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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第9期
草莓（Fragaria×ananassa Duch.）是蔷薇科草
莓属多年生草本植物，是世界上重要的经济浆果之
一。草莓传统匍匐茎繁殖的方法，繁殖速度慢，且
易造成品种种性退化，产量品质下降，从而降低果
收稿日期 ： 2013-03-05
作者简介 ：周书利，女，硕士研究生，研究方向 ：植物生物技术在果树中的应用 ；E-mail ：0616101099@163.com
通讯作者 ：汤浩茹，男，教授、博导，研究方向 ：植物生物技术在果树中的应用 ；E-mail ：htang@sicau.edu.cn
不同因素对草莓玻璃化试管苗恢复的影响
周书利1  汤浩茹1，2  陈清1  张晓楠1  于定群1
（1. 四川农业大学园艺学院，雅安 625014 ；2. 四川农业大学果蔬研究所，成都 611130）
摘 要 ： 旨在探索草莓玻璃化试管苗恢复措施。以‘丰香’草莓玻璃化试管苗为材料，采用正交设计的方法，在继代培养
基中添加不同浓度组合的活性炭、聚乙烯醇和钙离子（氯化钙），研究不同组合对草莓玻璃化试管苗恢复的影响，同时比较恢复
后的正常试管苗与原来的玻璃化苗及正常苗的生理生化指标。结果表明，正交设计的 9 种处理间草莓玻璃化苗的恢复率差异显著，
恢复率最高的是处理 9（1 g/L 活性炭 +2 g/L 聚乙烯醇 +166 mg/L 钙离子），恢复率为 89.07%，其次是处理 4（0.5 g/L 活性炭 +166
mg/L 钙离子），81.05%、处理 8（1 g/L 活性炭 +1 g/L 聚乙烯醇），73.87%。方差分析表明，活性炭、聚乙烯醇、钙离子浓度对草莓
玻璃化苗恢复的影响都极为显著，影响大小依次是钙离子 > 活性炭 > 聚乙烯醇。恢复苗的各项生理生化指标与玻璃化苗差异显著，
与正常苗差异不显著。结合各处理对玻璃化苗的恢复率、生理生化指标及增殖系数，综合考虑认为使草莓玻璃化试管苗恢复的最
佳处理为处理 9。
关键词 ： 草莓 正交设计 玻璃化试管苗 恢复 生理生化
Effects of Different Factors on Recovery of Strawberry
Vitrification Shoots
Zhou Shuli1 Tang Haoru1，2 Chen Qing1 Zhang Xiaonan1 Yu Dingqun1
（1. College of Horticulture，Sichuan Agricultural University，Ya’an 625014 ；2. Institute of Pomology and Olericulture of Sichuan Agricultural
University，Chengdu 611130）
Abstract:  The objective of this study is to explore the prevention and recovery measures of strawberry vitrification shoots. Using method
of orthogonal design, different combinations of activated carbon, PVA, calcium ion（calcium chloride）were added to subculture medium of
the vitrification shoots of ‘Toyonoka’ strawberry to study the effects of strawberry recovery rate. Meanwhile, the physiological and biochemical
indexes among recovery plantlets, vitrification shoots and normal plantlets were compared. There were significant differences in recovery rate
of vitrification shoots among 9 treatments. The optimum one was No.9（1g/L activated carbon + 2 g/L PVA + 166 mg/L calcium ion）and the
recovery rate was 89.07%, followed by the 4th treatment（0.5 g/L activated carbon + 166 mg/L calcium ion）, 81.05%, and the 8th treatment（1
g/L activated carbon + 1 g/L polyvinyl alcohol）, 73.87%, respectively. Analysis of variance showed that calcium ion concentration was the most
significant impact factor on strawberry vitrification recovery, the second was calcium ion, and polyvinyl alcohol affected least. Significant different
physiological and biochemical indexes between the recovery plantlets and vitrification shoots were observed but not between recovery plantlets
and normal plantlets. Combined with the recovery rate of vitrification shoots, physiological and biochemical indexes, and the reproduction
coefficient, the best recommended recipe for vitrification shoots recovery was the 9th .
Key words:  Strawberry Orthogonal design Vitrification shoots Recovery Physiology and biochemistry
实的经济价值和商品价值。植物组织培养技术，比
常规育苗繁殖系数高、生长旺盛、成活率高、可在
短期内大量繁殖草莓幼苗［1］，也是遗传工程必不可
少的操作系统。然而，在植物组培过程中常会出现
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第9期90
试管苗玻璃化现象，玻璃化试管苗的组织结构和生
理功能异常，分化能力低下，难以增殖成芽，也难
以生根成苗，移栽大田更难以成活［2］，对植物快速
繁殖非常不利。虽然试管苗玻璃化后偶尔可在延长
培养的期间恢复正常，但是一般很难恢复正常［3］。
试管苗玻璃化已成为组培工作中亟待解决的一大难
题［4］。随着对玻璃化产生机理研究的深入，某些植
物的玻璃化已得到了有效的控制［5，6］。而且研究发
现，玻璃化的组织在一定条件下可以恢复为正常
苗［7］。在草莓组培中，试管苗玻璃化现象也很常
见，丰锋等［8］对草莓玻璃化苗的恢复进行了研究，
通过单因素试验得出活性炭对玻璃化苗的恢复较好，
但仍不是很理想。有研究报道聚乙烯醇［9］和钙离
子［5，6］对玻璃化试管苗的恢复具有较好的效果。本
研究以‘丰香’草莓为材料，采用正交设计方法，
研究不同浓度组合的活性炭、聚乙烯醇和钙离子对
草莓玻璃化试管苗恢复的影响，并比较恢复后的试
管苗与玻璃化苗及正常试管苗的生理生化指标，找
到最佳处理组合，以期为草莓玻璃化试管苗恢复进
而为草莓组培苗的快速繁殖和规模化生产提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
供试材料为‘丰香’草莓玻璃化试管苗，取自
四川农业大学果树生物技术实验室组培室。取大棚
中一年生‘丰香’草莓匍匐茎茎尖，经诱导培养基
（MS+ 6-BA 0.5 mg/L+ NAA 0.1 mg/L）培养，待分化
出大量不定芽，转至继代培养基上（MS+ 6-BA 2.0
mg/L+ IBA 0.1 mg/L）扩繁。从第 2 代培养材料上选
出玻璃化试管苗（试管苗叶片或茎呈透明或半透明
状，淡绿色）作为供试材料。
1.2 方法
1.2.1 玻璃化试管苗的恢复 以玻璃化程度基本一
致的玻璃化苗为材，在继代培养基上，按照正交试
验设计（表 1），分别添加不同浓度组合的活性炭
（A）、聚乙烯醇（B）（分析纯）和钙离子（C）（氯化
钙，分析纯），将玻璃化苗分别接种于各处理的培养
基上，每个处理接种 10 瓶，重复 3 次。培养瓶、封
口材料及培养条件（光照、温度等）均相同，培养
30 d 后，统计各处理试管苗的增殖系数及恢复苗数
（试管苗叶片和茎转绿与正常苗相似的试管苗数）。
增殖系数 = 总分化苗数 / 接种苗数；恢复率（%）
= 恢复苗数 / 总分化苗数 ×100%。
表 1 L9（3
4）正交试验因素水平表
水平
因子
A 活性炭（g/L） B 聚乙烯醇（g/L） C 钙离子（mg/L）
1 0 0 0
2 0.5 1 116
3 1.0 2 332
上述试验所用培养基均附加蔗糖 20 g/L，琼脂
6.0 g/L，pH5.8-6.0，培养温度（25±2）℃，光强度
2 000-3 000 lx，光周期 16 h/8 h。
1.2.2 生理生化指标的测定 玻璃化试管苗在经处
理的培养基上恢复培养 30 d 后，取 9 种处理后的恢
复苗、处理前的玻璃化苗和正常苗的叶片进行各项
生理生化指标的测定。组织含水量的测定采用干重
法［10］；叶绿素含量的测定采用分光光度法［11］；可
溶性糖含量的测定采用蒽酮比色法［12］。叶片膜透性
用 Jenco-3173 型便携式电导率仪测定［13］。粗酶液的
提取参照邹琦［14］的方法，超氧化物歧化酶（SOD）
活性测定采用 NBT 还原法［13，14］。过氧化物酶（POD）
活性的测定参照李合生的方法［12］。过氧化氢酶（CAT）
活性的测定参照邹琦的紫外吸收法［14］。
1.2.3 统计分析 每处理重复测定 3 次，试验数据
用 DPS 分析软件进行方差分析。
2 结果
2.1 各处理对草莓玻璃化苗恢复的的影响
玻璃化试管苗在不同处理培养基上都有所恢复，
其中处理 9 恢复率最高（表 2），达 89.07%，与其
他处理呈极显著差异。处理 4 的恢复率次于处理 9，
但其增殖倍数高于处理 9。处理 2 和处理 8，处理 3
和处理 6，处理 5 和处理 7 无显著差异，任何添加
物都未加的处理 1 的恢复率最低。3 因素对恢复率
的影响大小依次是钙离子、活性炭、聚乙烯醇，且
差异极显著（表 3）。
2.2 各单因素对草莓试管苗玻璃化的影响
不同浓度活性炭对玻璃化苗的恢复影响呈极显
著性差异（表 4），添加活性炭的处理比未添加活性
炭的处理恢复率高很多，且随着活性炭浓度的升高，
2013年第9期 91周书利等 ：不同因素对草莓玻璃化试管苗恢复的影响
恢复率也升高。聚乙烯醇对玻璃化苗恢复的影响也
呈极显著性差异，变化趋势与活性炭一致。钙离子
浓度对玻璃化苗恢复的影响呈先上升后下降的趋势，
当钙离子浓度为 166 mg/L 时，玻璃化苗的恢复率显
著高于不添加和添加 332 mg/L 的恢复率。
表 4 各单因素对草莓玻璃化苗恢复率的影响
水平
恢复率（%）
活性炭 聚乙烯醇 钙离子
1 54.42cC 54.31cC 55.44bB
2 64.42bB 64.45bB 80.67aA
3 71.33aA 71.40aA 54.05bB
2.3 恢复苗与玻璃化苗及正常苗生理生化指标的
差异比较
为验证各处理对玻璃化苗的恢复效果是否达到
了正常苗的生理生化水平，对恢复苗组织含水量、
可溶性糖含量、细胞膜透性、叶绿素含量、SOD、
POD 及 CAT 酶活性进行测定，结果表明，处理 4 和
处理 9 中的恢复苗已经完全达到了正常苗的水平。
2.3.1 组织含水量、可溶性糖含量、膜透性比较
组织含水量是植物水分状况的重要指标，直接影响
植物的生长，气孔状况及光合功能。由表 5 可知，
各处理的恢复苗组织含水量较原来的玻璃化苗有显
著下降，且呈极显著差异，处理 2、处理 6 和处理 9
的组织含水量与正常苗差异不显著，达到正常水平，
处理 9 组织含水量较正常苗还小，处理 4 与处理 5
与正常苗达到显著水平，但并不极显著，表明处理
后恢复正常的试管苗组织含水量恢复正常。可溶性
糖含量是植物对逆境环境适应性的重要指标。各处
理的可溶性糖含量都较玻璃化苗提高，差异显著，
处理 4、处理 9 与正常苗无显著差异，表明处理 4、
处理 9 的恢复苗可溶性糖含量达到正常水平，适应
环境能正常生长。相对电导率的大小表示细胞膜受
伤害的程度，相对电导率值越大，细胞膜受伤害程
度越大，反之。各处理恢复苗的膜透性显著低于原
来的玻璃化苗，其中处理 4、7、9 的膜透性比正常
苗稍低，但无显著性差异，表明处理后的恢复苗的
细胞膜透性恢复正常。
表 5 各处理恢复苗、玻璃化苗与正常苗组织含水量、可溶
性糖、膜透性比较
处理 组织含水量（%） 可溶性糖含量（mg/g） 相对电导率（%）
1 56.84bBC 25.82cdC 38.30eEF
2 55.19cdDE 25.92cdC 49.34cC
3 56.77bBC 26.44cC 38.72eDE
4 55.55cCD 30.22aA 32.53fG
5 55.67cCD 29.23bB 44.04dCD
6 54.68cdeDE 29.20bB 55.50bB
7 57.64bB 24.64eD 33.66fEFG
8 57.38bB 25.73dC 44.29dC
9 53.88eE 29.56abAB 33.10fFG
正常苗 54.44deDE 30.17aA 31.78fG
玻璃化苗 63.78aA 21.58fE 61.00aA
表 2 不同处理对草莓玻璃化试管苗恢复的影响
处理 A B C 接种数（株） 总分化数（株） 正常苗数（株） 增殖系数 恢复率（%）
1 0 0 0 30 93 29 3.10dC 30.84fF
2 0 1 116 30 126 91 4.21bcB 71.89cC
3 0 2 332 30 151 92 5.04aA 60.52dD
4 0.5 0 116 30 134 108 4.45bAB 81.05bB
5 0.5 1 332 30 116 59 3.88cB 50.59eE
6 0.5 2 0 30 132 82 4.41bB 61.62dD
7 1 0 332 30 49 25 1.63fE 51.04eE
8 1 1 0 30 68 50 2.26eD 73.87cC
9 1 2 116 30 68 61 2.26eD 89.07aA
大、小写字母不同分别表示 P=0.01、P=0.05 显著差异水平 ；下同
表 3 正交设计方差分析表
变异来源 平方和 自由度 均方 F 值 P 值
活性炭 1 300.950 4 2 650.475 2 131.6678 0.0001
聚乙烯醇 1 222.990 6 2 611.495 3 123.7776 0.0001
钙离子 4 040.291 3 2 202 0.145 6 408.9137 0.0001
空白 1 056.579 3 2 528.289 6 106.9353 0.0001
误差 88.924 9 18 4.940 3
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第9期92
2.3.2 恢复苗与玻璃化苗及正常苗叶绿素含量比
较 叶绿素与蛋白质结合存在于叶绿体的类囊体膜
上，是光能吸收和转化的原初物质。由表 6 可知，
各处理的玻璃化苗经处理后所得到的恢复苗叶绿素
a（Ca）含量均提高，与玻璃化苗呈显著性差异，其
中处理 4、5、9 叶绿素 a 的含量与正常苗相当，无
显著差异。恢复苗叶绿素 b（Cb）的含量也提高，
除处理 1、3、6、7 外，其他处理与正常苗无显著差异。
Ca/Cb 在各处理中及其与正常苗和玻璃化苗都无显
著差异。这表明玻璃化苗的叶绿素显著降低，光合
作用下降，但经处理恢复正常的试管苗其叶绿素含
量与正常苗差异不显著，光合作用基本恢复正常。
表 6 恢复苗、玻璃苗与正常苗叶绿素含量比较
处理 Ca（μg/g） Cb（μg/g） Ca/Cb
1 0.69dC 0.32cdBC 2.17 aA
2 0.78bcBC 0.39abcAB 1.99 aA
3 0.71cdC 0.32cdBC 2.24 aA
4 0.89aA 0.45aA 1.98 aA
5 0.88aA 0.46aA 1.93 aA
6 0.68dC 0.35bcABC 2.00 aA
7 0.72cdC 0.36bcABC 2.00 aA
8 0.70dC 0.39abcAB 1.85 aA
9 0.85aAB 0.43abAB 2.02 aA
正常苗 0.85abAB 0.46aA 1.86 aA
玻璃化苗 0.52eD 0.26dC 2.02aA
2.3.3 玻璃苗与正常苗及 SOD、POD、CAT 酶活性
比较 植株体内的超氧化物歧化酶（SOD）、过氧
化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）以及其他酶类
相互协调，可有效清除代谢过程产生的活性氧，使
其维持在正常水平。由表 7 可知，各处理的恢复苗
SOD 酶活都提高，与玻璃化苗差异极显著，其中处
理 4、8、9 与正常苗无显著差异，处理 9 略高于正常
苗。POD 酶活性除处理 3 与玻璃苗无显著差异外，
其他各处理的 POD 酶活都下降，并与正常苗无显著
差异。CAT 酶活除处理 4、9 与正常苗无显著差异，
其余都与正常苗差异显著，未到达正常水平，除处
理 2、5、8 外，与玻璃化苗差异不显著，表明 3 种
酶的变化趋势不一致，同一种酶在不同处理上其酶
活也有差异，处理 4、9 的酶活基本与正常苗相当。
表 7 恢复苗、玻璃苗与正常苗及 SOD、POD、CAT 酶活
性比较
处理
SOD 酶活性
（u·FW/g）
POD 酶活
（u/g·min）
CAT 酶活性
（u/g·min）
1 232.35fE 15.72efDE 29.02dE
2 247.90dC 14.83fE 33.00cD
3 236.75eD 25.22bA 28.51dE
4 257.85bA 16.82deCDE 38.57aAB
5 251.95cB 18.11dBCD 36.14bC
6 249.00dBC 20.05cB 29.85dE
7 247.70dC 16.82deCDE 35.44bC
8 258.15abA 15.99efCDE 36.63bBC
9 260.65aA 18.16dBC 38.43aAB
正常苗 259.00abA 17.18deCDE 38.97aA
玻璃化苗 180.10gF 27.12aA 18.29eF
3 讨论
试管苗玻璃化现象是植物组织培养中普遍发生
的特有的一种生理性病变［15］，草本与木本植物中均
有发生。目前已报道出现玻璃化苗的植物达 80 多
种，草本植物玻璃化现象重于木本植物［16］。草莓属
草本植物，在组织培养的过程中易出现玻璃化现象。
研究证实试管苗玻璃化现象是植株的一种表型特征，
在一定条件下仍可恢复。郑黎文等［7］将芍药玻璃化
苗逆转为正常植株。马丽华等［17］在菊花玻璃化苗
恢复研究中，认为通过适当添加一定量的活性炭对
玻璃苗的逆转有一定的效果。本试验通过正交试验
单因素分析发现，活性炭对玻璃化苗的恢复也具有
良好的效果，可能是因为活性炭可吸附植物分泌的
有害物质和降低培养基湿度，调节细胞水势和激素
含量的作用。
聚乙烯醇常作为一种渗透调节剂，它可以调节
植株苗的渗透作用，利于细胞膜修复，减少营养物
质的渗漏，具有提高种子的活力及幼苗抗寒性、抗
旱性的作用［18，19］。在组织培养中还可防止组培苗玻
璃化［9］。王娜等［9］研究认为，2.0 g/L 的聚乙烯醇能
够有效降低冬枣和酸枣组培苗在继代增殖中的玻璃
化现象。本研究发现 2.0 g/L 的聚乙烯醇也能够有效
地恢复草莓玻璃化试管苗，与王娜等的研究相似。
钙是植物的必需元素，它参与细胞壁的构成，
影响光合作用，促进代谢等生理过程。在戴园园等［5］
和李竹梅等［6］对试管玻璃化苗的研究中，都认为
2013年第9期 93周书利等 ：不同因素对草莓玻璃化试管苗恢复的影响
适当的钙离子对克服玻璃化现象具有较好效果。本
试验研究结果经分析表明，钙离子对玻璃化苗的恢
复影响最大优于活性炭和聚乙烯醇。研究发现添加
166 g/L 钙离子对草莓玻璃化苗的恢复具有较好的效
果，恢复率高于不添加以及添加 332 g/L 钙离子的处
理，因此推测培养基中适当地提高大量元素中钙离
子浓度或许能有效降低草莓试管苗玻璃化的发生。
通过正交试验我们从 9 种处理中找出了恢复草
莓玻璃化试管苗的 3 种添加物的最优浓度组合，即
处理 9。丰锋等［8］在研究草莓玻璃化试管苗的恢复
中通过单因素试验发现铵离子及活性炭对玻璃苗的
恢复有一定作用，但其恢复率最高仅 50% 左右，本
试验通过正交设计得出处理 9 的恢复率达 89.07%，
高于一般的单因素处理。
在玻璃化试管苗中，植物的组织含水量增加、
可溶性糖含量变化、叶绿素等的含量降低、抗氧化
酶活性的变化使得玻璃苗的细胞质膜透性改变、细
胞壁发育差、光合作用能力降低，代谢紊乱，生理
功能异常［16］。本试验通过测定恢复苗的生理指标发
现，恢复后的试管苗各项生理指标较玻璃化苗得到
大的改善，与正常苗差异不大，基本恢复正常，可
以进行后续的增殖及移栽。
4 结论
使草莓玻璃化试管苗恢复的最佳处理为处理 9
其次为处理 4。处理 9 即在继代培养基培养基中添
加 1 g/L 活性炭、2 g/L 聚乙烯醇和 166 mg/L 钙离子，
恢复率可达 89.07%。处理 4 即在 MS 培养基添加 0.5
g/L 活性炭和 166 mg/L 钙离子，恢复率为 81.05%，
略次于处理 9，但其增殖系数高，达 4.45。
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（责任编辑 李楠）