 mm SD/-Leu/
Amp+ 平板，30℃倒置培养。 剩余菌液涂布在 40 个
直径为 120 mm 的 SD/-Leu/Amp+ 选择平板上，30℃
倒置培养 4 d，用冷冻培养基收集阳性菌落，分装后
于 -80℃冰箱保存。
文库滴度及 cDNA 多态性的测定 ：将收集的菌
液分别按 1 100、1 1 000、1 10 000、1 100 000 稀释，
在 SD/-Leu 平板上培养 3 d，计算该文库的滴度。
文库 cDNA 多态性分析 ：从 SD/-Leu/Amp+ 平板
上随机挑取 20 个单菌落，进行菌落 PCR，检测文库
的多态性。
1.2.3 克隆诱饵载体 pGBKT7-CPn0308
1.2.3.1 目的基因 CPn0308 的扩增 根据 GenBank
公布的肺炎衣原体 AR39 株 CPn0308 核苷酸序列
设计引物，分别在上游引物和下游引物 5端加入
EcoRⅠ、BamHⅠ酶切位点和酶切保护碱基。
PCR 扩增体系（100 μL）：10×PCR Buffer 10 μL，
dNTP（10 mmol/L）2.5 μL，CPn0308-P1（20 pmol/μL）
1.5 μL，CPn0308-P2（20 pmol/μL）1.5 μL，Taq聚合酶
（5 U/μL）1 μL，CPn 基因组 4 μL，灭菌的三蒸水
79.5 μL，扩增程序为 ：94℃预变性 5 min ；95℃变性
45 s，55℃退火 1 min，72℃延伸 1 min，进行 30 个
循环；72℃继续延伸 10 min，4℃保存扩增产物。1%
琼脂糖电泳鉴定酚 - 氯仿纯化后的 PCR 产物。
1.2.3.2 pGBKT7-CPn0308 质粒的构建及鉴定 取
纯化后的 PCR 产物和质粒 pGBKT7，分别加入
EcoRⅠ、BamHⅠ进行双酶切，再与经同样双酶切
处理的 pGBKT7 连接，构成 pGBKT7-CPn0308。在
含 Kan 的 LB 平板上筛选阳性克隆，并送往上海桑
尼科技有限公司进行序列测序。
1.2.4 酵母细胞的转化及鉴定
1.2.4.1 转化及鉴定 制备 AH109 和 Y187 的酵母
感受态细胞，然后在一个预冷的 EP 管里加入以下
组分 ：pGBKT7-CPn0308 0.5 μL（0.5 μg），预先变性
的 Herring DNA 5 μL，酵母感受态细胞 50 μL，PEG/
LiAc 0.5 mL ；30℃孵育 30 min，每 10 min 振荡 1 次，
加入 20 μL DMSO，42℃孵育 15 min ；高速离心 15
s，弃上清 ；加入 1 mL YPDA plus Liquid Medium 振
荡孵育 90 min，高速离心 15 s，弃上清用 1 mL 0.9%
NaCl 重悬菌体，取 100 μL 涂布于 SD/-Trp（Kan+）
平板上，30℃培养 2-4 d。挑取直径 >2 mm 的菌落，
应用 CPn0308 特异性引物做菌落 PCR 验证转染是否
成功。
1.2.4.2 重组质粒 pGBKT7-CPn0308 自激活及细胞
毒性的检测 按上述方法将 pGBKT7 和 pGBKT7-
CPn0308 转化到酵母菌株 AH109 和 Y187 中，涂布
在 SD/-Trp/X-Gal、SD/-His/-Trp/X-Gal 和 SD/-Ade/-
Trp/X-Gal 平板上，30℃倒置培养 4 d，观察生长情况。
然后挑取 SD/-Trp/X-Gal 平板上的 pGBKT7-CPn0308
转化的酵母 AH109 和 Y187，分别振荡培养 16-24 h
后测 OD 值，检测诱饵基因对酵母细胞有无细胞毒
性作用。
2 结果
2.1 HeLa 细胞 cDNA 文库的构建
用Trizol试剂提取HeLa细胞的总RNA，经0.1%
琼脂糖凝胶电泳，可见 28S 与 18S 条带清晰，比例
为 2 1（图 1），经紫外分光光度仪测定，A260/A280
介于 1.8-2.0 之间，说明提取的 RNA 质量良好，符
合构建文库要求。
1. HeLa 细胞总 RNA ；M. DL2000 Marker
图 1 HeLa细胞总 RNA
采用 SMART 技术反转录合成 cDNA，并进行电
泳结果（图 2）分析，合成的 dscDNA 条带丰富、密
集，其大小主要分布在 0.1-5 kb，较为完整。
2.2 HeLa 细胞 cDNA 文库的检测
将合成的 cDNA 经 CHROMA SPIN TE-400 柱纯
化除去 200 bp 以下的小片段，然后与 pGADT7-Rec
2012年第3期 151田颖新等 ：HeLa 细胞 cDNA 文库及酵母双杂交诱饵载体 pGBKT7-CPn0308 的构建
载体共转染到 Y187 中进行基因重组，测定转化效
率为 3.9×106，文库的滴度为 3.23×109，随机挑取
20 个单个菌落做 PCR，以鉴定 cDNA 插入片段大小，
经琼脂糖凝胶电泳结果（图 3）显示，PCR 产物大
小在 0.3-3 kb 之间，显示文库具有良好的多态性。
M1. DL22000 Marker ；1. 合成 dscDNA ；M2. DL2000 Marker
图 2 dscDNA电泳图
M. DL22000 Marker，从上到下依次为 22 000、10 000、8 000、6 000、
5 000、4 000、3 000、2 000、1 500、1 000、500 bp;1-20. PCR 结果
图 3 菌落 PCR鉴定文库多态性
2.3 重组质粒pGBKT7-CPn0308的构建及检测
2.3.1 目的片段 CPn0308 的扩增 PCR 扩增目的片
段，经 1% 的琼脂糖凝胶电泳检测，目的片段大小
为 366 bp，加上引物两端的酶切位点和保护性碱基
共为 384 bp，如图 4 所示，扩增片段为 384 bp 左右，
与目的带一致。
2.3.2 诱饵载体的构建及鉴定 纯化双酶切的目
的片段 CPn0308，克隆到诱饵载体 pGBKT7 中，转
化大肠杆菌，做菌落 PCR 和双酶切进行鉴定（图
5）。条带大小在 384 bp 左右，利用 pGBKT7 载体
上的 T7 引物作为测序引物对其进行鉴定，测序结
果经 BLAST 分析证实为 CPn0308，表明诱饵质粒
1, 2. CPn0308 PCR 扩增条带 ；M. DL2000 Marker
图 4 PCR扩增 CPn0308
1, 2. 菌落 PCR ；M.DL2000 Marker ；3. 重组质粒经
EcoRⅠ和 BamHⅠ双酶切后产物
图 5 诱饵质粒 pGBKT7-CPn0308的鉴定
pGBKT7-CPn0308 构建成功。
2.3.3 重组质粒对酵母细胞的毒性与自激活检
测 pGBKT7 与 pGBKT7-CPn0308 转化的 AH109 和
Y187 后所涂平板中，SD/-Trp/X-Gal 上有白色菌落长
出， 在 SD/-His/-Trp/X-Gal 和 SD/-Ade/-Trp/X-Gal 无
菌落，表明诱饵质粒无自激活作用。分别挑取 SD/-
Trp/X-Gal 平板上生长的被 pGBKT7-CPn0308 转化的
AH109 菌落和 Y187 菌落，接种到 SD/-Trp/Kan 液体
培养基中，振荡培养 20 h 后取样测定 OD600。AH109
菌液 OD600 为 0.915，Y187 菌液 OD600 为 0.873，均
大 于 0.8， 按 照 MatchmakerTM library Construction &
Screening说明书所述，如果菌液振荡培养16-24 h后，
OD600 大于或等于 0.8，则诱饵基因对酵母细胞无毒
性作用。说明构建成功的 pGBKT7-CPn0308 能够适
用于酵母双杂交系统进行的相互作用蛋白筛选。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第3期152
3 讨论
衣原体感染宿主细胞形成的包涵体是其赖以生
存和繁殖的微环境，一方面衣原体在包涵体内复制，
另一方面通过包涵体从宿主细胞摄取营养和代谢的
中间产物，并分泌一些效应分子抑制宿主细胞攻击，
从而为衣原体的生存提供有利的微环境［9, 10］，所以
包涵体膜蛋白与衣原体的感染、衣原体的生长发育都
发挥着重要的作用。根据已经鉴定的膜蛋白的疏水
性特征，计算机辅助程序预测出 90 个 CPn 基因编码
的蛋白为包涵体膜蛋白，CPn0308 是预测出的一种
编码包涵体膜蛋白基因，且有试验证明该蛋白确实
位于包涵体上［11］，但对于其具体的生物学作用及在
CPn 感染中扮演怎样的角色，以及如何与人体细胞
相互作用还不清楚。因此，研究 CPn0308 与宿主细
胞相互作用可能结合的蛋白对研究包涵体膜蛋白的
生物学功能，肺炎衣原体感染的分子机制奠定基础。
酵母双杂交系统是建立在细胞内从基因水平研
究蛋白质间相互作用的遗传学方法，在某种程度上
反映蛋白在生理条件下的活性状态是其他体外试验
不可比拟的，因此本试验成功构建以 pGADT7-Rec
为载体的 HeLa 细胞酵母 Y187 的 cDNA 文库，多
态性鉴定良好，符合文库建立要求。进一步构建诱
饵载体 pGBKT7-CPn0308，进行双酶切及测序验证。
将诱饵质粒转化到酵母菌中，为筛除假阳性。另外，
由于某些蛋白质在酵母菌株内表达时可能对酵母产
生一定的毒性作用，使酵母细胞不能在选择性培养
基上生长，或本身就有结合转录激活活性的蛋白质
会直接激活报告基因的表达［12］。因此我们将诱饵载
体转化到 AH109 中后，分别涂布于 SD/-Trp/X-Gal、
SD/-His/-Trp/X-Gal和SD/-Ade/-Trp/X-Gal，直接观察诱
饵蛋白对下游的基因有无自激活作用，从而排除
假阳性，在平板上无蓝色菌落长出，表明诱饵质
粒没有自激活作用。同时转化的酵母菌株能在 SD-
Trp/Kan 液体培养基中大量增殖，表明表达的诱饵蛋
白对酵母生长无毒性作用。本研究为用酵母双杂交
技术筛选与 CPn0308 蛋白相互作用的蛋白，探讨肺
炎体原体的致病机制奠定了基础。
4 结论
HeLa 细胞中提取总的 RNA，应用 SMARTTM 技
术，构建以 pGADT7-Rec 为载体的 HeLa 细胞系酵母
GAL4 AD 融合的 cDNA 文库，显示多态性良好、完整、
有效。以肺炎衣原体包涵体膜蛋白 CPn0308 为诱饵
基因，构建诱饵载体 pGBKT7-CPn0308，成功转化
酵母获得表达。
参 考 文 献
［1］ Shor A. Chlamydia atherosclerosis lesion, discovery, diagnosis and
treatment ［M］ . London: Springer-Verlag, 2007.
［2］ Stallings TL. Association of Alzheimers disease and Chlamydophila
pneumoniae. J Infect, 2008, 56（6）: 423-31.
［3］ Shen D, Yuen HK, Galita DA, et al. Detection of Chlamydia
pneumoniae in a bilateral orbital mucosa-associated lymphoid tissue
lymphoma. Am J Ophthalmol, 2006, 141（6）: 1162-3.
［4］ Carter JD, Gérard HC, Espinoza LR, et al. Chlamydiae as etiologic
agents in chronic undifferentiated spondylarthritis. Arthritis Rheum,
2009, 60（5）: 1311-6.
［5］ Petyaev IM, Zigangirova NA, Petyaev AM, et al. Isolation of
Chlamydia pneumoniae from serum samples of the patients with
acute coronary syndrome. Int J Med Sci, 2010, 7（4）: 181-190.
［6］ Vandahl B, Birkelund S, Christiansen G. Genome and proteome
analysis of Chlamydia. Proteomics, 2004, 4（10）: 2831-2842.
［7］ Krull M, Maass M, Suttorp N, Rupp J. Chlamydophila pneumoniae.
Mechanisms of target cell infection and activation. Thromb Haemost,
2005, 94（2）: 31923-26.
［8］ 段强德 , 陈铁桥 . 酵母双杂交体系的原理及研究进展 . 畜牧兽
医杂志 , 2009, 28（1）: 56-58.
［9］ Fields KA, Hackstadt T. The chlamydial inclusion: escape from the
endocytic pathway. Annu Rev Cell Dev Biol, 2002, 18: 221-245.
［10］ Rockey DD, Scidmore MA, Bannantine JP, et al. Protein in
chlamydial inclusion membrane. Microbes Infection, 2002, 4（3）:
333-340.
［11］ 贾天军 , 刘殿武 , 钟光明 , 等 . 肺炎衣原体 CPn0308 的基因
克隆及其内源性蛋白定位的研究 . 卫生研究 , 2008, 37（2）:
219-222.
［12］ 周丽娜 , 吴军 , 罗高兴 , 等 . Foxp3 酵母双杂交诱饵表达载体
的构建、鉴定和其毒性及自激活效应检测 . 第三军医大学学
报 , 2006, 28（8）: 781-784.
（责任编辑 马鑫）