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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第6期
纤维素是地球上最丰富的碳水化合物，能被纤
维素酶最终降解为葡萄糖，可以作为能源、食品和
化学原料生产中的一个重要资源［1］。β-葡萄糖苷酶
是纤维素降解酶系的重要组分之一，在纤维素降解
中起着非常重要的作用［2］。在纤维素酶水解过程中
将各种寡糖及纤维二糖降解为葡萄糖，对纤维素糖
收稿日期 ：2012-11-23
基金项目 ：天津科委真菌 -淀粉酶高温活性改造（102CKFSY06200），天津市工业微生物基因组解析（11ZCZDSY08300）
作者简介 ：于海玲，女，硕士研究生，研究方向 ：生物化学与分子生物学 ；E-mail ：472097056@qq.com
通讯作者 ： 李树伟，博士，教授，硕士生导师，研究方向 ：生物化学与分子生物学 ；E-mail ：xj_lsw@126.com
王华明，博士，教授，博士生导师，研究方向 ：蛋白质表达，新型工业酶及表达系统 ；E-mail ：wang_hm@tib.cas.cn
葡萄穗霉中 β-葡萄糖苷酶的基因克隆、表达及
酶学性质分析
于海玲1，2，4  李树伟1，2  王华明3，4
（1. 新疆塔里木大学 新疆生产建设兵团塔里木盆地生物资源保护利用重点实验室，阿拉尔 843300 ；2. 新疆塔里木大学生命科学
学院，阿拉尔 843300 ；3. 工业酶国家工程实验室，天津 300308 ；4. 中国科学院天津工业技术研究所，天津 300308）
摘 要 ： 以黑曲霉（Aspergillus niger）G1 为宿主菌表达葡萄穗霉（Stachybotrys chartarum）β-葡萄糖苷酶。对葡萄穗霉进行
全基因组分析得到编码 β-葡萄糖苷酶的基因，设计引物，通过 PCR 扩增得到 g10158，将其克隆到载体 pGm 上，并转化到黑曲霉
G1 中，经 amdS 二次平板筛选，PCR 方法验证，获得高效表达该基因的生物工程菌株 G1-pGm-g10158-13。SDS-PAGE 检测结果显示，
表达蛋白的分子大小为 87.9 kD，阴性对照中无此条带。粗酶液酶学性质表明，该 β-葡萄糖苷酶的最适反应温度为 50℃，最适 pH
为 4.8。在最适 pH 和最适温度下，粗酶液活性达 1 856.48 U/mL。葡萄穗霉 β-葡萄糖苷酶在黑曲霉 G1 中可表达，并具有较高的活性。
关键词 ： β-葡萄糖苷酶 葡萄穗霉 黑曲霉 G1 原核表达
Cloning，Expression and Characterization of β-glucosidase from
Stachybotrys chartarum
Yu Hailing1，2，4 Li Shuwei1，2 Wang Huaming3，4
（1. Xinjiang Production & Construction Corps，Key Laboratory of Protection and Utilization of Biological Resources in Tarim Basin，Tarim
University，Alar 843300 ；2. College of Life Science，Tarim University，Alar 843300 ；3. National Engineering Laboratory for Industrial
Enzymes，Tianjin 300308 ；4. Tianjin Institute of Industrial Biotechnology，Chinese Academy of Sciences，Tianjin 300308）
Abstract:  To express β-glucosidase from Stachybotrys chartarum using Aspergillus niger G1 as host. Through genome sequencing and
analysis, the β-glucosidase gene（g10158）was isolated from the genome of Stachybotrys chartarum through PCR. The coding region of the gene
was inserted to the vector pGm. The expression plasmid was transformed into A. niger G1 strain. An β-glucosidase producing strain（G1-pGm-
g10158-13）were selected after screening several transformants using amdS selection plates and confirmed by PCR validation. Results showed
that the molecular mass of the enzyme was 87.9 kD by SDS-PAGE gel analysis. Our results indicated that the recombinant enzyme exhibited
optimum activity at pH4.8 and 50℃. The β-glucosidase activity was 1 856.48 U/mL under the optimized conditions. The β-glucosidase from
Stachybotrys chartarum was expressed in A. niger G1 strain and it was proved to have a high activity.
Key words:  β-Glucosidase Stachybotrys chartarum Aspergillus niger G1 Prokaryotic expression
化水解具有关键性作用。因此对于 β-葡萄糖苷酶的
深入研究越来越引起人们的关注。
目前关于 β-葡萄糖苷酶的研究主要集中在微生
物上［3］，已有上百种微生物的 β-葡萄糖苷酶基因
得到克隆，许多微生物来源的 β-葡萄糖苷酶基因已
获得异源表达［4，5］。真菌中目前研究得较多的是酵
2013年第6期 129于海玲等 ：葡萄穗霉中 β-葡萄糖苷酶的基因克隆、表达及酶学性质分析
母、 木 霉 属（Trichoderma） 和 曲 霉 属（Aspergillus）
等霉菌［6-13］。细菌中研究较多的是芽孢杆菌属［14］。
对葡萄穗霉（Stachybotrys chartarum）的研究较少，
Amouri 等［15，16］ 对葡萄穗霉中的 β-葡萄糖苷酶直
接进行了酶活性的测定，β-葡萄糖苷酶的活力为 78
U/mg。到目前为止，尚未有关于葡萄穗霉中 β-葡萄
糖苷酶基因在黑曲霉中表达的研究报道。研究发现，
不同来源的 β-木糖苷酶存在作用效果上的差异而纸
状葡萄穗霉具有嗜纤维性，已报道的其所产纤维素
酶具有较宽的 pH 适应性，并且对于碱性条件也有
较好的耐受性。本研究对葡萄穗霉进行全基因组分
析得到编码 β-葡萄糖苷酶的基因，并将该基因插入
到载体 pGm 中，将重组表达载体 pGm-g10158，转
化黑曲霉 G1，筛选得到高效表达 β-葡萄糖苷酶基因
的生物工程菌株。测定所产 β-葡萄糖苷酶粗酶液活
力，旨在为进一步利用和开发 β-葡萄糖苷酶、解析
其结构与功能关系奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株和质粒 葡萄穗霉购自中国微生物菌种
保管委员会普通微生物中心，CGMCC3.5365 ；大肠
杆 菌（Trans5α Chemically Competent Cell） 购 自 北
京全式金生物技术有限公司 ；黑曲霉（Aspergillus
niger）G1 和穿梭载体 pGm 为本实验室保藏。
1.1.2 酶和试剂 限制性内切酶、T4 DNA 连接酶、
DNA 聚合酶、Fungal DNA Kit 购自 OMEGA bio-tek ；
PCR 产物回收试剂盒、胶回收试剂盒和质粒小提
试 剂 盒 均 购 自 Fermentas ；SDS-PAGE 凝 胶 制 备 试
剂盒和 BCA 蛋白浓度测定试剂盒购自北京索莱宝
（Solarbio）科技有限公司 ；PCR 引物合成及序列测
定由北京博尚生物技术有限公司 ；对-硝基苯酚-β-D-
葡 萄 糖 苷（pNPG） 和对-硝 基 苯 酚（p-nitrophenol）
购自 Sigma 公司 ；其它生化试剂为国产分析纯。
1.1.3 培养基 LB、CMA、CMC、amdS 乙酰胺选择
培养基［17］及 Promosoy special medium 产酶培养基。
1.2 方法
1.2.1 β-葡萄糖苷酶基因在葡萄穗霉全基因组上的
挖掘 通过对葡萄穗霉全基因组（该基因组已由
编号为 11ZCZDSY08300 的天津市工业微生物基因
组解析项目完成测序，序列暂未公开）进行比较基
因组学的研究，挑选出具有 β-葡萄糖苷酶活性的
g10158 基因。用 DNAStar 软件预测该蛋白质的理
论分子量大小，SignaIP 分析信号肽。GLU10158 同
来源于 Aspergillus flavus NRRL3357 的 β-葡萄糖苷酶
（GenBank 索引号为 EED48455.1）进行同源性分析。
1.2.2 g10158 基因的克隆及表达
1.2.2.1 葡萄穗霉基因组 DNA 的提取 在 CMA 液
体培养基中接种葡萄穗霉，于 30℃，200 r/min 摇床
培养 48 h，用无菌纱布过滤得菌丝体，将菌丝体在
液氮中磨成粉末，提取总 DNA。总 DNA 的提取方
法参考 Fungal DNA Kit。
1.2.2.2 g10158 基 因 序 列 的 克 隆 根 据 从 基 因 组
DNA 上获得的 β-葡萄糖苷酶的基因序列设计引物上
游 引 物 F ：5-CCATTACGTAAGAATGCGGACCTCAC
TGTCAGTCG-3 和下游引物 R ：5-CTAGTCTAGACT
AAGCCTGCACAGGGCTGAT-3。其中 F 加 SnaBⅠ酶
切位点，R 加 Xba Ⅰ酶切位点，如下划线所示。PCR
反应体系为 50 μL，包括 1.5 μL 基因组 DNA，引物各
1.0 μL，KOD Buffer 5.0 μL，dNTP 4.0 μL，Mg2+ 2.0 μL，
KOD 1.0 μL，H2O 35 μL。PCR 反应条件为 ：95℃预
变性 3 min ；94℃变性 30 s，60℃退火 30 s，68℃延
伸 3 min，进行 25 个循环 ；68℃延伸 10 min。扩增
产物经 PCR 产物回收试剂盒回收。
1.2.2.3 黑曲霉重组表达载体的构建 将 g10158 基
因的全编码序列和 pGm 质粒（具有乙酰胺和氨苄
选 择 标 记 ） 经 SnaBⅠ、XbaⅠ 双 酶 切， 用 胶 回 收
试剂盒回收，然后用 T4 连接酶将酶切后的 g10158
与 pGm 质 粒 置 于 16 ℃ 过 夜 连 接， 得 到 重 组 质 粒
pGg10158 ；将连接产物转化大肠杆菌 DH5α 感受态
细胞，筛选阳性克隆，进行限制性酶切及测序鉴定；
挑选序列正确的克隆提取质粒，获得含有 β-葡糖苷
酶基因（g10158）的重组质粒。
1.2.2.4 黑曲霉的原生质体转化 将黑曲霉 G1 孢子
用 CMC 液体培养基，30℃培养过夜。将从液体培养
获得的菌体用 6 层无菌纱布过滤，并用 Solution A 冲
洗。将得到的菌丝体放入加有 0.6 g Lysing Enzymes
和 40 mL Solution B 的无菌三角瓶中，混匀，30℃，
150 r/min，1 h 后，将转速改为 80 r/min，1 h。然后
用两层无菌滤布过滤，将滤液分装到 50 mL 无菌离
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第6期130
心管中，加 Solution B 至 45 mL，4 000 r/min，离心
10 min。弃上清；加 20 mL Solution B 混匀，4 000 r/min，
离心 5 min，弃上清 ；再加 20 mL Solution B 混匀，
4 000 r/min，离心 5 min，弃上清。加 100 μL Solution
B 混 匀， 加 10 μL 得 到 的 重 组 质 粒 ；再 加 12.5 μL
Solution C 混匀，冰上静置 20 min。加 2 mL Solution B，
1 mL Solution C 和 8 mL amdS 上层培养基，混匀，倒
入 3 个 amdS 下层培养基平板中，30℃恒温箱培养。
3-4 d，观察有无转化子长出。
1.2.3 重组黑曲霉的筛选和鉴定
1.2.3.1 重组黑曲霉的平板筛选 将长出的转化子
用无菌的一次性牙签转接于 amdS 二次验证培养基
平板中，30℃恒温箱培养，3-4 d，在二次验证平板
上生长的即为阳性菌株。
1.2.3.2 PCR 鉴 定 挑 取 二 次 平 板 上 的 菌 丝， 进
行 菌 落 PCR， 方 法 参 照 试 剂 盒 Direct PCR Kit
（FINNZYMES）。
1.2.4 重组黑曲霉工程菌株的表达 将阳性转化
子接种于 25 mL Promosoy special medium 培养基中，
30℃下 200 r/min 摇床继续培养，每 24 h 取样，将发
酵液 12 000 r/min 离心 5 min，收集上清，即为粗酶液。
1.2.5 重组黑曲霉表达产物分析
1.2.5.1 SDS-PAGE 和蛋白含量测定 SDS-PAGE 采
用 Solarbio SDS-PAGE 凝胶制备试剂盒操作，分离胶
浓度 8%，浓缩胶 5%。发酵液加入 4× 上样缓冲液，
沸水煮 3 min 后上样 20 μL 进行电泳。分析重组蛋白
的表达情况。蛋白质含量测定方法参照试剂盒 BCA
蛋白浓度测定试剂盒。
1.2.5.2 重组酶活力检测 以对-硝基苯酚-β-D-葡萄
糖苷（pNPG）为底物测定 β-葡萄糖苷酶的活性，以
每分钟催化 pNPG 生成 1 μmol 对 - 硝基苯酚（p-nit-
rophenol）所需的酶量为一个酶活单位（IU）。反应体系：
在 100 μL 缓冲液中加适当稀释浓度的粗酶液 50 μL
再加入 5 mmol/L pNPG 50 μL。混匀，置于 50℃水浴
中，准确计时 15 min ；反应结束后，迅速、准确地
加入 1 mol/L 碳酸钠溶液 100 μL，摇匀，然后在岛津
紫外可见分光光度计 UV-1800 的 410 nm 下测定吸
光值［15］。
1.2.5.2.1 重组酶最适温度及温度稳定性测定 在
pH5.0，不同温度条件下测定重组 β-葡萄糖苷酶的酶
活力 ；将重组 β-葡萄糖苷酶液在 40℃、50℃和 60℃
水浴中温浴，每隔 15 min 取出一部分酶做酶活反应。
在最适条件下检测剩余酶活力。
1.2.5.2.2 重组酶最适 pH 及 pH 稳定性 在 50℃，
不同 pH 条件下测定重组 β-葡萄糖苷酶的酶活力 ；
将重组 β-葡萄糖苷酶液在不同 pH 值的缓冲液中室
温放置 30 min，在最适条件下检测剩余酶活力。
2 结果
2.1 葡萄穗霉基因组分析
通过对葡萄穗霉全基因组进行比较基因组学的
研究，挑选出具有 β-葡萄糖苷酶活性的 g10158 基因，
此基因编码一个含 817 个氨基酸的蛋白质 G10158。
用 DNAStar 软件预测该蛋白质的理论分子量大小为
87.9 kD，SignaIP 分析第 1-20 位氨基酸为信号肽。
蛋白质 G10158 同来源于 Aspergillus flavus NRRL3357
的 β-葡萄糖苷酶（GenBank 索引号为 EED48455.1）
具有较高同源性，为 75%。
2.2 g10158基因的克隆及黑曲霉表达载体的构建
经 PCR 扩 增 得 到 了 大 小 正 确（2 508 bp） 的
g10158 基因（图 1）。
10000
bp
M 1
8000
6000
5000
3500
3000
2500
2000
1500
4000
M ：DNA 分子量标准 ；1 ：g10158 的 PCR 扩增条带
图 1 PCR 扩增产物的电泳分析
将 g10158 基 因 全 编 码 序 列 进 行 SnaB Ⅰ 和
Xba Ⅰ双酶切后插入到黑曲霉表达载体 pGm 的多克
隆位点，获得重组质粒 pGm-g10158，对转化大肠杆
菌 DH5α 感受态细胞获得的阳性克隆进行菌落 PCR
验证，以及重组质粒的 PCR 验证、酶切验证和测序
鉴定。结果表明插入片段在 pGm 中有正确的阅读框。
2.3 重组黑曲霉的筛选和鉴定
在 amdS 筛选培养基上长出的 18 个转化子转接
2013年第6期 131于海玲等 ：葡萄穗霉中 β-葡萄糖苷酶的基因克隆、表达及酶学性质分析
于 amdS 二次筛选培养基（不含蔗糖）上，编号为
G1-pGm-g10158-1-G1-pGm-g10158-18， 并 进 行 菌 落
PCR 验证，获得了 15 个阳性转化子。将这 15 个转
化子接种于 25 mL CSL 培养基中，菌体生长 48 h 后
转入 25 mL 液体发酵培养基中进行发酵表达。每 24 h
取 1 mL 发酵液进行 SDS-PAGE 电泳，筛选出表达量
高的菌株 5 株进行酶活性测定（表 1），筛选出一株
酶活力最高的黑曲霉重组工程菌株 Gpg10158-13。
表 1 各菌株酶活测定
菌株 酶活（U/mL）
G1 0.464
Gpg10158-4 1452.15
Gpg10158-5 1743.71
Gpg10158-8 643.13
Gpg10158-9 1735.83
Gpg10158-13 1810.48
2.4 重组表达产物分析及生物学特性
2.4.1 重组表达产物分析 黑曲霉重组工程菌株
Gpg10158-13 接 种 于 25 mL Promosoy special medium
产酶培养基中进行发酵表达。每 24 h 取出 0.5 mL 发
酵液进行 SDS-PAGE 电泳（图 2），并进行酶活性测定，
发现 β-葡萄糖苷酶的活力在发酵第 5 天时达到高峰。
2.4.2 重组酶最适温度及温度稳定性 在不同温度
条件下测定 β-葡萄糖苷酶的活力，发现该酶的最适
温度为 50℃（图 3）。将重组 β-葡萄糖苷酶液在不同
温度下分别保温，每 15 min 取酶液，在最适条件下
检测剩余酶活力。结果（图 4）表明，重组 β-葡萄
糖苷酶在 60℃保温 60 min 后酶活力仍在 50% 以上。
2.4.3 重组酶最适 pH 及 pH 稳定性 在不同 pH 反
116
kD
1 2 M
86
45
35
α-glucosidase
β-glucosidase
acidic amylase
α-amylase
1 ：G1 ；2 ：重组 β-葡萄糖苷酶 ；M ：蛋白质分子量标准 .
图 2 重组 β-葡萄糖苷酶的 SDS-PAGE 分析
1800
1600
1400
1200
1000
200
0
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
Temperatureć
A
ct
iv
ity
U/m
L
图 3 重组 β-葡萄糖苷酶的最适温度曲线
图 4 重组 β-葡萄糖苷酶的温度耐受性曲线
1800
1600
1400
1200
1000
800
600
400
200
0
A
ct
iv
ity
U/m
L
0 15 30 45 60 75 90 150
40℃
50℃
60℃
210
Timemin
应条件下分析重组 β-葡萄糖苷酶的活力，表明该酶
最适 pH 为 4.8（图 5）。将重组 β-葡萄糖苷酶液在不
同 pH 值的缓冲液中室温放置 30 min，在最适条件
下检测剩余酶活力。发现该酶在 pH3.8-7.4 的条件
下保温 30 min 后仍具有 80% 以上的酶活力（图 6）。
1800
2000
1600
1400
1200
1000
800
600
400
200
0
0 1 2 3 4 5
pH
6 7 8 9
A
ct
iv
ity
U/m
L
图 5 重组 β-葡萄糖苷酶的最适 pH 曲线
A
ct
iv
ity
U/m
L
2000
1000
1500
500
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
pH
图 6 重组 β-葡萄糖苷酶的 pH 耐受性曲线
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第6期132
3 讨论
近年来 β-葡萄糖苷酶的生产越来越多的受到
人们的关注，已经有许多的 β-葡萄糖苷酶被报道，
但其中只有极少数的 β-葡萄糖苷酶来自葡萄穗霉，
Amouri 等［15，16］的研究中直接测定葡萄穗霉中 β-葡
萄糖苷酶的活性。目前解决 β-葡萄糖苷酶含量低，
难以获得大量产品，价格昂贵等一系列问题的最有
效途径就是基因工程手段。本研究通过基因工程手
段，将葡萄穗霉中的 β-葡萄糖苷酶基因转化到黑曲
霉 G1 中，使得 β-葡萄糖苷酶获得高效的表达，并
成功获得了能够高效分泌表达 β-葡萄苷酶基因的重
组菌株。对其中重组菌株 Gpg10158-13 的研究表明，
该重组 β-葡萄糖苷酶在 pH4.8 显示最佳催化活性，
并且在 pH3.8-7.4 仍保持较高的 β-糖苷键水解活性。
酶学性质分析得出该酶在 50℃具有最高活性，粗酶
液的活力为 1 856.48 U/mL。为研究糖苷水解酶家族
特征及酶的体外定向改造提供理论指导。主要可用
于木质纤维素降解的应用研究，为工业生产性能优
良的纤维素及半纤维素水解酶提供新型酶制剂。
对重组菌株 Gpg10158-13 进一步研究发现，除
了表现出较高的 β-葡萄糖苷酶活性外，还具有较高
的木糖苷酶活性（58.20 U/mL）。该重组菌株还具有
潮霉素、脱氧葡萄糖等的抗性。此外，本研究还为
DNA 序列数据库提供了新的基因资源，为更深入地
研究 β-葡萄糖苷酶提供了良好的参考价值。
4 结论
本研究克隆、异源表达了具有活性的葡萄穗霉
β-葡萄糖苷酶基因，其粗酶液 β-葡萄糖苷酶活力达
1 856.48 U/mL，最适温度为 50℃，最适 pH 为 4.8，
在不同 pH 缓冲液中处理 30 min 后，最低仍有 80%
残余酶活。
参 考 文 献
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（责任编辑 马鑫）