全 文 ：·技术与方法·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第7期
植物病毒广泛存在于果树、蔬菜、花卉等植物中，
病毒通过植物的无性繁殖在植物体内传递及积累，
最终造成植物生长受到抑制、产量及品质下降。病
毒感染是无性繁殖植物种质退化、产量和品质下降
的主要原因。自从 1952 年 Morel［1］利用感染花叶病
毒的大丽菊茎尖分生组织培养得到无病毒植株以来，
植物组培脱毒技术便在生产实践中得到了广泛应用。
植物组培脱毒技术是利用病毒在植物体内分布的不
均匀性（在植物茎尖等分裂旺盛、生长迅速的组织
细胞内含量很低）及植物细胞的全能性，采用不含
病毒的植物组织或细胞进行组织培养，利用植物细
胞的全能性最终分化获得无病毒植株。通过植物组
培脱毒方法，可以脱除患病毒病植株的病毒，起到
植株复壮，提高产量及质量的作用。植物组培脱毒
技术现已在马铃薯、甘薯、草莓、部分观赏花卉及
药用植物的组培快繁中得到广泛研究及应用，对其
收稿日期 ：2013-11-15
基金项目 ：嘉兴市科技计划项目（2013BY26006）
作者简介 ：李军，男，博士，副研究员，研究方向 ：植物生物技术 ；E-mail ：lijunjx1@163.com
植物组培脱毒技术及其在药用植物藏红花中的应用
李军1  高广春2  李白1  朱志明3
（1. 嘉兴市农业科学研究院，嘉兴 314016 ；2. 嘉兴学院 医学院，嘉兴 314001 ；3. 嘉兴市天禾藏红花专业合作社，嘉兴 314000）
摘 要 ： 植物组培脱毒技术可以脱除患病毒病植株的病毒，起到植株复壮，提高产量及质量的作用。综述了植物组织培养
脱毒的技术方法及其近几年的应用情况，同时针对药用植物藏红花脱毒球茎培育中应用的脱毒技术做了总结及探讨。
关键词 ： 脱毒 组织培养 藏红花
Advance on Virus-free Plant Tissue Culture and its Application on
Crocus sativus L.
Li Jun1 Gao Guangchun2 Li Bai1 Zhu Zhiming3
（1. Jiaxing Academy of Agricultural Sciences，Jiaxing 314016 ；2. Department of Pharmacy，School of Medicine Science，Jiaxing University，
Jiaxing 314001 ；3. Jiaxing Tianhe Saffron Professional Cooperatives，Jiaxing 314000）
Abstract:  The technique of virus elimination in plant tissue culture can eliminate the virus, rejuvenate, and improve yield and quality of
plants. This paper summarized the virus-free methods and its application in the recent years, discussed the virus-free methods used in medicinal
plant Crocus sativus L..
Key words:  Virus-free Tissue culture Crocus sativus L.
规模化、标准化及区域化生产应用起到推动作用。
藏红花（Crocus sativus L.）是鸢尾科番红花属多
年生草本植物，主要靠分球无性繁殖。长期无性繁
殖容易积累病毒，使品质及产量下降。藏红花主要
病毒有芜菁花叶病毒（Turnip mosaicvirus，TuMV）、
黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）、鸢
尾 花 叶 病 毒（Irismosaicvirus，IMV）、 烟 草 脆 裂 病
毒（Tobacco rattle virus，TRV）和菜豆黄花叶病毒
（ByMV）［2-4］，通过组织培养的方式培育无病毒球茎
是提高藏红花种球质量和产量的有效途径。
本文综述了植物组织培养脱毒的技术方法及其
近几年的应用情况，同时针对药用植物藏红花脱毒
球茎培育中应用的脱毒技术做了总结及探讨。
1 植物组织培养常用脱毒技术
1.1 茎尖培养脱毒
茎尖培养脱毒是利用病毒在植物体内的分布不
2014年第7期 45李军等 ：植物组培脱毒技术及其在药用植物藏红花中的应用
均匀性，在分裂旺盛的茎尖尤其是生长点区域（0.1-
1.0 mm）带病毒最少或不带病毒，越靠近尖端，病
毒含量越低。因为病毒在植物体内随维管系统迁移，
在茎尖分生组织中没有维管束系统，病毒通过胞间
连丝传递比较慢，而细胞分裂速度快，所以茎尖生
长点部位几乎没有病毒［5］。茎尖脱毒和再生的关键
是切取茎尖的大小，因为脱毒的成功率与茎尖大小
成反比，而再生能力与茎尖大小成正比，因此切取
合适大小的茎尖分生组织是茎尖培养脱毒成功的关
键［6］。茎尖培养具有脱毒效果好、繁殖系数高、变
异率低的优点，但也受到取材大小的限制。
自从 1952 年 Morel［1］阐明用茎尖分生组织可从
大丽菊中消除病毒以来，茎尖培养脱毒技术在植物
组织培养脱毒中得到广泛研究与应用［7-12］，大量研
究结果表明，0.2 mm 左右的茎尖在脱毒率和成活率
方面可以达到最优。以 0.2 mm 茎尖为外植体，马铃
薯的成活率和脱毒率分别为 68% 和 56%［13］，葡萄
的成活率和脱毒率为 75% 和 12%［14］。
1.2 热处理结合茎尖培养脱毒
由于茎尖培养受取材大小的限制，近年来在植
物组织培养中多采用热处理结合茎尖培养的方法脱
毒，这种方法对于一些难于用茎尖培养或热处理脱
毒的果树病毒效果很好。采用这种方法，即使用大
的外植体，也能增加获得的无病毒植株数。热处理
脱毒主要是利用病毒受热的不稳定性而失去其活性
达到脱病毒的目的。热处理过程减慢病毒在植株体
内扩散速度的同时加快植物的生长，针对不同植物、
不同品种和不同植物病毒对温度的敏感程度不同的
特点，进行一定温度和时间范围的热处理，使植物
的生长速度明显超过病毒在植物体内扩散的速度，
从而使一部分正在快速生长的植物组织，如顶芽、
嫩稍的尖端不含病毒，把不含病毒的部分切下来接
种到适宜的培养基上，最终培养出无毒植株［15］。
热处理结合茎尖培养脱毒的热处理一般采用
35-55℃的热水或高温蒸汽、高温空气处理，温度越
高处理的时间越短，处理时间根据温度及外植体的
不同从 4 h-40 d 不等，多采用热处理结束后切取茎
尖培养获得无毒苗［16-19］。解晓红等［16］用半夏无菌
苗为外植体，38℃高温 40 d 后切取茎尖培养，脱毒
率达到 88.9%。针对不同的材料选择合适的热处理
温度及时间，如 40℃水浴热处理草莓匍匐茎 4 h［17］、
36℃热处理百合珠芽 10 d［18］、38.5℃热处理罗汉果
组培苗 10 d［19］，可获得脱毒率为 100% 的无毒苗，
由于外植体成活率随热处理时间增加而降低，
近几年还发展出了变温处理结合茎尖培养来提高外
植体成活率和脱毒率的方法。顾沛雯［20］研究了变
温处理对葡萄组培苗的脱毒效果，发现变温（白天
38℃，夜晚 32℃）比恒温（38℃）处理成活率提高
15.6%，成活率达到 50%，而脱毒率相差不大。同
时与单纯茎尖培养相比，热处理后小株成活率和脱
毒率平均增加 7.5% 和 8.5%。石贵玉等［21］研究了毛
葡萄的组培脱毒技术，发现变温处理（白天 37℃处
理 8 h，晚上 22℃处理 16 h）10-15 d，茎尖存活率
可达 80% 以上，脱毒率达 100%。
1.3 愈伤组织诱导脱毒
愈伤组织诱导脱毒是通过植物器官或组织的培
养来诱导产生愈伤组织，从愈伤组织分化出芽并长
成植株，经病毒检测筛选获得无毒植株的方法。愈
伤组织诱导脱毒的应用中常结合茎尖培养及花药培
养等来提高脱毒效率。愈伤组织诱导脱毒技术现已
在甘蔗、草莓和马铃薯等多种植物上获得成功。
李松等［22］研究了甘蔗茎尖胚状体脱毒苗快繁
技术，研究发现茎尖胚状体分化苗增殖 5 代后扩繁 2
589 倍，宿根矮化病（Ratoon stunting disease，RSD）
病毒去除率 95%、花叶病去除率 100%。晁慧娟等［23］
及肖君泽等［24］以花粉发育处于单核靠边期的草莓
花蕾为外植体进行花药脱毒培养，结果表明预冷处
理 72 h 是最适合的花药低温处理时间，研究还筛选
出最适合花药愈伤组织诱导及不定芽分化的培养基。
1.4 病毒抑制剂处理脱毒
病毒抑制剂能够不同程度地脱除植物病毒，其
作用机理主要为竞争寄主细胞表面受体、阻碍病毒
穿入脱壳、阻碍病毒生物合成和提高寄主抗病能力
4 种方式。采用病毒抑制剂与茎尖培养相结合的脱
毒方法，对取材大小要求不严并且能脱除多种病毒，
接种茎尖可大于 1 mm，容易分化出苗，提高存活
率［25］。对于有些比较难脱除的病毒，采用病毒抑制
剂结合热处理和茎尖培养的方法使用，效果较好。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第7期46
目前常用于组织培养的病毒抑制剂有 9-（2-羟
二氧）甲基鸟嘌呤、2-硫尿嘧啶、叠氮胸苷、DHT
和病毒唑等。在众多病毒抑制剂中，病毒唑的抑制
效果较好，也得到了广泛应用，研究发现 35 mg/L
病毒唑对不同品种的马铃薯病毒脱除效果都可以达
到 60%-80%，比没有添加病毒唑的茎尖处理脱毒效
果提高 27%［28］；40 mg/L 和 60 mg/L 病毒唑对李痘
病毒（Plum pox virus，PPV）的脱毒率达到 15.38%
和 16.66%［29］。针对不同的材料需要研究合适的脱
毒效果最好的病毒抑制剂，李正民等［26］研究了不
同病毒抑制剂对蝴蝶兰建兰花叶病毒（Cymbidium
mosaic virus，CyMV）和齿兰环斑病毒（Odontoglossum
ringspot virus，ORSV） 的 脱 除 效 果， 研 究 表 明 安
吉寡糖素的脱毒效果最好，对 CyMV 的脱除率为
83.33%，对 ORSV 的脱除率为 66.67% ；顾沛雯［20］
研究发现病毒钝化剂（WCT 和丰源宝）处理对葡萄
病毒具有良好的抑制作用。
在病毒抑制剂与其他脱毒方法结合使用方面，
张惠华等［27］发现对东方百合进行热处理（39℃处
理 15 d）后结合 10 mg/L 病毒唑来处理，百合无症
病毒（Lily symptomless virus，LSV）及百合斑驳病
毒（Lily mottle virus，LMoV）脱毒率分别达到 55%
和 40%。
1.5 超低温处理脱毒
超低温处理脱毒是近些年发展起来的一种新的
脱毒方法，其原理是利用液氮超低温（-196℃）对
植物细胞的选择性杀伤，得到存活的顶端分生组织。
顶端分生组织能够在超低温处理后存活，与其自身
的细胞特性有关。含有病毒的细胞的液泡较大，液
泡中含有的水分多，在超低温处理过程中易被形成
的冰晶破坏致死，而增殖速度较快的顶端分生组织
含水分少，胞质浓，抗冻性强，不宜被冻死。液氮
中的超低温能杀死含有较大液泡的细胞，而保存液
泡小的顶端分生组织细胞，顶端分生组织不含或只
含有少量病毒，因此得到的植株很有可能是无毒的。
超低温脱毒方法最早由 Brison 等［30］开创，他
们用超低温结合茎尖培养脱毒方法，成功的去除了
李属根状茎上的李痘病毒（Plum pox virus，PPV），
脱毒率达到 50%，是茎尖剥离脱毒率 19% 的 2.5 倍。
Wang 等［32，33］应用该技术做了大量研究，将该技术
应用于马铃薯、甘薯、葡萄等植物，并获得了无毒
植株，同时还将超低温处理、热处理及茎尖培养技
术结合起来脱除了木莓丛矮病毒（Raspberry bushy
dwarf virus，RBDV）脱毒率达到 35%。Helliot 等［31］
利用超低温脱毒方法，从香蕉中脱除黄瓜花叶病毒
及香蕉条斑病毒（Banana streak virus，BSV），病毒
脱毒率达到 30% 和 90%。靳慧洁等［34］结合超低温
脱毒、茎尖培养及热处理脱毒方法成功获得了百合
脱毒苗。超低温处理脱毒基于超低温保存，理论上，
只要能利用超低温保存种质的植物都可以用超低温
处理进行脱毒，其应用前景非常广阔［35，36］。
2 藏红花脱毒种球培育方法
由于藏红花叶基生，没有一般意义的茎，其生
长点位于叶丛基部与球茎结合处，剥取其茎尖难度
极大，同时 0.5 mm 以下微茎尖成活率低，剥取难度
大，而较大茎尖一般脱毒效果不佳［2］，现有藏红花
脱毒球茎培育研究多采用茎尖培养结合热处理、愈
伤组织诱导及病毒抑制剂等方法才能获得较高的成
活率及脱毒率。
朱保华等［2］采用变温处理结合茎尖培养与化
学处理结合茎尖培养 2 种方法培育出了不含 CMV、
TuMV、TRV 及 IMV 病 毒 的 藏 红 花 植 株。 将 带 芽
点的球茎进行变温处理 36℃（12 h）/18℃（12 h）
后，剥取 0.5-1.0 mm 的茎尖进行培养，茎尖成活率
26.7% ；将 3-5 cm 带叶片的球茎灭菌后取 0.5-1.0
mm 的茎尖接种到添加 5-10 mg/L 浓度病毒唑的分化
培养基上培养，茎尖成活率 25%-45%。陈书安等［3］
用热处理结合愈伤组织诱导方法获得了无毒芽，以
高温处理（35℃）的分化芽为外植体，经诱导 25 d
后获得愈伤组织，该愈伤组织再经过高温处理（35℃）
可获得高温脱毒的藏红花愈伤组织，再分化培养
50 d 后可获得高温脱毒的藏红花分化芽。朱昱等［37］
采用茎尖培养结合愈伤组织诱导方法也获得了脱毒
球茎。
3 结语
通过组织培养脱毒可以提高作物产量及质量，
组培脱毒技术也得到越来越多的研究与应用，目前
通过组培实现商业化的脱毒试管苗在果树、蔬菜、
2014年第7期 47李军等 ：植物组培脱毒技术及其在药用植物藏红花中的应用
花卉及药用植物上的研究已经十分普遍，如马铃薯、
甘薯、苹果、葡萄、草莓、蝴蝶兰、天山雪莲和金
线莲等。植物组培脱毒技术的不断改进和提高以适
应大规模的工厂化和商品化势在必行。脱毒技术的
应用也逐步从茎尖培养、热处理脱毒、病毒抑制剂
处理等单一脱毒方法向 2 种、3 种方法结合使用发展，
逐步提高脱毒率及成苗率。
目前藏红花组织培养方面的研究多集中在通过
球茎切块来分化成芽或通过球茎切块诱导愈伤组织
并进一步分化成芽的快繁研究［38-41］，对于脱毒球茎
的研究报道很少。球茎切块直接诱导分化成芽不能
达到脱毒的目的，通过诱导愈伤组织分化成芽虽然
增殖系数比球茎直接诱导成芽高，而且有可能获得
无毒植株，但是脱毒率低。由于藏红花难于直接剥
取 0.5 mm 以下茎尖来进行茎尖培养，同时球茎取材
相对容易、组培快繁方面（球茎切块诱导愈伤组织
及直接分化成芽）的研究较多，为藏红花培育脱毒
球茎提供了新的研究思路，因此通过球茎切块诱导
愈伤组织结合热处理或病毒抑制剂处理将是藏红花
无毒球茎培育的有效途径。
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（责任编辑 狄艳红）