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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第10期
木薯（Manihot esculenta Crantz），是大戟科植物，
原产于南美洲亚马逊河盆地，一年生木本灌木，是
世界上第 5 大粮食作物，是非洲一些国家人们生存
的主要食物来源［1］。木薯最大的优点是不与其他粮
食作物争地，在其他作物无法生长的干旱地区，可
以很好的生长。这一特性值得人们进行研究。抗旱
相关基因的表达需经历逆境信号的接受、转导、诱
导基因的转录以及功能基因的转录后 3 个不同水平
收稿日期 ：2014-02-28
基金项目 ：国家重点基础研究发展计划（2010CB126601），海南省重大科技专项（ZDZX2013023-1-10）
作者简介 ：于晓玲，女，博士研究生，副研究员，研究方向 ：农业生物技术 ；E-mail ：lingdang01@126.com
通讯作者 ：彭明，男，博士，研究员，研究方向 ：植物遗传学 ；E-mail ：mmpeng_2000@yahoo.com
木薯干旱响应基因 MeHDS1 的克隆与分析
于晓玲1，2  阮孟斌2  王树昌2  彭明2
（1. 海南大学农学院，海口 570228 ；2. 中国热带农业科学院热带生物技术研究所，海口 571101）
摘 要 ： HD-Zip 是植物中所特有的转录因子，在植物体响应环境因子过程中起着重要的作用。以木薯 cDNA 为模板，利用
RT-PCR 技术从木薯中克隆了一个 HD-Zip 家族成员基因全长，命名为 MeHDS1。序列分析结果表明，MeHDS1 具有 822 个氨基酸，
分子量 89.07 kD，等电点为 5.79，其开放阅读框长 2 469 bp，具有典型 HD 结构域及 START 结构域。该转录因子与棉花 GL2 蛋白
的同源性很高，推断其同属第 IV 亚家族。MeHDS1 蛋白内含有一个核定位信号，亚细胞定位试验结果也证明，MeHDS1 蛋白定位
于细胞核与细胞壁中。实时荧光 PCR分析表明，该基因在木薯根部表达量最高，受干旱诱导上调表达。通过对其生物信息学分析
及其在木薯中表达谱分析结果表明，MeHDS1 可能作为转录调控因子参与木薯非生物胁迫应答反应。
关键词 ： HD-Zip 转录因子 木薯 表达分析 亚细胞定位
Cloning and Functional Analysis of MeHDS1 from Cassava
Responsing Drought
Yu Xiaoling1，2 Ruan Mengbin2 Wang Shuchang1，2 Peng Ming2
（1. College of Agriculture，Hainan University，Haikou 570228 ；2. Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology，
CATAS，Haikou 571101）
Abstract: The HD-Zip transcription factors are unique to the plant kingdom. They play important roles in plant responsing to the
environmental factors. Based on the cDNA of cassava, using RT-PCR technology, one gene sequence was obtained, named it as MeHDS1. The
sequence was analyzed, we got a 2 469 bp gene which have integrated ORF, MeHDS1 encoded a protein which contained 822 amino acids
（89.07 kD）with an isoelectric point of 5.79. MeHDS1 have typical HD-domain, START domain. It has high homology to GL2 gene of cotton and
Arabidopsis, so it might belong to HD-Zip IV subfamily. There have a nuclear localization signal in MeHDS1 protein, and which was localized
in the nucleus and cell wall by subcellular localization assay in tobacco epidermal cells. Real-time PCR results showed that, MeHDS1 was
upregulated under drought, and its variation of expression was more highly in root cells than that in leaves cells. Through its bioinformatics and
expression analysis, we concluded that MeHDS1 may be involved in cassava abiotic stress responsed as a transcription factor.
Key words: HD-Zip transcription factor Cassava Expression analysis Subcellular localization
的调节。在逆境条件下，逆境相关的转录因子能与
顺式作用元件结合，从而调节功能基因的表达和信
号转导，它们在转基因植物中的过量表达会激活许
多抗逆功能基因的同时表达。
HD-ZIP 家族这一植物界独有的转录因子，包
含有单一的 homeodomain（HD）［2］与一个亮氨酸拉
链形成二聚体结构（b-zip）［3］。拟南芥中有 48 个成
员［3，4］，蛋白参与植物器官组织的发育过程、激素
2014年第10期 77于晓玲等：木薯干旱响应基因 MeHDS1的克隆与分析
作用途径、以及对环境条件的反应过程［5］。根据结
构域的保守性、基因结构及独特的生理功能，HD-
ZIP 可分为 4 个亚家族。其中，HD-Zip IV 的结构与
HD-Zip III 相似，只是缺少一个 MEKHLA 结构域。
这类蛋白与 GL2 家族相似性很高，也被命名为 HD-
Zip GL2［6］。HD-Zip IV 的 特 征 是 具 有 TAAA core，
其功能可能调控植物表皮细胞的分化［7］。科学家已
经从拟南芥［5，8，9］、棉花［10］、水稻［11］、玉米［12］等
不同植物中克隆得到 GL2 类转录因子，并对其功能
进行了研究，但在木薯中尚未有相关研究报道。本
研究从木薯中分离得到 1 个 GL2 类转录因子基因
MeHDS1，探讨该基因在不同组织中的表达差异及其
对逆境胁迫的反应，并对该蛋白进行亚细胞定位鉴
定，旨在为 MeHDS1 基因的进一步研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
木薯华南 124（SC124）由中国热带农业科学院
木薯种质资源圃提供 ；烟草（Nicotiana tabacum L.）
由本实验室保存 ；载体 pCAMBIA1300 ：GFP 由本试
验室保存 ；引物合成及基因克隆测序由生工生物工
程（上海）股份有限公司完成。
1.2 方法
1.2.1 MeHDS1 基因克隆 采用改良的 Tris 方法［13］
提取木薯叶片与根部混合样品总 RNA，依照 M-MLV
reverse transcriptase 试剂盒（TIANGEN）操作说明合
成第一链 cDNA。根据 HD-Zip 基因家族结构特点，
对 木 薯 序 列 数 据 库（http ：//www.phytozome.net/cass
ava.php）中序列进行 BLAST 比对，获得一个与植物
中 HD-Zip 转录因子具有较高同源性的 cDNA 序列。
利用软件 Vector NTI Advance 10 设计引物 ：5-TGT-
CGACGTGGTGAAACTT AATTTTAAG-3（ 含 有 Sal I
位 点 ）；5-TGGATCCCACAAAAGACCAGTTTAT-3
（含有 BamH I 位点），以第一链 cDNA 为摸板，通
过高保真酶进行 PCR 扩增，PCR 反应条件为 ：98℃
10 s，55℃ 10 s，72℃ 2 min，35 个 循 环 ；72℃
5 min。PCR 产物纯化后连接到 pMD18-T 载体上，送
往生工生物工程（上海）股份有限公司测序，获得
的具有完整开放阅读框的基因序列进行下面进一步
的分析。
1.2.2 生物信息学分析 利用在线软件进行生物信
息学分析 ：（1）基因结构域分析（http ：//www.ncbi.
nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）；（2） 预 测 MeH-
DS1 分子量及等电点：Compute pl/Mwtool，ExPASy 软
件（http ：//au.expasy.org/tools/pi_tool.html）；（3） 转
录因子核定位信号预测 ：PSORT（http ：//psort.hgc.
jp/）；（4） 蛋 白 质 空 间 结 构 预 测（http ：//www.sbg.
bio.ic.ac.uk/phyre2/）。
1.2.3 表达模式分析 待木薯 SC124 生长 3 个月（株
高约 1 m）后，选取长势相近的植株进行断水干旱
处理，以正常浇水的植株作为对照处理。每个处理
3 盆植株，平行 3 次重复。12 d 后，分别提取木薯
SC124 的根、不同位置叶片、混合叶片总 RNA，经
DNaseI 消化后，反转录第一链 cDNA。采用 qPCR
的方法对 MeHDS1 基因的表达谱进行分析。
1.2.4 植 物 表 达 载 体 构 建 中 间 载 体 pMD18-
MeHDS1 和 植 物 表 达 载 体 pCAMBIA1300 ：GFP 质
粒各约 2 μg，经限制性内切酶 BamH I 和 Sal I 37℃
消化 3 h 后，凝胶回收目的条带 ；经 T4 DNA 连接
酶 16℃连接过夜后，转化 DH5α 感受态细胞。对重
组质粒进行酶切、PCR 鉴定，最终阳性克隆命名为
pCAMBIA1300∷GFP∷MeHDS1。
将构建好的植物表达载体通过冻融法（液氮中
5 min，42℃水浴 5 min）转化农杆菌 LBA4404 感受
态细胞，在含有 Rif+ 25 mg/L、Kan+ 50 mg/L 和 Chl+
25 mg/L 的 YEB 平板上培养，PCR 鉴定为阳性的克隆，
可进行后续的亚细胞定位试验。
1.2.5 亚细胞定位 采用 6 000 r/min 离心 10 min，
收集 LBA4404/P1300∷GFP∷MeHDS1（OD600 为 0.8）
菌体，利用 10 mmol/L MgCl2（+100 μmol/L AS）缓冲
液重悬菌体，采用针筒注射的方法，注射烟草叶片
背面细胞，共培养 72 h 后，采用共聚焦显微镜观察，
拍照分析。
2 结果
2.1 MeHDS1基因克隆与序列分析
通过 RT-PCR 方法获得一个来源于木薯 SC124
品种的，具有完整开放阅读框（open reading frame，
ORF），长 2 469 bp 的基因序列。该基因序列经过结
构域分析（图 1）发现其包含一个 HD 结构域（长
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第10期78
59 个氨基酸）、一个 START 结构域（长 229 个氨基
酸）及一个 LZ 区域。NCBI 数据库 BLAST-p 结果表
明，该序列与葡萄 HD-Zip 基因（GenBank 序列号为
XP_002272264）具有很高的同源性（93%）。
序列分析表明 ：MeHDS1 基因编码 822 个氨基
酸，预测其分子量为 89.07 kD，等电点为 5.79。在
基因内发现一个核定位信号（P113-PRKKRYH），符
合转录因子细胞区室定位特征 ；通过对 MeHDS1 蛋
白的空间结构预测分析发现其具有 3 个螺旋结构
（图 2）。
BLAST-p 分 析 结 果 表 明，MeHDS1 蛋 白 与 棉
花 GL2 蛋白的同源性很高，因此推测其可能属于
HD-Zip IV 亚家族成员。将 MeHDS1 氨基酸序列与
GenBank 中已登录的、已知功能的拟南芥 HD-Zip IV
亚家族成员进行序列比对，并构建系统进化树，进
行系统发育分析。结果（图 3）显示，MeHDS1 与
GL2 基因同源性最高，因此进一步推断 MeHDS1 可
能是 HD-Zip IV 亚家族 GL2 类转录因子。
A ：氨基酸序列图 ；B ：蛋白结构域于示意图（颜色标识见电子版）
图 1 MeHDS1 氨基酸序列（A）及蛋白保守结构域（B）分析
B
A
Multi-domains
Superfamilies
Specific hits
DUF1640
START_ArGLABRA2_like
SRPBCC superfamily
RF +1
1 500 1000 1500 2000 2472
specific DNA base comtacts
DNA bimding site
pwtative lipid bimding site
homeodomai
homeodomai
801
751
701
651
601
551
501
451
401
351
301
251
201
151
101
51
1
ѪSTART㔃ᶴฏ˗ ѪHD㔃ᶴฏ˗ ѪLZ㔃ᶴฏ˗ ѪSAD㔃ᶴฏ
图 2 MeHDS1 蛋白空间结构预测
MeHDS10.2599
AtGL20.3237
AtHDG110.2541
AtHDG40.3366
AtGL2（Acc. AEE36312.1）、AtHDG11（Acc. AEE35449）、
AtHDG4（Acc. Q8L7H4.1）
图 3 MeHDS1 与其他物种已知为 HD-Zip IV 家族系统进
化树分析
2014年第10期 79于晓玲等：木薯干旱响应基因 MeHDS1的克隆与分析
2.2 表达模式分析
选取生长 3 个月，长势均匀的木薯 SC124，进
行干旱处理，干旱 12 d 后，提取叶片、叶柄和根的
总 RNA，反转录合成第一链 cDNA。针对基因区特
异性片段设计引物，采用 Real-time PCR 手段分析
MeHDS1 基因在木薯不同组织中的表达模式，结果
（图 4-A）显示 ：干旱处理 12 d 的木薯不同组织中，
MeHDS1 基因的表达量存在差异，在叶中的表达量
明显高于根中 ；干旱处理后，MeHDS1 基因在根与
叶片组织中的表达量都有不同程度的增加，但增加
的幅度在根中较叶片中要大。
在木薯植株不同位置的叶片（形态学上自下
而 上 分 别 为 L1、L2、L3、L4（ 顶 芽 ）） 组 织 中，
MeHDS1 基因的表达量存在差异，接近植株顶端的
功能叶片（L3）中，MeHDS1 基因的表达量最高 ；
接近基部的叶片（L1）基因表达量较小。
2 469 bp 的 MeHDS1 基因的 cDNA 编码序列，条带
单一，回收后送往测序，验证序列为正确序列。将
目的片段纯化后，用限制性内切酶 BamH I 和 Sal I
酶切（图 5-A），回收目标片段（图 5-A-MeHDS1 箭
头所示）；同时，将 pCAMBIA1300∷GFP 用限制性
内切酶 BamH I 和 Sal I 酶切（图 5-A），回收回收目
标大片段（图 5-A-1300 箭头所示）；将 MeHDS1 目
标片段与 pCAMBIA1300∷GFP 大片段利用 T4 DNA
连接酶进行连接后，转化大肠杆菌 DH5α 感受态细
胞，于带有 Kan+ 抗性的 LB 平板上筛选阳性克隆。
将 PCR/ 酶切鉴定为阳性的克隆质粒（图 5-B）进
行测序，结果表明序列是正确的，无移码突变，命
名 为 pCAMBIA1300∷MeHDS1∷GFP。 采 用 冻 融 法
将 pCAMBIA1300∷MeHDS1∷GFP 质粒转入农杆菌
LBA4404 菌株，用于后续功能分析。
图 6 MeHDS1 蛋白的亚细胞定位
0.26 1.11
54.99
43.92
0
10
20
30
40
50
60
Leaf_CK Leaf_D12 Root_CK Root_D12
⴨ሩ㺘䗮䟿
0
0.5
1
1.5
2
2.5
L1 L2 L3 L4
⴨ሩ㺘䗮䟿
A
B
A：干旱胁迫条件下，相对于内参基因 Actin，MeHDS1 基因的表达模式；
B ：干 旱 胁 迫 下， 干 旱 胁 迫 材 料 相 对 于 对 照（ 正 常 浇 水 ） 材 料，
MeHDS1 基因的表达模式
图 4 q-PCR 分析 MeHDS1 基因表达模式
2.3 植物表达载体构建
利用带有酶切位点的引物进行 PCR 扩增，得到
2469
bp bp
15000
2500
MeHDS1
A B
1300 M
A ：双酶切产物 ；B ：重组质粒双酶切结果
图 5 限制性双酶切图
2.4 亚细胞定位
本试验将构建好的带有 1300∷GFP∷MeHDS1
表达框的植物表达载体，转化农杆菌 LBA4404。采
用注射方法转化烟草叶片，共培养 72 h。将共培养
后的叶片经 20% 甘油处理后，进行压片，置于激光
共聚焦显微镜下观察。荧光分析结果（图 6）表明 ：
融合了 GFP 的 MeHDS1 蛋白在烟草叶片细胞的细胞
20 μm 20 μm 20 μm
Merged signals GFP signals bright-field
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第10期80
壁及核内表达，初步表明 MeHDS1 蛋白定位于细胞
核内和细胞壁上。
3 讨论
木薯属于典型的抗旱、耐贫瘠作物［14］。我国南
方地区，在其他作物无法生长的边缘地带都可以见
到它们的身影，其作用机理尚无确切的报道。针对
木薯抗旱基因的克隆及抗逆作用机理的研究，无论
是对其他作物的遗传改良还是自身品种改良都具有
尤为重要的作用。
本研究自 SC124 木薯品种中克隆得到一个干旱
胁迫下差异表达基因的 MeHDS1。生物信息学分析
结果显示，该蛋白具有一个核定位信号 ；基因的亚
细胞定位试验结果表明 MeHDS1 在核及细胞壁中得
到表达，因此推测，MeHDS1 可能是一种转录因子。
转录因子是细胞中重要的调节机制［15］，目前得到的
HD-Zip 家族成员多是定位于细胞核中［16］。
MeHDS1 蛋白空间结构预测表明，该蛋白具有
1 个保守的 HD 结构域、1 个 LZ 区域、1 个 START
结 构 域（Steroidogenic acute regulatory protein-related
lipid transfer）。因此，初步推断该基因应该属于 HD-
Zip 家族中的一员 ；空间结构分析显示 MeHDS1 蛋
白具有典型的 3 个螺旋结构，HD-zip 家族多是该结
构［5］。另外，通过 BLAST 分析得知，MeHDS1 蛋白
与棉花 GL2、小麦 TaGL9 及拟南芥 AtGL2 都具有很
高的同源性。因此，我们推断 MeHDS1 蛋白可能属
于 HD-Zip IV 亚家族。
HD-Zip IV 这类蛋白与 GL2 家族相似性很高，
也被命名为 HD-Zip GL2［6］，它的特征是具有 TAAA
core，其功能可能调控植物表皮细胞的分化［7］。干
旱胁迫下，木薯根系中 MeHDS1 蛋白表达显著升高，
我们推测干旱胁迫下该蛋白可能参与根细胞分化的
调节，具体作用机制有待进一步研究。
4 结论
本 研 究 基 于 木 薯 SC124 cDNA， 利 用 RT-
PCR 技术成功克隆获得 1 个 HD-Zip 家族成员基因
MeHDS1。序列分析表明，其编码 822 个氨基酸，分
子量 89.07 kD，等电点为 5.79，其开放阅读框长 2
469 bp，具有典型 HD 结构域及 START 结构域。系
统进化树分析结果表明，其与棉花 GL2 蛋白的同
源性很高，推断其同属第 IV 亚家族。生物信息学
分析表明 MeHDS1 蛋白内含有一个核定位信号，通
过亚细胞定位试验证明了此推断，该蛋白在细胞核
中优势表达。实时荧光定量 PCR 分析结果表明 ：
MeHDS1 基因在叶片中的表达量比根部高 ；干旱胁
迫可不同程度提高该基因的表达，且 MeHDS1 基因
在根部表达量升高的幅度较叶片组织增幅要大 ；干
旱胁迫条件下，木薯植株顶端功能叶中 MeHDS1 基
因的表达量显著高于底部叶片。将 MeHDS1 基因构
建了植物过量表达载体，并成功在烟草叶片中实现
表达。
参 考 文 献
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（责任编辑 狄艳红）