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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第8期
随着世界上许多国家限制或禁止对抗生素的使
用，抗生素作为饲料添加剂的时代即将过去，益生
菌是最先被提出的替代品［1］。益生菌（Probiotic）
是通过改善宿主肠道菌群生态平衡而发挥有益作用，
达到提高宿主（人和动物）健康水平和健康佳态的
活菌制剂及其代谢产物［2］。布拉德酵母菌主要有强
收稿日期 ：2013-01-10
基金项目 ：国家高技术研究发展计划（“863”计划）（SQ2010AA02222655001）
作者简介 ：孙红梅，女，硕士研究生，研究方向 ：微生物酶技术 ；E-mail ：sunhongmei1221@163.com
通讯作者 ：王瑞明，男，教授，博士生导师，研究方向 ：微生物酶技术 ；E-mail ：ruiming3k@163.com
三种潜在饲料益生菌耐受性及拮抗病原菌研究
孙红梅  王腾飞  李丕武  唐卫华  曲丽娜  王瑞明
（山东轻工业学院 山东省微生物工程重点实验室，济南 250353）
摘 要 ： 旨在研究布拉德酵母菌、地衣芽孢杆菌和植物乳杆菌 3 种潜在饲料益生菌在酸性和胆盐环境下的耐受性，与大肠
杆菌和金黄色葡萄球菌两种病原菌作用，观察 3 种潜在益生菌拮抗病原菌能力。将 3 种益生菌的细胞洗涤液悬浮于 pH1.0、2.0、
3.0、4.0、5.0 和猪胆盐浓度分别为 0%、0.05%、0.1%、0.2% 和 0.3%（W/V）的生理盐水中，分别作用 0、1、2、3 和 4 h，然后将
3 种潜在益生菌分别与两种病原菌 37℃静置共培养 4 h，用平板菌落计数法活菌计数。结果显示，植物乳杆菌耐酸性最明显，地衣
芽孢杆菌和布拉德酵母菌也具有较好的耐酸性。地衣芽孢杆菌耐胆盐最明显，植物乳杆菌和布拉德酵母菌也具有较好的耐胆盐性。
3 种菌株对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有一定的抑制率。3 种潜在益生菌对仔猪消化道内的酸性环境及胆盐浓度具有一定的耐受
性，并且有可能通过拮抗病原菌的作用对仔猪产生益生作用。
关键词 ： 益生菌 耐酸性 耐胆盐浓度 拮抗
Tolerance of Three Potentially Piglets Feed Probiotic and
Antagonistic Pathogens Research
Sun Hongmei Wang Tengfei Li Piwu Tang Weihua Qu Lina Wang Ruiming
（The Shandong Province Microbial Engineering Laboratory，Shandong Polytechnic University，Ji’nan 250353）
Abstract:  It was to investigate the viability of Saccharomyces boulardii, Bacillus licheniformis and Lactobacillus plantarum in the
acidic and bile salts conditions, three potentially probiotic role with the two pathogens E. coli and Staphylococcus aureus verify three probiotic
antagonistic pathogens ability. The acidic and Bile salts conditions tolerance of the three potentially probiotic were determined by exposing
washed cell suspensions to acidic conditions（pH1.0, 2.0, 3.0, 4.0 and 5.0）and different bile salts concentration［0%, 0.05%, 0.1%, 0.2%, 0.3%
（W/V）］of physiological saline for 1, 2, 3 and 4 hours, reseparately, then three potentially probiotic separately with two pathogens 37℃ static
co-culture 4 h, plate colony counting method for the determination of the probiotic viable cells. Result showed that Lactobacillus plantarum acid
resistance is the most obvious, the Saccharomyces boulardii and Bacillus licheniformis also has good acid resistance. Bacillus licheniformis bile
salts tolerance is the most obvious, the Lactobacillus plantarum and Saccharomyces boulardii also has good resistance to bile salts. These studies
suggested that the three potentially feed probiotic have certain acid and bile tolerance capacity, possibly have a prebiotic effect in piglets role by
antagonizing pathogens.
Key words:  Probiotics Acid resistance Concentration of bile tolerance Antagonistic
化肠黏膜组织和释放 B 族维生素等营养物质，提高
动物的营养素的吸收和利用，减少营养性腹泻，提
高生长速度，调节机体局部免疫功能来抵抗病毒的
侵袭等功能［3］。乳酸菌，特别是乳杆菌，是定植在
人和动物胃肠道的微生物类群中最多、最重要的一
种，主要有拮抗病原微生物，调节动物消化道微生
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第8期156
物区系平衡，活化免疫系统，增强免疫力等功能［4，5］。
芽孢杆菌具有抑制其它外来病原微生物在胃肠道内
的定植或增殖的作用，并且具有较强的蛋白酶、脂
肪酶和淀粉酶的活性［6］。仔猪因肠道内尚未建立稳
定的微生态系统，易受各种病原微生物的侵袭导致
仔猪腹泻，仔猪腹泻容易引起仔猪死亡，严重降低
了养猪生产者经济效益，益生菌在预防和治疗仔猪
腹泻中以其安全、无副作用、效果好的特点受到越
来越多的青睐。若要使益生菌充分发挥其有益作用，
必须保证其在肠道内的存活率，通过耐酸、耐胆盐
试验及拮抗病原菌试验研究，验证 3 种潜在益生菌
的耐受性及对病原菌的拮抗作用，为 3 种潜在益生
菌在饲料生产实践中的推广和应用提供诸多理论
依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试 验 菌 种 布 拉 德 酵 母 菌（Saccharomyces
boulardii）， 地 衣 芽 孢 杆 菌（Bacillus licheniformis），
植 物 乳 杆 菌（Lactobacillus plantarum）， 大 肠 杆 菌
（Escherichia coli），金黄色葡萄球菌（Staphyloccocus
aureus），以上菌株均为山东省微生物工程重点实验
室保藏。
1.1.2 试验用培养基 MRS 培养基 ：葡萄糖 2%，
蛋白胨 1%，牛肉膏 1%，酵母提取物 0.5%，柠檬酸
二胺 0.2%，磷酸氢二钾 0.2%，MgSO4·7H2O 0.058%，
MnSO4·H2O 0.025%，吐温 80 1 mL/L，乙酸钠 0.5%，
pH6.8。
沙氏培养基 ：葡萄糖 2%，蛋白胨 1%，pH5.5。
LB 培养基：蛋白胨 1%，NaCl 1%，酵母粉 0.5%，
pH7.5。
高浓度盐水营养肉汤培养基 ：蛋白胨 1%，牛
肉膏 1%，酵母膏 0.03%，NaCl 7.5%，pH7.2。
伊红美兰培养基 ：蛋白胨 1%，乳糖 1%，磷酸
氢二钾 0.2%，2% 伊红溶液 2%，0.5% 美兰溶液 2%。
上述培养基均 121℃、20 min 灭菌。
1.2 方法
1.2.1 菌液的制备 将斜面上的地衣芽孢杆菌接
种于无菌 LB 培养基中，37℃培养 8-12 h 备用 ；将
穿刺培养的乳酸菌分别接种于无菌 MRS 培养基中，
37℃静置培养 18-24 h 备用 ；将斜面上的布拉德酵
母菌接种于无菌沙氏培养基中，30℃培养 24-30 h
备用；将斜面上的大肠杆菌接种于无菌 LB 培养基中，
37℃培养 8-12 h 备用 ；将斜面上的金黄色葡萄球菌
接种于无菌 LB 培养基中，37℃培养 12-24 h 备用。
1.2.2 耐酸性试验 配置 pH 值 1.0、2.0、3.0、4.0 和
5.0 的无菌生理盐水，取上述制备好的布拉德酵母菌
液 1 mL，在 pH 值 1.0、2.0、3.0、4.0 和 5.0 的无菌
生理盐水中稀释 100 倍。将稀释液放入恒温培养箱
中静置 1、2、3 和 4 h。到时间取出的稀释液用无菌
的生理盐水进行十进制的梯度稀释，利用平板菌落
计数法计数。试验重复 3 次。地衣芽孢杆菌和植物
乳杆菌的测定方法同上。
1.2.3 耐胆盐浓度试验 配置胆盐浓度分别为 0%、
0.05%、0.1%、0.2% 和 0.3%（W/V）的无菌生理盐
水，取上述制备好的布拉德酵母菌液 1 mL，在胆盐
浓度分别为 0%、0.05%、0.1%、0.2% 和 0.3%（W/V）
的无菌生理盐水中稀释 100 倍。将稀释液放入恒温
培养箱中静置培养 0、1、2、3 和 4 h。到时间取出
的稀释液用无菌的生理盐水进行十进制的梯度稀释，
利用平板菌落计数法计数。试验重复 3 次。地衣芽
孢杆菌和植物乳杆菌的测定方法同上。
1.2.4 拮抗病原菌试验 各取制备好的 3 种益生菌
和金黄色葡萄球菌菌液 1 mL 在 4℃，5 000 r/min 离
心条件下离心 10 min，菌体用无菌的生理盐水冲洗，
然后将 3 种益生菌菌体分别与两种病原菌混合悬浮
在无菌的生理盐水中。37℃静置培养 4 h，取样，用
平板菌落计数法活菌计数。菌落计数培养基用无菌
高浓度盐水营养肉汤培养基。试验重复 3 次。拮抗
大肠杆菌测定方法同上。菌落计数培养基用无菌伊
红美兰培养基。
1.2.5 试验数据处理 将 3 次平行试验所得数据取
平均值。
2 结果
2.1 耐酸性试验结果
布拉德酵母菌、地衣芽孢杆菌和植物乳杆菌在
处理前的存活数（log CFU/mL）分别为 8.10、8.60
和 9.49，图 1-图3 显示，当 pH 为 4.0 和 5.0 时，布
拉德酵母菌、地衣芽孢杆菌和植物乳杆菌的存活数
2013年第8期 157孙红梅等 ：三种潜在饲料益生菌耐受性及拮抗病原菌研究
在培养至 4 h 均没有明显下降 ；当 pH 为 3.0 时，植
物乳杆菌的存活数没有明显下降，布拉德酵母菌
菌株稀释液经过 2 h 培养后，存活数为处理前的
57.4%，随着时间的推移，菌株数量明显下降。地衣
芽孢杆菌菌株稀释液经过 3 h 培养后，存活数为处
理前的 64%，随着时间的推移，菌株数量明显下降，
但仍有一定的菌株存活 ；当 pH 值为 1.0 和 2.0 时，
3 种潜在益生菌菌株稀释液经过 1、2、3 和 4 h 培养后，
菌株数量有明显下降，但仍有一定量的菌株存活。
降，但仍有一定数量的存活数。
2.3 拮抗病原菌试验结果
由图 7 和图 8 可见，布拉德酵母菌对大肠杆菌
和金黄色葡萄球菌的抑制作用较强，其中布拉德酵
母菌对大肠杆菌的抑制率达到 75.9%，对金黄色葡
萄球菌的抑制率达到 61.3% ；地衣芽孢杆菌对金黄
色葡萄球菌的抑制作用较强，抑制率达到 72.3%，
对大肠杆菌的抑制作用较弱，抑制率仅为 56.4% ；
植物乳酸菌对大肠杆菌的抑制作用较强，抑制率达
到 63.1%，对金黄色葡萄球菌的抑制率仅为 41.8%。
3 讨论
饲料益生菌饲喂断奶仔猪，若想发挥其益生作
用，必须经受断奶仔猪胃内的酸性环境和消化系统
中一定的胆盐浓度，才能在肠道内存活并发挥其有
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pH2.0
pH3.0
pH4.0
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pH2.0
pH3.0
pH4.0
pH5.0
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图 1 布拉德酵母菌在不同 pH 生理盐水中培养的存活数
图 2 地衣芽孢杆菌不同 pH 生理盐水中培养的存活数
图 3 植物乳杆菌不同 pH 生理盐水中培养的存活数
2.2 耐胆盐浓度试验结果
由图 4-图6 可见，当猪胆盐浓度分别为 0.05%
和 0.1%（W/V）时，布拉德酵母菌、地衣芽孢杆菌
和植物乳杆菌的存活数没有明显下降 ；当胆盐浓度
为 0.2% 和 0.3%（W/V）时，地衣芽孢杆菌和植物
乳杆菌的存活数与猪胆盐浓度为 0% 相比，存活数
没有明显下降，布拉德酵母菌的存活数有一定的下
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图 4 布拉德酵母菌在不同胆盐浓度（W/V）生理盐水中培
养的存活数
图 5 地衣芽孢杆菌在不同胆盐浓度（W/V）生理盐水中培
养的存活数
图 6 植物乳杆菌在不同胆盐浓度（W/V）生理盐水中培养
的存活数
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第8期158
益作用［7］。由于断奶仔猪体内胃肠道消化环境中，
胃酸的 pH 值约为 3.0-6.0，食物通过胃的时间相对
较短，一般为 1 h 左右，且存在一定浓度的胆盐，
猪消化道中胆盐含量约为 0.03%-0.3%，因此有些益
生菌进入消化道后，不能有效地抵抗胃酸、胆盐的
作用，无法到达肠道或定植肠道而发挥有益作用［8］，
成为目前饲用益生菌仍存在的问题，针对这些问题，
研究工作者应进一步选育生产性能高、耐受性强的
菌种。
本试验体外模拟仔猪消化道酸性和胆盐环境，
研究的 3 种潜在益生菌对酸及胆盐均具有较好的耐
受性。布拉德酵母菌由于其特殊的外壁结构而对酸
性和胆盐环境都有较好的耐受性。植物乳杆菌为以
乳酸为唯一或主要代谢产物的细菌，故对酸性环境
十分适应，当 pH 为 3.0 时，植物乳杆菌的存活数
都没有明显下降。地衣芽孢杆菌是兼性厌氧菌，它
在一定条件下能产生抗逆性内生孢子，是具有应用
潜力的菌种之一，本研究与 Cenci［9］和董尚智等［10］
的研究都发现，地衣芽孢杆菌具有良好的耐酸性。
地衣芽孢杆菌属于耐胆盐菌株，这与董尚智的结果
基本一致，主要是芽孢杆菌的芽孢衣可维持芽孢膜
的表面张力，使芽孢杆菌对胆盐表现出较强的耐
受性。
断奶仔猪腹泻疾病史饲养过程中常见病，其中
病原微生物的侵袭导致的腹泻给养猪业造成了较高
的经济损失，可引起仔猪腹泻的病原微生物主要有
大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、伤寒杆菌等。
试验选用两种病原微生物即大肠杆菌和金黄色葡萄
球菌，初步验证 3 种潜在饲料益生菌对两种病原菌
均有一定的拮抗作用，其中布拉德酵母菌可抑制病
原微生物的繁殖，对大肠杆菌的抑制率达到 75.9%。
目前，芽孢杆菌的抑菌作用主要认为是在生长代谢
过程中能产生蛋白多肽类抗菌物质和大量的溶菌酶，
直接抑制病原菌的生长繁殖，地衣芽孢杆菌对大肠
杆菌和金黄色葡萄球菌都有明显的抑制作用，对金
黄色葡萄球菌的抑制率达到 72.3%，此次研究与王
美秀［11］和来航线［12］的结果基本一致。乳酸菌的抑
菌作用主要认为是能够分解糖类产生乳酸，降低环
境 pH 值，产生细菌素抑制或杀死病原菌，植物乳
杆菌对大肠杆菌的抑制率达到 63.1%。本次研究为 3
种菌株作为益生菌提供了一定的理论依据。
初步验证试验用 3 种潜在益生菌可以耐受仔猪
消化道内的酸性环境及胆盐浓度，并且有可能通过
拮抗病原菌的作用对仔猪产生益生作用，为 3 种菌
株作为仔猪饲料益生菌提供了部分试验依据和潜力。
4 结论
当 pH 为 3.0 时，植物乳杆菌经过 4 h 培养后存
活数没有明显下降 ；当 pH 为 4.0 和 5.0 时，布拉德
酵母菌、地衣芽孢杆菌和植物乳杆菌的存活数经 4 h
培养，均没有明显下降。当胆盐浓度为 0.2% 和 0.3%
（W/V）时，地衣芽孢杆菌和植物乳杆菌的存活数没
有明显下降。布拉德酵母菌对大肠杆菌的抑制率达
到 75.9%，地衣芽孢杆菌对金黄色葡萄球菌的抑制
率达到 72.3%，植物乳杆菌对大肠杆菌的抑制率达
到 63.1%。
参 考 文 献
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图 7 三种潜在益生菌对大肠杆菌的抑制率
图 8 三种潜在益生菌对金黄色葡萄球菌的抑制率
2013年第8期 159孙红梅等 ：三种潜在饲料益生菌耐受性及拮抗病原菌研究
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（责任编辑 马鑫）