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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第9期
河 鲈（Perca fluviatilis）， 俗 称 五 道 黑。 鱼 类
分 类 中 隶 属 于 硬 骨 鱼 纲（Osteichthyes）、 鲈 形 目
（Perciforms）、鲈亚目（Percoidei）、鲈科（Percidae）、
鲈属（Perca），广泛分布于欧洲和西伯利亚地区，
在我国仅分布于新疆北部的额尔齐斯河流域和乌龙
古河流域［1-3］。20 世纪 60 年代引入博斯腾湖，现也
有少量的分布。因生态环境破坏、长期过度捕捞等
人类活动的影响，河鲈天然群体逐步衰竭，加之养
殖业滞后，河鲈个体日益小型化、性成熟变早［4］。
河鲈是淡水鱼类中的珍品，是当地优质经济鱼类。
目前，国内外有关河鲈的研究相对较少，仅见于对
河鲈可量性状、生态习性、人工繁殖、胚胎发育等
收稿日期 ： 2013-04-22
基金项目 ：石河子大学动植物育种专项（gxjs2011-yz01）
作者简介 ：董艳艳，女，硕士研究生，研究方向 ：遗传学 ；E-mail ：dongyanyan1989@126.om
通讯作者 ：胡文革，博士，副教授，研究方向 ：鱼类遗传学 ；E-mail ：hwg-@163.com
河鲈 RAPD-PCR 反应体系的建立与优化及引物筛选
董艳艳 胡文革 路李鹏 陈登稳 杨迪 王艳萍 韩晶
（石河子大学生命科学学院，石河子 832003）
摘 要 ： 以河鲈为研究材料，对河鲈 RAPD-PCR 的反应体系进行优化和适用引物的筛选，采用正交设计方法，选用 L17（5
4）
正交表，以河鲈基因组 DNA 为模板，对影响 PCR 反应较大的 4 个因素 ：Taq 酶、Mg2+、dNTPs、引物在 5 个水平上进行优化试验，
得到河鲈最优 RAPD-PCR 反应体系 ：25 μL 反应体系中含有 30 ng DNA 模板 1.5 μL，10 μmol/L 引物 0.7 μL，10×buffer 2.5 μL，25
μmol/L dNTPs 0.4 μL，5 U Taq 酶 0.2 μL，2.5 mmol/L MgCl2 3.0 μL ；利用优化体系从 50 条引物中筛选得到 10 条适用引物，并确定了
引物的最佳退火温度。
关键词 ： 河鲈 RAPD-PCR 条件优化 适用引物 退火温度
Establishment and Optimization of RAPD-PCR Reaction System and
Primers Screening from Perca fluviatilis
Dong Yanyan Hu Wenge Lu Lipeng Chen Dengwen Yang Di Wang Yanping Han Jing
（College of Life Science，Shihezi University，Shihezi 832003）
Abstract: In order to get the best reaction system and suitable primerof Perca fluviatilis, using Perca fluviatilis genomic DNA as
templates，by L17（5
4）orthogonal experiment table, four major factors（Taq enzyme, Mg2+, dNTP and primer）that greatly affected the results
of RAPD were chosen and design to seek optimal reaction condition.For a 25 μL reaction system contain, the optimal compositions included 30
ng DNA template 1.5 μL, 10 μmol/L primer0.7 μL, 10×buffer2.5 μL, 5 μmol/L dNTPs 0.4 μL, 5U Taq polymerase 0.2 μL, 2.5 mmol/L MgCl2 3.0
μL ；useing the optimal system, 10 random primers were selected from 50 primers, and determine the optimal annealing temperature.
Key words: Perca fluviatilis RAPD-PCR Condition optimization Suitable primers Annealing temperature
有关方面的研究［5-12］，而有关河鲈种质鉴定方面的
研究尚未见报道。
随 机 扩 增 多 态 性 技 术（Random amplified pol-
ymorphic DNA，RAPD） 是 1990 年 由 Williams 和
Welsh［13］两个研究小组发明的一种较为简便的检测
DNA 多态性技术。该技术无表型效应、不受环境限
制和影响、敏感快速、产率高、检测容易等优点，
为显性标记，引物没有主属特异性，可用于不同基
因组的分析，因此在鱼类遗传进化、遗传多样性、
分类、种群亲缘、育种、杂种优势、遗传图谱构建
等研究方面应用广泛。然而，RAPD 技术所需的引
物为随机引物，且长度较短（通常为 10 bp 的核酸
2013年第9期 115董艳艳等 ：河鲈 RAPD-PCR 反应体系的建立与优化及引物筛选
苷序列），退火温度低，存在一定的错配，一般认为
会影响试验的重复性。该技术的重复性是影响其应
用的主要因素，影响其重复性的因素很多，如 Taq 酶、
Mg2+、dNTPs、引物等因素［14，15］。
本研究以河鲈的基因组 DNA 为模板，通过正交
试验方法，对影响 PCR 反应较大的 4 个因素：Taq 酶、
Mg2+、dNTPs、引物，在 5 个水平上进行优化试验，
建立河鲈 RAPD-PCR 反应体系，从广泛用于种质鉴
定分析的 RAPD 引物中筛选出适用的引物，并确定
其退火温度，旨在为新疆这一特产经济鱼类的种质
鉴定和大小种群间的多样性研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 鱼样的采集与处理 试验样品均采用同一年
4 月底孵化出的河鲈鱼苗进行人工成鱼养殖生产，
养到 2+ 龄时，测定同批鱼的生长情况，河鲈大小类
群的生长速度会出现明显的差别，大个体类群平均
体重 450 g 左右，小个体类群平均体重 120 g 左右。
随机挑选体质健壮的小个体和大个体河鲈各 100 尾，
并区分雌雄，用于本研究的材料。剪取每尾鱼的胸
鳍鳍条，用作试验组织样本，放入便携式小冰箱中
保存。运回实验室后，需近期使用的样本于 -20℃冰
箱保存，要长期保存的样品置于 -80℃冰箱中。
1.1.2 试剂 RAPD 随机引物参考其他研究已公布
的引物（表 1），由上海捷瑞生物工程有限公司合成。
RNaseA 酶、Taq 酶及 dNTPs 购自北京天根公司，琼
脂糖、丙烯酰胺等为西班牙进口分装。
根据表 1 所合成的引物情况，以河鲈基因组
DNA 为模板，通过优化试验，最终筛选出 10 条扩
增条带清晰，重复性好，扩增位点多的引物，用于
下一步的分析，具体如表 2 所示。
1.2 方法
1.2.1 基因组 DNA 的提取 基因组 DNA 的提取方
法参照梁利群等［16］，1.0% 琼脂糖电泳检测，分装
贮存于 - 20℃冰箱中备用。
1.2.2 RAPD-PCR 反 应 体 系 的 正 交 试 验 选 取
L17（5
4）正交试验，对 RAPD-PCR 反应影响较大的
因素 ：Taq 酶、Mg2+、dNTPs、引物这，进行 4 因素
5 水平正交试验（表 3）。
表 3 河鲈 RAPD-PCR 反应体系主要影响因素及水平
水平
因素影响
Taq 酶（U） Mg2+（mmol/L） dNTPs（μmol/L） 引物（μmol/L）
1 0.10 2.0 0.30 0.3
2 0.15 2.5 0.35 0.5
3 0.20 3.0 0.40 0.7
4 0.25 3.5 0.45 1.0
5 0.30 4.0 0.50 1.5
以 引 物 H2 为 例， 根 据 表 3 制 备 25 μL 的
RAPD-PCR 反应体系，除表中所列的试验因素外，
表 1 随机引物情况
引物编号 引物序列（5-3） 引物编号 引物序列（5-3）
H1 CAGCACCGCA H26 GACTAAGCCC
H2 GTGCCGTTCA H27 CAGGGCTT TC
H3 CCAGGAGGAC H28 CCTTCCCACT
H4 GGGTGGGTAA H29 AGGGTCTGTG
H5 CACCCCAGTC H30 GTTTCGCTCC
H6 CCGACAAACC H31 TGATCCCTGG
H7 TCAACGGGAC H32 CATCCCCCTG
H8 TCGGAGGTTC H33 GGACTGGAGT
H9 TCCCCATCAC H34 TGCGCCCTTC
H10 GTGCGAGCAA H35 TGCTCTGCCC
H11 ACTTTGGCGG H36 GTCCACACGG
H12 GGTGACGCAG H37 TGGGGGACTC
H13 TGCTCTGCCC H38 CTGCTGGGAC
H14 GGTGACGCAG H39 GTTGGTGGCT
H15 GTTTCGCTCC H40 ACAACGCCTC
H16 CATCCCCCTG H41 GGGGGATGAG
H17 GGACTGGAGT H42 GGGGGTTGTC
H18 TGCTCTGCCC H43 GGGAACGTGT
H19 GGTGACGCAG H44 CTGGGCAACT
H20 GTCCACACGG H45 AGGGAACGAG
H21 TCTGTGCCAC H46 CCACAGCAGT
H22 CCTACGGGGA H47 ACCCCCGAAG
H23 AGGCTGTGCT H48 GGACCCTTAC
H24 TCCCATGCTG H49 CAGGCCCTTC
H25 CTCAGTCGCA H50 AGTCAGCCAC
表 2 引物的优化筛选情况
引物编号 引物序列（5-3） 引物编号 引物序列（5-3）
H2 GTGCCGTTCA H36 GTCCACACGG
H5 CACCCCAGTC H37 TGGGGGACTC
H15 GTTTCGCTCC H45 AGGGAACGAG
H16 CATCCCCCTG H49 CAGGCCCTTC
H33 GGACTGGAGT H50 AGTCAGCCAC
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第9期116
该体系还含有 10×buffer 和 30 ng 模板 DNA，其他
各成分如表 4 所示，最后用 ddH2O 补足，在 PCR 仪
上进行扩增。反应程序 ：94℃预变性 3 min，94℃变
性 1 min，36℃退火 1 min，72℃延伸 2 min，共 40
个循环 ；72℃延伸 10 min。将 PCR 产物在 5% 非变
性聚丙烯先凝胶上电泳，拍照。
表 4 河鲈 RAPD-PCR 反应体系的正交设计试验
试验号
因素
Taq 酶（U） Mg2+（mmol/L） dNTPs（μmol/L） 引物（μmol/L）
1 0.1 3.0 0.4 0.7
2 0.15 3.0 0.4 0.7
3 0.2 3.0 0.4 0.7
4 0.25 3.0 0.4 0.7
5 0.3 3.0 0.4 0.7
6 0.2 2.0 0.4 0.7
7 0.2 2.5 0.4 0.7
8 0.2 3.5 0.4 0.7
9 0.2 4.0 0.4 0.7
10 0.2 3.0 0.3 0.7
11 0.2 3.0 0.35 0.7
12 0.2 3.0 0.45 0.7
13 0.2 3.0 0.5 0.7
14 0.2 3.0 0.4 0.3
15 0.2 3.0 0.4 0.5
16 0.2 3.0 0.4 1.0
17 0.2 3.0 0.4 1.5
1.2.3 引物的筛选与退火温度确定 根据正交试验
结果，采用最优的 RAPD-PCR 反应体系，筛选出适
用于河鲈 RAPD-PCR 的引物，并集合引物的 Tm 值，
My CyclerTMThermal PCR 仪 的 Temp Gradient 程 序 自
动生成 8 个温度梯度，选择引物在优化条件下的退
火温度。
1.2.4 优化体系稳定性检测及应用 根据试验结果
确定 RAPD-PCR 的最佳反应体系和扩增条件，用筛
选得到的 RAPD-PCR 引物，对河鲈样品进行 DNA
扩增，检测优化体系的稳定性。
2 结果
2.1 基因组DNA提取结果
通过改良的动物组织 DNA 提取方法，从胸鳍组
织中提取到的样品基因组 DNA 呈白色絮状沉淀，试
验结果呈均一条带（图 1），说明提取的 DNA 较纯。
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
1-9 ：大个体河鲈基因组 DNA ；10-18 ：小个体河鲈基因组 DNA
图 1 部分河鲈基因组 DNA 电泳检测
2.2 正交试验结果
PCR 扩增受 Taq 酶、Mg2+ 、dNTPs、引物等因
素综合作用的影响。从正交试验的结果（图 2）可知，
17 个处理组合扩增结果存在明显差异，条带数最多
的有 3 号、9 号处理，其次是 8 号、4 号、5 号处理，
6 号、7 号、13 号、14 号处理更是次之，而 1 号、2 号、
10 号、11 号、12 号、15 号、16 号、17 号均无带。3 号、
9 号处理的主带清晰，条带范围在 300-1 000 bp 之间，
3 号处理条带亮度和数量大于 9 号处理，8、4、5 号
处理背景较为模糊，并且有条带缺失，6、7、13、
14 号处理条带数量缺失过多。综合以上分析，以特
异性带多态性高、背景干扰低、主带清晰、副带明
显为原则，同时结合试验成本等因素，在 17 个处理
中，3 号处理为最佳反应体系，即在 25 μL 的反应体
系中含有 30 ng DNA 模板 1.5 μL，10 μmol/L 引物 0.7
μL，10×buffer 2.5 μL，25 μmol/L dNTPs 0.4 μL，5 U
Taq 酶 0.2 μL，2.5 mmol/L MgCl2 3.0 μL。
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17M
1500
bp
1500
900
800
700
600
500
400
300
200
M ：100 bp ladder ；1-17 ：正交试验处理号
图 2 河鲈 RAPD-PCR 正交试验电泳结果
2.3 引物筛选及退后温度的确定
通过 PCR 反应，电泳检测出 10 条能扩增出条
带的 RAPD-PCR 引物，引物的退火温度取决于所选
引物中 GC 碱基对的含量。根据正交试验结果，选
2013年第9期 117董艳艳等 ：河鲈 RAPD-PCR 反应体系的建立与优化及引物筛选
择适宜的反应体系，设置退火温度。根据理论公式
Tm = 4（G+C）+2（A+T） 计 算， 以 引 物 H2 为 例，
H2 的理论 Tm 为 32℃，My Cycler
TMThermal PCR 仪的
Temp Gradient 程序生成 8 个梯度 ：30.0℃、30.6℃、
32.0℃、33.6℃、36.0℃、37.9℃、39.1℃、40.0℃（图
3）。根据 PCR 电泳图谱选择条带清晰、副带明显且
背景干扰低的原则，36℃为引物 H2 最佳退火温度，
其他引物也均采用这一退火温度进行扩增反应。
3 讨论
RAPD 这种快速、简便的标记技术，不需要知
道研究对象的遗传背景［17］，对于研究尚处于起步
阶段的河鲈的种质鉴定来说是一种有效的分析手
段。本试验对河鲈这一新疆特产经济鱼类的 RAPD-
PCR 反应条件进行了优化，并得到其优化反应体
系 ：25 μL 反应体系中含有 30 ng DNA 模板 1.5 μL，
10 μmol/L 引物 0.7 μL，10×buffer 2.5 μL，25 μmol/L
dNTPs 0.4 μL，5 U Taq 酶 0.2 μL，2.5 mmol/L MgCl2 3.0
μL。很多文献报道了 RAPD-PCR 反应条件易受体系
中各组分浓度、扩增程序和退火温度等因素的影响，
并且分析了这些影响的机理［15，18-20］。本试验结果
也证明了不同组合反应体系的 PCR 结果差异较大。
RAPD 引物大多为随机引物，本试验选用的引物多
为近几年来广泛用于鱼类种质鉴定分析的引物［18-22］。
RAPD-PCR 筛选的适用引物和最佳反应条件，对于
获得相对较多的 RAPD-PCR 条带尤为重要。因此，
利用 RAPD 标记研究时，首先应该建立起合适的反
应体系并对其进行优化，进而在优化条件下测定适
用引物的最佳退火温度。
本试验确定的 RAPD-PCR 反应体系的特点 ：模
板 DNA 和 Taq 酶的用量少，节约成本 ；优化条件下
引物退火温度较其 Tm 值高，保证了扩增片段的特异
性 ；筛选出的随机引物，PCR 扩增 DNA 片段清晰、
特异性高、重复性好。本研究成果将为探求河鲈的
遗传结构背景奠定基础，是今后研究其人工养殖、
同属间亲缘关系和进化潜能的前提条件，为保护和
开发我国这一特产经济鱼类提供理论依据，从而保
护我国生物多样性。
4 结论
以河鲈基因组 DNA 为模板，采用正交设计方
法，选用 L17（5
4）正交表，对影响 PCR 反应较大的
4 个因素 ：Taq 酶、Mg2+、dNTPs、引物在 5 个水平
上进行优化试验，得到河鲈最优 RAPD-PCR 反应体
系 ：25 μL 反应体系中含有 30 ng DNA 模板 1.5 μL，
10 μmol/L 引 物 0.7 μL，10×buffer2.5 μL，25 μmol/L
dNTPs 0.4 μL，5 U Taq 酶 0.2 μL，2.5 mmol/L MgCl2 3.0
μL。筛选出适用于该试验的 10 条引物，并确定了所
筛选引物的最佳退火温度为 36℃。
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16M
1000
bp
900
800
700
600
500
400
300
200
M ：100 bp ladder ；1，2 ：30.0℃ ；3，4 ：30.6℃ ；5，6 ：31.8℃ ；7，8 ：33.6℃ ；
9，10 ：36.0℃ ；11，12 ：37.9℃ ；13，14 ：39.1℃ ；15，16 ：40.0℃
图 3 不同退火温度对河鲈 RAPD-PCR 反应的影响（H2）
2.4 优化体系的稳定性检测及应用
根据以上确立的优化体系，以引物 H2 对各 100
尾大小河鲈样本进行 PCR 扩增，部分结果如图 4 所
示。该引物对各 100 尾大小河鲈鱼样都能扩增出清
晰、重复性好、特异性高的 DNA 条带，表明已确立
的 RAPD-PCR 反应体系稳定可靠，可用于河鲈种质
鉴定研究。
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 1415 16 17 18 19 20 21 22 23 24M
1000
1500
bp
900
800
700
600
500
400
300
200
M ：100 bp ladder ；1-12 ：引物 H2 对大河鲈个体的部分 PCR 扩增结果 ；13-
24 ：引物 H2 对小河鲈个体的部分 PCR 扩增结果
图 4 引物 H2 对大小河鲈个体的部分 PCR 扩增结果
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第9期118
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（责任编辑 李楠）