全 文 ：·综述与专论· 2013年第7期
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN
1 葡萄糖氧化酶简介
葡萄糖氧化酶（glucose oxidase，GOD）最早在
黑曲霉的提取物中发现［1］，系统名称为 β-D-葡萄糖：
氧 1-氧化还原酶（EC 1.1.3.4）。它能够催化 β-D-葡
萄糖被氧气氧化成葡萄糖酸 -δ-内酯，并生成过氧化
氢［2］。生成的葡萄糖 -δ-内酯随后自发水解［2］或者
在内酯酶的作用下水解成葡萄糖酸［3］。相关反应，
如图 1 所示。
GOD 应用广泛，可用于葡萄糖传感器制造［5］、
面粉添加剂［6］、葡萄糖酸及其盐生产［7］和生物燃
料电池［8］ 等领域。因此，寻求更有效的 GOD 的
收稿日期 ：2013-01-04
基金项目 ：“863”计划子课题（SQ2010AA0222655001）
作者简介 ：刘瑜，男，硕士研究生，研究方向 ：微生物酶技术 ；E-mail ：liu_yu1988@163.com
通讯作者 ：李丕武，男，副教授，研究方向 ：微生物酶技术 ；E-mail ：piwuli@126.com
黑曲霉葡萄糖氧化酶高产基因工程菌研究进展
刘瑜  李丕武 
（山东轻工业学院食品与生物工程学院 山东省微生物工程重点实验室，济南 250353）
摘 要 ： 葡萄糖氧化酶能够催化葡萄糖氧化生成葡萄糖酸 -δ-内酯，具有广泛的应用领域。黑曲霉是传统的产葡萄糖氧化酶
工业菌种，经过几十年的工业应用，产酶水平已经达到极限。目前应用于表达葡萄糖氧化酶的表达系统主要有黑曲霉、酿酒酵母
和巴斯德毕赤酵母。近些年来蛋白质定向进化手段开始应用于葡萄糖氧化酶的分子改造，有望使黑曲霉葡萄糖氧化酶的工业化产
量得到进一步的提高。介绍葡萄糖氧化酶高产基因工程菌研究进展。
关键词 ： 黑曲霉 葡萄糖氧化酶 工程菌构建 表达系统 蛋白质定向进化
Review on High-level Aspergillus niger Glucose Oxidase Production
Engineering Strains
Liu Yu Li Piwu
（Shandong Provincial Key Laboratory of Microbial Engineering，School of Food and Bioengineering，
Shandong Polytechnic University，Jinan 250353）
Abstract:  Glucose oxidase, which can catalyze the oxidation of glucose to glucono-δ-lactone, has been applied in various fields. The
traditional production of glucose oxidase using Aspergillus niger as the industrial production microorganism has reached the limit. Nowadays, the
main expression systems which have been used in the expression of glucose oxidase are Asprgillus niger, Saccharomyces cerevisiae and Pichia
pastoris. Directed protein evolution has recently come into use in the molecular modification of glucose oxidase, which is expected to improve the
yield of Aspergillus niger glucose oxidase in industrial production. The progress of high-level glucose oxidase production engineering strain were
reviewed.
Key words:  Aspergillus niger Glucose oxidase Construction of engineering strain Expression system Directed protein evolution
生产方法具有重要的现实意义。目前生产 GOD 的
微生物有黑曲霉（Aspergillus niger）［9］、尼琦青霉
（Penicillium amagasakiense）［10］、变幻青霉（Penicillium
OH
O OH
GOD H2O
OH
OH
OH
OHO
O
OH
HOHOHO
H
H
H
H
H
H
H
H H
H
H
H
H
OH
OH
COOHOH
OH
β-D glucose D-glucono-δ-lactone Gluconic acid
GOD-FADH2 GOD-FAD
O2 H2O2
图 1 葡萄糖氧化酶酶促反应［4］
2013年第7期 13刘瑜等 ：黑曲霉葡萄糖氧化酶高产基因工程菌研究进展
variabile）［11］和软毛青霉（Penicillium puberulum）［12］
等，其中以黑曲霉最为重要。
2 黑曲霉 GOD 结构性质简介
黑曲霉 GOD 含有两个相同的亚基，两个亚基通
过两个二硫键相结合［13］，每个亚基含有一个紧密非
共价结合的 FAD 分子［14］。Swoboda 和 Massey［15］测
得相对分子质量为 18.6 kD，热变性或化学变性（8
mol/L 尿素）后测出每分子含有 1 个巯基和两个二
硫键，酶分子糖含量为 16.5%（±0.8%），如此高
的糖含量使得黑曲霉 GOD 具有很多不寻常的性质 ：
100℃时不发生沉淀 ；对 0.75% 的十二烷基硫酸钠
（SDS）稳定 ；5% 的三氯乙酸只能使其缓慢沉淀 ；
在水中的溶解度较高，需要较高浓度的盐才能沉淀
（80%-90% 硫酸铵）。Nakamura 和 Fujiki［16］测定其
含有的糖主要是甘露糖、葡萄糖和己糖胺。Kalisz
等［17］测得最适 pH5.5-6.0，且糖链对酶的结构、稳
定性和活力不起主要作用。1989 年，Kriechbaum 等［18］
首先克隆了黑曲霉 NRRL-3 的 GOD 基因，该基因由
1 815 个碱基对组成，编码一个亚基的 605 个氨基酸
残基。由于成熟的酶的一个亚基含有 584 个氨基酸
残基，因此确定有 21 个氨基酸残基组成了信号序
列。1993 年，Hecht 等［19］得到了分辨率为 2.3 Å 的
部分脱糖基的黑曲霉 GOD 晶体结构模型。1999 年，
Wohlfahrt 等［20］获得了黑曲霉 GOD1.9Å 的结构，从
结构上解释了酶对底物的专一性、D-葡萄烯糖的竞
争性抑制、卤素离子的抑制作用等性质。2011 年，
Kommoju 等［21］得到了该酶分辨率为 1.2Å 的结构，
并以氯离子代替氧探索了氧激活位点。
3 黑曲霉 GOD 生产进展
3.1 黑曲霉发酵生产GOD
黑曲霉发酵是传统的 GOD 生产方法，也是目
前为止被研究得最多的方法。近年来研究成果主要
有 ：Liu 等［22］利用台式生物反应器对黑曲霉发酵生
产 GOD 进行了响应面优化，并对菌丝体生长、GOD
的生产和葡萄糖的消耗进行了模拟，得到的模拟结
果能够较好地与试验结果吻合。 Mirón 等［23］研究了
碳源和氮源对黑曲霉发酵生产 GOD 的共同作用，着
重针对于 NP2 和 N2P 交互作用进行了因素试验，结
果表明无机氮源（硝基氮）比有机氮源（蛋白胨）
更适合产酶，有机氮源能够促进菌体生长而不利于
葡萄糖转化成葡萄糖酸 ；确定了最佳碳源和氮源比
例，使酶活从 1.8 U/mL 提高到 12 U/mL。Gera 等［24］
研究了葡萄糖、蔗糖和棉子糖对黑曲霉 NRRL326 产
酶的影响，表明蔗糖效果最好（4.5 U/mL），但当浓
度大于 20 g/L 时对产酶有明显的抑制作用。Bankar
等［25］分两步对产酶条件进行了优化，最终确定碳
酸钙、蛋白胨和硫酸镁为显著因素，并使酶活力从
0.009 93 U/mL 提高到了 2.05 U/mL，培养时间从 96
h 降低到 72 h。Khattab 和 Bazaraa［26］采用先诱变后
原生质体融合的方法以黑曲霉 FS-3（发酵液酶活力
15.9 U/mL）为出发菌株筛选高产菌株，得到了融合
子 C-18，胞外酶活力达 62.7 U/mL。
从以上资料可以看出，目前的研究集中于新菌
株的筛选以及方法的优化，并获得发酵过程中的动
力学模型。由于黑曲霉产酶不高，且大部分的酶存
在于细胞壁和胞内［27］；分离纯化困难，而且该方法
经过多年的研究，产量提高的潜力相当有限，因此
需要利用新的方法提高 GOD 的产量。
3.2 基因工程菌发酵生产GOD
利用基因工程的方法解决黑曲霉发酵产酶不高
的问题，策略有两种 ：第一是通过增加黑曲霉中的
GOD 基因的拷贝数来增加产量 ；第二是对 GOD 基
因进行异源表达，使基因摆脱原来调控系统的限制，
在人为构建的表达盒中得到高效的表达。
3.2.1 黑曲霉基因工程菌的构建与发酵 丝状真菌
被用来表达内源和外源蛋白具有以下优势 ：真菌能
够大量的分泌蛋白，可以避免蛋白在细胞内积聚可
能会对细胞造成毒害的问题。并且，由于其发酵技
术较为成熟，丝状真菌可以在廉价的培养基中大量
的生长，在优化的生长条件下，自身蛋白能达到较
高的分泌水平 ；另外，作为一种真核生物，其所具
有的翻译后加工机制在生产需要复杂翻译后修饰的
蛋白方面具有额外的优势。最后，很多重要的工业
丝状真菌如黑曲霉、米曲霉、里氏木霉、顶头孢霉
和产黄青霉本身为 GRAS 微生物，在生产药用蛋白
和食品用蛋白时具有良好的生物安全性［28］。
目前，在产 GOD 黑曲霉基因工程菌构建方面已
经完成的主要工作如表 1 所示。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第7期14
表 1 已报道的产 GOD 基因工程黑曲霉的构建
菌株名称 载体 改造前酶活力 改造后酶活力 参考文献
B60 pSHK101 2.3 U/mg（菌体蛋白抽提液） 13.8 U/mg（菌体蛋白抽提液） ［29］
NRRL-3（GOD 缺陷型） pSK+3 和 pAN7-1 共转化 0.117 U/mL（野生型菌株菌体抽
提液）
1.220 U/mL（诱变后的转化子的
菌体抽提液）
［30］
NRRL-3 pPp*4.13-GOD3 和 pAN7-1 共转化 摇瓶 ：19.2 μKat/L ；反应器 ：
20.8 μKat/L
摇瓶 ：22.2 μKat/L，反应器 ：
76.7 μKat/L
［31］
人们还对黑曲霉工程菌的培养做了很多研究工
作。 El-Enshas 等［32］ 研 究 了 NRRL-3（GOD3-18）
在摇瓶和搅拌罐式反应器培养时菌丝形态及其与
GOD 分泌之间的关系发现，小而致密的菌丝球有利
于 GOD 的分泌，推测原因是小的菌丝球有利于营养
物质的传递。摇瓶培养时形成的菌丝球明显分层并
中空，而搅拌罐式反应器中菌丝球的形成分为两步。
随后他又研究了非葡萄糖碳源对 NRRL-3（GOD3-18）
中 GpdA 启动子控制下 GOD 生产的影响，指出在
碳源为葡萄糖、果糖和木糖时，GpdA 启动子控制
下的 GOD 的合成同细胞生长严格耦联 ；在 5 L 搅拌
罐式反应器发酵 120 h 后，木糖作为碳源时 GOD 总
活力、比活力和胞外比例分别为 626.0 μKat/L、42.0
μKat/CDW（CDW ：细 胞 干 重 ） 和 87.0%， 优 于 或
接近使用葡萄糖为碳源的水平（234.0 μKat/L、48.0
μKat/CDW 和 89.0%），并且不形成葡萄糖酸［33］。
提高黑曲霉 GOD 基因的剂量能够使 GOD 表达
水平相对出发菌株有较大提高，但是最终效果同传
统菌种改造方法差别不大，对于工业应用缺乏足够
吸引力。其可能原因是丝状真菌表达系统不够成熟，
需要丝状真菌遗传学和细胞生物学理论的发展。
3.2.2 酿酒酵母表达黑曲霉 GOD 酿酒酵母是应用
最早的真核表达系统，其具有的一些特点使其成为表
达工业和医学所用外源蛋白的重要工具。首先，作
为一种公认安全的微生物，将其用于药物蛋白的生
产已为人们所高度接受。相比之下，大肠杆菌表达
的外源蛋白可能会含有内毒素，哺乳动物细胞可能
会含有致瘤或病毒 DNA。其次，酿酒酵母可以在简
单的培养基上快速的生长，并达到很高的细胞密度。
最后，其遗传学特性比其他任何真核生物的研究都
更加透彻，可以像大肠杆菌一样方便的进行操作。
酿酒酵母是第一种用于黑曲霉 GOD 外源表达的微生
物，早在 1990 年，Frederick 等［34］首先用酿酒酵母
GRF181 表达了黑曲霉 GOD 基因。已发表的以酿酒
酵母为黑曲霉 GOD 表达宿主的主要文献列于表 2。
为了提高酶的产量，很多学者对酿酒酵母基因
表 2 酿酒酵母表达黑曲霉葡萄糖氧化酶的研究概况
宿主菌株 载体类型 载体名称 培养 / 诱导时间 表达水平 参考文献
GRF181
附加体型
pSGO-2（ADH2-GPDp，GOD 基因自身 SP） 144 h 胞外蛋白量 ：>80 mg/mL ［34］
同上 pαGO-1（ADH2-GPDp，α-factor SP） 144 h 胞外蛋白量 ：>300 μg/mL 同上
DB1 pSHK7（α-factor SP） 3 d 胞外酶活 ：21.1 U/mL ［29］
GRF181 pSGO-2 8 d 240 U/mL（>80% 位于胞外） ［35］
2805 YEp352，（GOD 基因自身 SP ADH2-GPDp） 3 d 260 U/mL，诱变后可达 460 U/mL ［36］
同上 YEp352（GOD 基因自身 SP，GPDp） — 发酵液比活力 ：22.6 U/mL ［37］
PMR1 缺失的 L3262a pGalGO2（GAL10p，A. niger α-amylase SP） 48 h 胞外酶活 ：>10.0 U/mL ［38］
Σ1278
整合型
pGOXi（PGK1p，α-factor SP，构建自 YIp5） <6 h 胞外酶活 ：110 U/mL ［39］
CECT1645 pBT39（TEFp，α-factor SP） 24 h 发酵液比活力 ：40-45 U/mg ［40］
ADH2-GPDp、GPDp、GAL10p、PGK1p 和 TEFp 均为酿酒酵母启动子，分别为 ：醇脱氢酶Ⅱ -甘油醛 -3-磷酸脱氢酶杂合启动子、甘油醛 -3-磷酸脱氢酶启动子、
UDP-半乳糖 -4-差向异构酶启动子、磷酸甘油酸激酶启动子、翻译延伸因子启动子 ；SP ：信号肽。“—”表示原参考文献中未写明
工程菌的培养进行了详细研究。从 1998 年 -2001
年，Kapat 等［41-44］连续发表了 4 篇论文探讨产黑曲
霉 GOD 基因工程酿酒酵母培养的问题。在首先发表
的论文中研究了不同的补糖（包括葡萄糖和半乳糖）
策略对重组酿酒酵母产 GOD 的影响，恒速流加半乳
糖的策略下产酶达到最高，达 154 U/mL，比分批式
2013年第7期 15刘瑜等 ：黑曲霉葡萄糖氧化酶高产基因工程菌研究进展
操作提高了 52%［41］。之后运用恒定 pH 反馈补料分
批式发酵策略使胞外酶活力提高到了 199 U/mL，比
普通分批式发酵提高了 1 倍多，比非反馈控制的补
料分批式发酵（154 U/mL）提高了 28%［44］。随后他
们的试验证实了连续补加半乳糖不适合重组黑曲霉
GOD 发酵 ：虽然 96 h 后酶活力达到 164 U/mL，但
是会形成过量的乙醇，并且还会造成表达载体的不
稳定［43］。2001 年发表的论文中，他们虽然证明了
搅拌速率对酶产量有直接的作用，但是建立 kLa 与
酶产量之间的关系的工作没有成功［42］。
综合上述文献，有两点需要引起注意 ：第一，
使用 GOD 本身的信号肽序列可以取很高的分泌水
平，甚至比常用的分泌效率已经很强的强酿酒酵母
α-factor 信号肽序列更高［34］；第二，不同的酿酒酵
母作为表达宿主时表达水平相差很大，De Baetselier
等［45］在其论文中也指出，在利用相同的表达载体
表达相同的黑曲霉 GOD 基因时，不同的酿酒酵母菌
株表达水平高者和低者可相差百倍。随着将来对这
些现象内在机制的深入研究，必将使得人们对外源
蛋白的表达机制的认识得到进一步的深化。
同其他主要表达体系相比，使用酿酒酵母进行
表达虽然是较早的方法，但是取得的效果较新兴的
表达体系相差并不很多［36，46，47］，其原因有待深入
探讨 ；酿酒酵母为 GRAS 生物，重组酶的生物安全
性也较好。缺点在于目前大部分采用的均为附加体
载体，这种载体的优点是拷贝数高，但是在发酵过
程中容易丢失，造成菌种生产性能的不稳定。整合
型载体稳定性好，但是目前表达水平还不尽如人意。
3.2.3 巴斯德毕赤酵母表达黑曲霉 GOD 巴斯德毕
赤酵母是一种成熟的真核微生物外源蛋白表达平台，
具有以下特点［48］：生长迅速并培养廉价 ；作为一
种真核生物，具备翻译后蛋白加工能力，在酵母中
合成的蛋白质更有可能正确的加工、折叠与正确的
组装成具有功能的分子。同酿酒酵母和其他酵母相
比，毕赤酵母不倾向于发酵糖和其他碳源，而更倾
向于利用它们进行有氧呼吸生长，这极大地有利于
高细胞培养 ：因为它只是简单的把碳源转化成生物
量，不产生大量的有毒的发酵产物，如乙醇。重组
蛋白的产量通常同生物量成比例，因此巴斯德毕赤
酵母易于进行高密度培养是一个主要的优势。另外，
巴斯德毕赤酵母能够以甲醇为唯一碳源和能源进行
生长，在这种条件下，醇脱氢酶（AOX）和二羟丙
酮合酶（DHAS）可以占细胞蛋白的近 30%，并且这
两种蛋白的水平的调控主要是在转录水平上的，因
此使用其启动子可以驱使外源基因得到较高水平的
表达。近年来关于利用巴斯德毕赤酵母表达黑曲霉
GOD 的主要报道，如表 3 所示。
毕赤酵母表达黑曲霉 GOD 在发酵罐中可以达到
表 3 巴斯德毕赤酵母表达黑曲霉葡萄糖氧化酶的研究概况
宿主菌株 载体类型 载体名称 诱导 / 培养时间 表达水平 比活力 重组酶的其他性质 参考文献
GS115 甲醇诱导
型（AOX1p，
α-factor SP）
pPIC9 3-4 d 摇瓶 ：30-40 U/mL 426.63 U/mg Km=38.25 mmol/L ；kcat=3492.66 s
-1 ［49］
（均高于商品酶）
— — — Km=41.80 mmol/L ［5，50］
kcat= 831.76 s
-1（与商品酶相当）
pPIC9K 7 d 摇瓶 ：17.35 U/mL 305.13 U/mg Km=38.04 mmol/L ［51］
Vmax=37.88 mmol/L
SMD1168 pPICZαA 摇瓶 ：7 d 摇瓶 ：近 40 U/mL 153.46 U/mg Km= 16.95 mmol/L， ［46，47］
发酵罐 ：130 h 发酵罐 ：522.5 U/mL kcat= 484.26 s
-1
X-33 组成型（GAPp， pGAPZαC 240-600 h 摇瓶 ：0.83-1.62 U/mL — — ［52］
α-factor SP）
AOX1p 和 GAPp 分别为巴斯德毕赤酵母醇氧化酶启动子和甘油醛 -3-磷酸脱氢酶启动子 ；“—”表示原参考文献中未写明。
很高水平［46］，但在摇瓶中表达水平不高，这是由于
毕赤酵母本身的特性所致［48］。在某些情形下，重组
酶的特性还有所改善，如周亚凤［49］报道重组 GOD
的比活、转换数 kcat 值及二级动力学常数 kcat /Km
比活明显地高于商品酶，黄亮［51］报道重组酶最适
温度较黑曲霉 GOD 提高了 8℃。但是，巴斯德毕赤
酵母为宿主表达黑曲霉 GOD 也还存在一些缺点 ：首
先是巴斯德毕赤酵母本身不属于美国食品药品管理
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第7期16
局（FDA）所认证的 GRAS 微生物，表达的重组酶
存在生物安全性问题，限制了在食品方面的应用 ；
其次，诱导型表达过程中需要甲醇诱导，而甲醇是
有毒易燃品，不但给生产人员的安全和消防安全带
来隐患，而且在酶的分离纯化过程中带来额外的麻
烦，特别是将 GOD 用作食品添加剂时。组成型表达
可以避免这个问题，但是酶活力很低［52］。因此将巴
斯德毕赤酵母表达系统应用于黑曲霉 GOD 的工业化
生产还存在很多问题亟待解决。酿酒酵母和巴斯德
毕赤酵母在表达黑曲霉 GOD 方面的比较如表 4 所示。
3.2.4 其他表达系统在表达黑曲霉 GOD 其他表达
系统在黑曲霉 GOD 表达方面应用的不多。安玉麟
表 4 表达黑曲霉 GOD 酿酒酵母和巴斯德毕赤酵母基因工程菌的比较
表达系统 表达水平 培养时间 工程菌稳定性 生物安全性
酿酒酵母 报道最高 ：460 U/mL 诱导型表达较长，
组成型表达较短
附加体载体表达水平高但不稳定，整合
性表达稳定性较好，但表达水平较低
GRAS 微生物，安全，
巴斯德毕赤酵母 报道最高 ：522.5 U/mL 较长 好 非 GRAS 微生物，不安全
等［53］用原核生物大肠杆菌表达了黑曲霉酶 GOD，
得到的转化子的总蛋白同抗黑曲霉 GOD 血清有较强
的免疫反应。在真核表达方面，Whittington 等［29］通
过基因工程手段使不产 GOD 的构巢曲霉显著的表达
了黑曲霉 GOD。Hodgkins 等［54］使用多型汉逊酵母
表达了黑曲霉 GOD，胞外酶活力达到 445 U/mL（2.25
g/mL），胞内酶活为 76 U/mL（0.38 g/mL），达到了
很高的水平。2006 年，母敬郁等［55］以瑞氏木霉为
宿主进行表达，诱导 5 d 后酶活为 25 U/mL。2010 年，
Rocha［56］发表了以马克斯克鲁维酵母表达 GOD 的
结果，当以附加体表达系统表达时，胞外酶活最高
为 1 552 U/g DCW（DCW ：Dry Cell Weight）。同年，
Dowdells 等［57］在土曲霉中表达了黑曲霉 GOD，并
用转化子进行葡萄糖糖酸的生产。
3.2.5 黑曲霉 GOD 基因的改造 定向进化已经成
为获得高效生物催化剂的重要手段，其主要原理是
向蛋白编码基因中引入随机突变并利用高通量筛选
手段筛选蛋白突变体，进而选择出其对应的编码序
列以进行下一步的突变与筛选，不断的重复这一过
程使得有益突变得到积累。定向进化的过程由几个
步骤循环进行 ：产生随机的基因文库 ；在适宜的宿
主中表达 ；筛选突变酶的文库，寻求具有感兴趣的
性质的突变体［58］。手段有 DNA shuffling［59］，易错
PCR［60］和交错延伸过程［61］等。
刘丹等［62］通过两轮易错 PCR，从 3 000 多个
突变子中得到 3 个酶活提高的突变株，成功使比活
力提高到原来的 3-4 倍。Prodanovic 等［63］ 采 用 超
高通量筛选从含有 105 个突变体的 107 个细胞中得
到催化活力提高 2 倍的突变体 K150R。Yu 等［64］利
用定向进化的手段得到了更适用于酶电极的突变体
B11-Gox。Holland 等［65］通过对黑曲霉 GOD 基因进
行饱和突变发现，当 132 位的苏氨酸突变成丝氨酸
时，特异性常数 kcat/Km 从 8.39 mmol/L/S 变为 23.8
mmol/L/s，同时对底物亲和力仅仅降低了 3%。对于
GOD 的定向进化还处于起步阶段，发展潜力很大。
4 展望
4.1 深入研究宿主蛋白表达分泌机制，通过基因
工程手段改良现有表达系统
不同的表达系统表达黑曲霉 GOD 的水平的差
别相当大［31，36，47，54，55］，并且用相同的载体转化同
一种生物的不同菌株，得到的外源蛋白的表达水平
也有相当大的差别［45］，宿主细胞蛋白表达与分泌
机制的不同是导致该结果的重要的原因。目前，一
些主要的外源蛋白表达宿主均已经完成了基因组测
序［66-69］，对这些微生物的蛋白表达、加工、分泌机
制的研究也在进一步的深入。通过对微生物原有分
泌表达机器的改造，可以获得更适用于蛋白生产的
菌株。因此，需要从基因组水平乃至蛋白质组水平
对外源蛋白分泌表达机制深入的进行研究，并以分
子生物学操作获得更合适的宿主菌株，使现在发展
较成熟的表达系统得到进一步的发展。
4.2 开发新型表达载体与宿主
开发新型的表达载体和宿主也是解决外源蛋
白表达水平不高的有效途径。为了解决附加体载体
2013年第7期 17刘瑜等 ：黑曲霉葡萄糖氧化酶高产基因工程菌研究进展
的不稳定性和整合型载体拷贝数少的问题，Lopes
等［70， 71］开发了 rDNA 整合型载体，每个细胞中整合
的拷贝数可达 100-200 个，并且具有相当的稳定性。
4.3 蛋白质定向进化
通过高通量筛选突变体，积累有益突变，可以
得到比活力更高的酶，或者具有其他优良特性的酶，
加强酶的耐热性、稳定性等。
4.4 过程优化
包括诱导剂［43］、过程条件［42］、培养基成分［33］等。
通过这些可以增加酶产量，促进酶的分泌［32］，降低
工程菌自身的蛋白酶活性［72］等。另外，反应器培
养时表达水平有可能与摇瓶不同，因此在放大过程
中也需要进一步的优化条件［72］。
参 考 文 献
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（责任编辑 狄艳红）