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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第11期
超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD，
EC1.15.1.1）是一种广泛存在于动植物和微生物中
的金属酶，是清除氧自由基过程中最先起作用的酶
类，在抗氧化酶类中处于核心地位。它能催化超氧
化物阴离子自由基（O.2
-）发生歧化反应，从而清除
O.2
-，在维持生物体内超氧阴离子自由基产生与消除
的动态平衡中起着重要的作用［1］。SOD 按其结合的
金属离子不同可分为 3 类 ：第一类是 Cu/Zn-SOD ；
第二类能与 Fe 或 Cu/Zn 或者两者中的任意一个都能
结合，即 Fe-SOD、Mn-SOD 或 Fe/Mn-SOD ；第三类
收稿日期 : 2012-04-16
基金项目 : 国家转基因专项（2009ZX08010-007B）
作者简介 : 姚冉 , 女 , 硕士研究生 , 研究方向 : 遗传学 ; E-mail: yaoran221@163.com
通讯作者 : 潘沈元 , 教授 , 研究方向 : 烟草生物技术 ; E-mail: PanShenyuan@263.net
Cu/Zn-SOD 基因植物表达载体的构建及其在
烟草中的表达
姚冉1，2  李轶女2  张志芳2  沈桂芳2  潘沈元1
（1 江苏师范大学生命科学学院，徐州 221116 ；2 中国农业科学院生物技术研究所，北京 100081）
摘 要 ： 为研究 Cu/Zn-SOD 基因在提高转基因植物抗逆性方面的作用，从一株地热芽孢杆菌（Geobacillus）中克隆得到 Cu/
Zn-SOD 基因，以 pZP211 质粒为表达载体，构建了植物表达载体 pZP211-Cu/ZnSOD，并通过农杆菌介导对烟草进行遗传转化。经
PCR 检测证明已获得转 Cu/Zn-SOD 基因的烟草。进而测定转基因烟草的 SOD 活力，结果表明 Cu/Zn-SOD 基因在烟草中高效表达。
对转基因烟草进行耐盐性检测，证明 Cu/Zn-SOD 基因确实能够提高烟草对盐胁迫的耐受性。
关键词 ： Cu/Zn-SOD 基因 植物表达载体 转基因烟草
Construction of Plant Expression Vector of Cu/Zn-SOD Gene and Its
Expression in Tobacco
Yao Ran1，2 Li Yin 2 Zhang Zhifang2 Shen Guifang2 Pan Shenyuan1
（1School of Life Science，Jiangsu Normal University，Xuzhou 221116 ；2Biotechnology Research Institute，Chinese Academy of Agricultural
Sciences，Beijing 100081）
Abstract:  In order to study the application of Cu/Zn-SOD gene in improving the resistance of transgenic plants, Cu/Zn-SOD gene was
cloned from a bacteria of Geobacillus, and the plant expression vector pZP211-Cu/ZnSOD was constructed. Tobaccos were tansformed by
Agrobacterium containing the constructed vector. The transgenic lines were selected by PCR detection. The result revealed that the Cu/Zn-SOD
gene had been successfully integrated into the genome of tobacco. With the determination of SOD activity in transgenic tobacco subsequently,
the results showed that the Cu/Zn-SOD gene was highly expressed in tobacco. Salt tolerance test showed that the Cu/Zn-SOD gene can indeed
improve tobacco tolerance to salt stress in transgenic tobacco.
Key words:  Cu/Zn-SOD gene Plant expression vector Transgenic tobacco
是 Ni-SOD［2］。不同生物所含 SOD 的类型与物种进
化和生物对氧浓度的适应有密切的关系。Cu/Zn-SOD
主要存在于真核细胞中，所以一般认为 Mn-SOD 和
Fe-SOD 起源于共同的祖先，而 Cu/Zn-SOD 单独进
化而成［3］。高等植物中 Cu/Zn-SOD 主要存在细胞质
和叶绿体中［4］，细胞质 Cu/Zn-SOD 存在于细胞核、
液泡和质外体附近的区域，叶绿体 Cu/Zn-SOD 也在
细胞质中合成再进入叶绿体［5］。对众多来源不同的
Cu/Zn-SOD 的 cDNA 和氨基酸序列进行分析证实该
蛋白质上 Cu 原子和 Zn 原子结合的位点十分保守［6］。
2012年第11期 79姚冉等 ：Cu/Zn-SOD 基因植物表达载体的构建及其在烟草中的表达
来源于我们分离得到的一种耐高温地热芽孢杆菌菌
株的 Cu/Zn-SOD 经分析证实基因全长 522 bp，编码
173 个氨基酸，分子量为 17.9 kD，有完整的保守区［7］。
为了研究此种 Cu/Zn-SOD 基因在植物中的表达状况，
本试验利用分子克隆的方法，将 Cu/Zn-SOD 基因构
建到植物表达载体 pZP211 上，得到重组质粒后酶切
鉴定。同时，利用农杆菌介导的遗传转化将 Cu/Zn-
SOD 基因导入烟草，经过组织培养获得完整的转基
因烟草植株，并对转基因烟草进行检测，测定 SOD
酶活。对表达量高的转基因烟草植株进行抗逆性分
析，希望得到抗逆性提高的转基因烟草株系。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 植 物 材 料 大 烟 草（Nicotiana tabacum var.
Dayanyie），中国农业科学院烟草所提供。
1.1.2 菌株和质粒 Geobacillus sp. POT5 由本实验
室分离筛选得到 ；Escherichia coli 克隆菌株 DH10B
由本实验室保存 ；试验所用测序载体 pEASY-T3 购
自北京全式金生物技术有限公司 ；根癌农杆菌菌株
C58C1、克隆载体 pRTL2 及植物表达载体 pZP211 由
中国农业科学院作物科学研究所叶兴国研究员实验
室提供。
1.1.3 工具酶及试剂 限制性内切酶 Sac I、BamH
I、Pst I、T4 DNA 连接酶、dNTP 购自 Promega 公司 ；
LA Taq DNA 聚 合 酶 及 Buffer、6×Loading Buffer 购
自宝生物工程（大连）有限公司 ；DL2000 Plus DNA
Marker 购自北京全式金生物技术有限公司 ；其它试
剂为国产或进口分析纯。
1.2 方法
1.2.1 引物设计及 PCR 根据 Takami 等 GenBank 中
Geobacillus kaustophilus HAT426 的 superoxide dismu-
tase 基因序列（登录号 NC_006510）设计引物，并引
入合适的酶切位点。Cu/Zn-SOD 基因的上游引物为 ：
CGAGCTCATGCGAAAAACGTACGGTGTG（划线部分
为引入 Sac I 酶切位点）；下游引物为 ：CGGATCCTC-
ACGACGACTTGATTTCCC（划线部分为引入 BamH I
酶切位点）。
以 Geobacillus sp. POT5 菌株的基因组 DNA 为模
板，进行 PCR 扩增，反应程序 ：预变性 95℃ 5 min ；
变性 95℃ 1 min，退火 56℃ 40 s，延伸 72℃ 1 min，
循环数 30 ；最后 72℃延伸 10 min。扩增产物经 1%
琼脂糖凝胶电泳鉴定后回收目的片段连接到 pEASY-
T3 克隆载体中，进行双向测序。
1.2.2 植物表达载体的构建 用 Sac I 和 BamH I 双
酶切 Cu/Zn-SOD 基因的纯化 PCR 产物，同时用相同
的限制性内切酶切开中间载体 pRTL2。再用 T4 DNA
连接酶连接目的基因和载体，得到重组质粒 pRTL2-
Cu/ZnSOD，并进行酶切鉴定。
再用 Pst I 酶切 pRTL2-Cu/ZnSOD，因为中间载
体 pRTL2 上有两个 Pst I 酶切位点，所以能够切下
连有目的基因和 E35S 启动子的表达盒。回收纯化
的目的片段，并与同样用 Pst I 酶切开的植物表达
载体 pZP211 连接，得到重组植物表达质粒 pZP211-
Cu/ZnSOD，并进行酶切鉴定。
图 1 pZP211-Cu/ZnSOD 植物表达载体结构简图

LB NPTII 35S E35S Cu/ZnSOD T35S RB
Pst I Sac I Pst IBamH I
1.2.3 农杆菌介导烟草的遗传转化 将得到的重组
质粒 pZP211-Cu/ZnSOD 通过液氮冻融法转入农杆菌
C58C1，PCR 初步鉴定重组质粒是否已转入农杆菌。
然后提取质粒再反转入大肠杆菌中，最后提质粒做
酶切鉴定，确保重组的质粒已进入农杆菌。
利用带有 pZP211-Cu/ZnSOD 的农杆菌通过叶盘
法转化烟草［8］。农杆菌侵染后的烟草叶盘在含有抗
生素的 MS 培养基上培养，待长出新的叶片及根再
做检测。
1.2.4 转化烟草再生植株的 PCR 检测 转化烟草得
到完整植株后，取新鲜幼嫩叶片用 CTAB 法提取烟
草基因组。以转化烟草基因组为模板，非转基因烟
草基因组为阴性对照，pZP211-Cu/ZnSOD 质粒为阳
性对照，以 Cu/Zn-SOD 基因特异引物进行转基因烟
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第11期80
草的 PCR 检测，PCR 反应程序 ：预变性 95℃ 5 min ；
变性 95℃ 1 min，退火 56℃ 40 s，延伸 72℃ 1 min，
循环数 30 ；最后 72℃延伸 10 min。
1.2.5 转基因烟草 SOD 酶活性的测定 对 PCR 鉴
定正确的转基因植株用氮蓝四唑（NBT）光还原法［9］
测定超氧化物歧化酶（SOD）活力。以野生型烟草
为对照，分别取生根后 14 d、21 d、28 d 和 35 d 的
烟草植株叶片为材料提取酶液。显色反应后检测样
品在 560 nm 的 OD 值。
1.2.6 转基因烟草的耐盐性鉴定 分别从烟草转基
因阳性植株及野生型无菌苗上剪取 1 cm 左右的茎间
组织（10 个重复），接种在含有 200 mmol/L NaCl 的
1/2 MS 培养基上，于三角瓶中进行耐盐处理，25℃、
16 h 光照条件下培养，观察植株生长状况，以叶片
和根系生长为重点观察对象。
2 结果
2.1 Cu/Zn-SOD基因的PCR
以 Geobacillus sp. POT5 菌株的基因组 DNA 为模
板，用特异性引物进行 Cu/Zn-SOD 基因的 PCR 扩增，
得到一条大小为 522 bp 左右的条带（图 2）。对测序
结果进行序列分析表明，Cu/Zn-SOD 基因全长 522
bp，编码 173 个氨基酸，理论分子量为 17.9 kD，理
论等电点为 5.52，含有完整的保守区序列。
因大小为 1 900 bp 左右的片段，回收纯化后与同样
用 Pst I 酶切开的植物表达载体 pZP211 连接，酶切
鉴定重组质粒与预期结果相同（图 4），证明植物表
达载体 pZP211-Cu/ZnSOD 已构建完成。
1 M
500
bp
图 2 Cu/Zn-SOD 基因的 PCR 扩增
1. Cu/Zn-SOD 基因 PCR 产物（522 bp）；M. DNA Marker
2.2 植物表达载体的构建及鉴定
从 pEASY-T3 克 隆 载 体 上 用 Sac I 和 BamH I
双酶切切下目的基因片段，同时用相同的限制性
内切酶切中间载体 pRTL2，构建重组载体 pRTL2-
Cu/ZnSOD，得到的重组质粒经酶切鉴定正确（图 3）。
再用 Pst I 酶从 pRTL2 载体上切下连有目的基
M 1 2 3
750
bp
500
M. DNA Marker ；1-3. pRTL2-Cu/ZnSOD/Sac I+BamH I
双酶切（522 bp+3 900 bp）
图 3 pRTL2-Cu/ZnSOD 酶切鉴定图
2.3 烟草转Cu/Zn-SOD基因植株的获得
用含有 pZP211-Cu/ZnSOD 的农杆菌菌液侵染烟
草叶盘，15 d 后出现不定芽，继代一次，待不定芽
长出 3-4 片叶时将其割下，转入生根培养基中。在
生根培养基中生长两周左右以后不定芽生根，得到
完整抗性再生植株（图 5）。
2.4 转基因烟草的PCR检测
通过农杆菌转化得到的烟草抗性植株移栽成活
后，以新鲜幼嫩叶片为材料提取烟草基因组，以转
化烟草基因组为模板，非转基因烟草基因组为阴性
对照，pZP211-Cu/ZnSOD 质粒为阳性对照，以 Cu/
Zn-SOD 基因特异引物进行转基因烟草的 PCR 检测。
结果如图 6 所示，初步证明已获得转 Cu/Zn-SOD 基
因的烟草。
1-7. pZP211-Cu/ZnSOD Pst I 酶切（-500 bp+1500 bp+9000 bp）；
M. DNA Marker
图 4 pZP211-Cu/ZnSOD 酶切鉴定图
1 2 3 4 5 6 7 M
2000
1000
bp
2012年第11期 81姚冉等 ：Cu/Zn-SOD 基因植物表达载体的构建及其在烟草中的表达
2.5 转基因烟草SOD酶活性的测定
对 PCR 鉴定阳性的植株做进一步的酶活力检
测。分别取生根后 14、21、28 和 35 d 的转基因植
株和野生型烟草的叶片提取酶液测定活力。结果（图
7）显示，转 Cu/Zn-SOD 基因的烟草中超氧化物歧
化酶活力比野生型高出两倍多，进一步证明 Cu/Zn-
SOD 基因已被成功地转入烟草植株，并且得到了高
效的表达。
2.6 转基因烟草的耐盐性鉴定
从 烟 草 植 株 上 剪 取 的 茎 间 组 织 在 含 有 200
mmol/L NaCl 的培养基上培养 35 d 后，野生型烟草
植株地上部叶片生长缓慢，且没有根系生长，而转
Cu/Zn-SOD 基因烟草植株根系能够正常生长。由此
证明 Cu/Zn-SOD 基因可以提高烟草植株对盐胁迫的
耐受性。
3 讨论
目前针对 SOD 相关基因方面的转基因植物研究
已有许多相关报道。Garcia 等［10］通过筛选和试验
确定了 Ts Cu/Zn-SOD 的抑制剂。他们从 LeadQuest
数据库中选出可结合 Cu/Zn-SOD 的药物类似物，然
后筛选出能够与受体侧链结合且不存在人类同源性
的配体。对 50 种化合物的测试试验表明，有 6 种
化合物可以明显抑制 Ts Cu/Zn-SOD 的活性。其中两
种在体外测定时没有抑制人类同源酶，显示出物种
选择性差异。Pavlina 等［11］对来源于一种真菌菌株
HL103 的 Cu/Zn-SOD 的基本形态分析表明，Cu2+ 和
Zn2+ 在该酶的活性和结构稳定性中分别发挥重要作
用。试验表明，HL Cu/Zn-SOD 具有高温和高 pH 值
图 6 转基因烟草植株中 Cu/Zn-SOD 基因的 PCR 检测
1-9. 转基因烟草植株 ；WT. 阴性对照 ；M. DNA Marker
A. 侵染后的烟草叶盘长出不定芽；B. 转入生根培养基；C. 不定芽生根；
D. 完整抗性再生植株移栽成活
图 5 转 Cu/Zn-SOD 基因烟草完整植株的获得
A B
C D
500
bp
1 2 3 4 5 6 7 8 9 WT M
图 7 转基因烟草 SOD 活力测定
0.00
50.00
100.00
150.00
200.00
250.00
300.00
14 21 28 35
246.61
106.19
SO
D
⍫࣋
/U/
m
g·
FW

104.73
232.34 239.92
102.35 101.04
211.13
䟾⭏රCu/Zn-SOD
ਆṧᰦ䰤d
a b
c d
a. 转 Cu/Zn-SOD 基因烟草刚转入含有 200 mmol/L NaCl 的培养基 ；b. 野生型
烟草刚转入含有 200 mmol/L NaCl 的培养基 ；c. 转 Cu/Zn-SOD 基因烟草植株
200 mmol/L NaCl 胁迫 35 d ；d 为野生型烟草植株 200 mmol/L NaCl 胁迫 35 d
图 8 转 Cu/Zn-SOD 基因烟草植株 200 mmol/L NaCl
胁迫 35 d 后生长情况
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第11期82
稳定性，同时他们还证实了该酶在一个小范围内的
热变性是可逆的。由于暴露在分子表面的糖链，糖
基化并不影响此种酶的热稳定性。
正常情况下机体内的氧自由基维持在一个平衡
状态，但在遇到诸如逆境胁迫等不利环境因素时，
细胞内的氧自由基浓度会明显升高，如果这些异常
升高的氧自由基不能得到及时清除，那么将导致生
命体正常平衡遭到破坏，如细胞膜氧化损伤，DNA
降解及蛋白质失活等现象，加速细胞衰老和死亡，
SOD 是清除氧自由基的最早起作用的酶类之一，所
以在植物抗逆性方面具有至关重要的作用。Tang
等［12］将定位于马铃薯叶绿体的 Cu/Zn-SOD 和 APX
置于氧化诱导型启动子下，研究了其对 MV 和 NaCl
引起的氧化胁迫的耐受性。结果表明，MV 胁迫下，
转基因马铃薯叶片膜的相对电导率明显低于对照 ；
NaCl 胁迫下，其叶绿素含量高于对照。证实了转入
Cu/Zn-SOD 和 APX 基因的马铃薯清除活性氧的能力
增强，抗逆性得到提高。
4 结论
采用常规 PCR、酶切、连接等技术，利用中间
载体 pRTL2 成功构建了 Cu/Zn-SOD 基因的植物表达
载体 pZP211-Cu/ZnSOD。pZP211 质粒含有壮观霉素
筛选基因 aadA，为转基因植物的筛选创造有利条件。
利用农杆菌 C58C1 介导的遗传转化，将 Cu/Zn-SOD
基因转入烟草叶盘。在转基因烟草抗性苗筛选的过
程中，采用羧苄青霉素或头孢霉素与卡那霉素双重
筛选的方法，有效地降低了假阳性植株出现的概率。
利用 PCR 技术对转基因烟草抗性植株进行分子鉴定，
并测定了转基因烟草的 SOD 酶活力。随后，对得到
的转基因烟草进行了初步的耐盐性检测。
我 们 成 功 构 建 了 植 物 表 达 载 体 pZP211-Cu/
ZnSOD，并通过农杆菌转化烟草获得了一批能够高效
表达且对盐胁迫有较强耐受性的转基因烟草植株，
为进一步研究 Cu/Zn-SOD 基因在提高植物抗逆性等
方面起到的作用及培育具有优良性状的转基因植物
新品种奠定了分子生物学基础。
参 考 文 献
［1］ 陈淮扬 , 刘望夷 . 从超氧化物歧化酶的分布和结构看分子进化 ,
生物化学与生物物理进展 , 1996, 23（5）: 408-413.
［2］ Prabhakar R, Morokuma K, Musaev DG. A dft study of the mechanism
of ni superoxide dismutase（NiSOD）: Role of the active site cystei-
ne-6 residue in the oxidative half-reaction. J Comput Chem, 2006, 27:
1438-1445.
［3］ Kwiatowski J, Hudson RR, Ayala FJ. The rate of Cu, Zn superoxide
dismutase evolution. Free Rad Res Comms, 1991, 12（1）: 363-37.
［4］ Baum JA, Scandalios JG. Developmental expression and intracellular
localization of superoxide dismutases in maize. Differentiation, 1979,
13: 133-140.
［5］ Ogawa K, Kanematsu S, Adada K. Intra- and extra-cellular localiza-
tion of “cytosolic” CuZn-superoxide dismutase in spinach leaf and
hypocotyls. Plant Cell Physiol, 1996, 37（6）: 790-799.
［6］ 马旭俊 , 朱大海 . 植物超氧化物歧化酶（SOD）的研究进展 . 遗
传 , 2003, 25（2）: 225-231.
［7］ Zou Y, Yang L, Liu G, et al. Identification of three Superoxide dismu-
tase genes from a Geobacillus sp. Protein J, 2011, 30: 66-71.
［8］ 魏春红 , 李毅 . 现代分子生物学实验技术［M］. 北京 : 高等教
育出版社 , 2006: 167-168.
［9］ 中国科学院植物生理研究所 , 上海市植物生理学会 . 现代植物
生理学实验指南［M］ . 上海 : 科学出版社 , 1999: 314-315.
［10］ Garcia GP, Landa PA, Rodriguez RA, et al. Novel inhibitors to
Taenia solium Cu/Zn superoxide dismutase identified by virtual
screening. J Comput Aided Mol Des, 2011, 25: 1135-1145.
［11］ Dolashka P, Moshtanska V, Dolashki A, et al. Structural analysis
and molecular modelling of the Cu/Zn-SOD from fungal strain
Humicola lutea 103. Spectrochimica Acta Part A, 2011, 83: 67-73.
［12］ Tang L, Tang H, Kwak SS, et al. Improving potato plants oxidative
stress and salt tolerance by gene transfer both of Cu/Zn superoxide
dismutase and ascorbate peroxidase. China Biotechnology, 2008, 28
（3）: 25-31.
（责任编辑 李楠）