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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第6期
目前，国内外生物柴油的制备已经形成产业化
的工艺主要是化学催化工艺，一般都采用 NaOH、
KOH、金属醇钠和浓 H2SO4
［1］，但原料甘油三酯中
收稿日期 ：2012-12-03
基金项目 ：国家自然科学基金项目（31160229），科技部农业科技成果转化资金项目（2010GB2F300436）
作者简介 ：张学林，男，硕士研究生，研究方向 ：酶的开发和应用 ；E-mail ：ynzhangxuelin@163.com
通讯作者 ：黄遵锡，男，博士，教授，博士生导师，研究方向 ：发酵工程和酶工程 ；E-mail ：huangzunxi@163.com
响应面法优化小桐子油制备生物柴油工艺的研究
张学林1，5  唐湘华1-5  李俊俊1-5  宋拓1，5  慕跃林1-5
许波1-5  杨云娟1-5  黄遵锡1-5
（1. 生物能源持续开发利用教育部工程研究中心，昆明 650500 ；2. 云南省酶资源开发与应用工程研究中心，昆明 650500 ；3. 云南省生物质
能与环境生物技术重点试验室，昆明 650500 ；4. 云南师范大学酶工程重点试验室，昆明 650500 ；
5. 云南师范大学生命科学学院，昆明 650500）
摘 要 ： 利用响应面分析法对小桐子油制备生物柴油的工艺进行了优化。在单因素的基础上选取试验因素和水平，首先
应用 Plackett-Burman 试验设计筛选影响脂肪酶催化小桐子油制备生物柴油的重要参数，采用最陡爬坡试验逼近最大甲酯转化率
区域后，利用 Box-Behnken 设计确定重要因素的最佳水平。预测值和试验值吻合良好（R2 为 0.999 ；R2 的调整值为 0.998），表明
利用 BBD 试验设计对该工艺的优化是成功的，模型具有较好的适用性。优化结果表明影响甲酯得率的重要参数是 ：醇油摩尔比、
脂肪酶量和正己烷量，最佳的酯化条件是醇油摩尔比 1.72∶1，脂肪酶量为每克油脂添加 112.5 U 的量，正己烷添加量为油重的
11.96%，水添加量为油重的 20%，反应温度为 25℃，反应时间为 24 h。优化条件与初始条件相比较，甲酯得率提高了 2%-3%。
关键词 ： 小桐子油 脂肪酶 生物柴油 响应面分析
Response Surface Methodology to Optimize Biodiesel Production
Conditions by Jatropha curcas oil
Zhang Xuelin1，5 Tang Xianghua1-5 Li Junjun1-5 Song Tuo1，5 Mu Yuelin1-5
Xu Bo1-5 Yang Yunjuan1-5 Huang Zunxi1-5
（1. Engineering Research Center of Sustainable Development and Utilization of Biomass Energy，Ministry of Education，Kunming 650500 ；
2. Enzymatic Resources Development and Application Engineering Research Center of Yunnan Province，Kunming 650500 ；3. Key Laboratory
of Yunnan Province for Biomass Energy and Environmental Biotechnology，Kunming 650500 ；4. Key Laboratory of Enzyme Engineering of
Yunnan Normal University，Kunming 650500 ；5. Life Science School of Yunnan Normal University，Kunming 650500）
Abstract:  Response surface methodology（RSM）was used to optimize the conditions for biodiesel production by Jatropha curcas oil.
Based on the single factor experiment, we screened the important parameters by Plackeet-burman design, and used the path of steepest ascent
to approach to the biggest methyl ester yield production subsequently. Then, we obtained the optimum values of the parameters by Box-Behnken
design. Predicted values were found to be in good agreement with experimental values（R-sq=0.999 and Adj R-sq=0.998）, which indicated
suitability of the model employed and the success of BBD in optimizing the conditions of biodiesel production process. The optimum technical
conditions were：alcohol to oil molar ratio 1.72∶1, lipase concentration 112.5 U each gram of oil, n-hexane content 11.96%, water content 20 %,
reaction temperature at 25 ℃ , and reaction time for 24 h. The methyl ester was higher 2%-3% than that under the original condition.
Key words:  Jatropha curcas oil Lipase Biodiesel Response surface methodology
存在一定量的游离脂肪酸和水会影响反应速度和酯
化率，同时增加产物分离的难度，不仅后处理复杂
且易污染环境。以脂肪酶作为催化剂，不仅对原料
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第6期184
要求低，而且游离脂肪酸可以被脂肪酶直接酯化，
反应条件温和，醇用量少，副产物甘油分离简单，
降低了生产工艺要求和生产成本，因而脂肪酶法制
备生物柴油被认为是取代化学法生产生物柴油的绿
色工艺［2-4］。酶促合成生物柴油的主要问题是脂肪
酶的成本价高，催化反应速率慢，酶易失活等。液
体脂肪酶具有生产成本低，反应速率快的优点［5-7］，
且不受底物、产物的扩散限制，产物、副产物易分离。
另外，液体脂肪酶生产工艺简单，成本低廉，在生
物柴油合成领域还少见报道。
本研究利用本试验室小型发酵罐制备的液体脂
肪酶作为催化剂，以小桐子油为原料，通过对试验
进行统计学设计和数据分析，筛选出对制备工艺影
响最大的关键因素，进一步通过响应面理论（RSM）
对酶法制备生物柴油的工艺条件进行优化研究。
1 材料与方法
1.1 材料
小桐子油（当地购买），无水甲醇（分析纯），
正己烷（分析纯），液体脂肪酶（试验室发酵自制，
酶 活 单 位 ：40 000 U/mL）， 十 三 烷 酸 甲 酯（ 购 自
Sigma 公司），GC7890-MS5975（美国安捷伦科技公
司），PL203 电子分析天平，TS-100B 天呈恒温可调
速摇床，Centrifuge5810R 高速冷冻离心机。
1.2 方法
1.2.1 转酯化反应 在 100 mL 具塞三角瓶中加人
15 g 小桐子油和适量的甲醇和正己烷溶剂混合物，
并置于可自动控温的往复摇床中加热至一定温度后，
加入一定量的液体脂肪酶，脂肪酶的加入量按每克
油脂添加一定的单位计算，定时取反应液用于甲酯
含量的分析。将所取 100 μL 反应液离心分层，取上
层液与十三烷酸甲酯（内标物）混合溶于正己烷中，
振荡均匀，取 1 μL 注入气质联用分析，由气质联用
测定反应物中的脂肪酸甲酯含量。
1.2.2 气质联用分析方法［8］ 反应混合物中脂肪酸甲
酯的含量用十三烷酸甲酯作为内标，GC-MS 色谱条
件为：色谱柱为 HP-5MS（30 m×250 μm×0.25 μm）；
载气为高纯氦气（He），流速 1.0 mL/min ；二阶升温
程序 ：170℃保持 0 min，然后 10℃/min 到 190℃，
持 续 1 min ；再 以 0.8 ℃ /min 升 温 至 207 ℃， 持 续
1 min ；进样量为 1 μL 分流进样，分流比 40∶1 ；
进 样 口 温 度 250℃。 质 谱 条 件 ：EI 离 子 源 温 度
230℃，四级杆温度 150℃，溶剂延迟 2 min ；质量
扫描范围 0.05-0.55 kD，选用数据库为 ：NIST08.L。
1.2.3 数 理 统 计 分 析 方 法 Plackett-Burman［9］ 设
计是一种有效的两水平试验设计方法，它适用于从
众多的考察因素中快速有效地筛选出最为重要的因
素。酶催化制备生物柴油工艺中涉及的参数较多，
Plackett-Burman 适合于本试验的设计。
最陡爬坡试验设计 ：响应面拟合方程只有在考
察的紧接邻域里才充分近似真实结果，故只有在最
先逼近最大目标产物产量区域后才能建立有效的响
应面拟合方程。最陡爬坡法以试验值变化的梯度方
向为爬坡方向，根据各因素效应值的大小确定变化
步长，能快速、经济地逼近最大甲酯区域。
响应面（RSM）试验设计［10］：逼近最大甲酯区
域后，采用 Box-Behnken 设计法，对其关键因子进
行进一步研究，每个因素取 3 个水平，以（1，0，1）
编码。根据相应的试验表进行试验后，对数据进行
二次回归拟合，得到带交互项和平方项的二次方程：
2
1
0 ∑∑∑ +++=
<=
iiiji
k
ji
iji
k
i
iY χβχχβχββ
其中 Y 是预测变量值 ；xi 和 xj 是自变量，β0，βi，βii
和 βij 待估测值，对拟合所得模型进行分析，最后在
一定水平范围内求出最佳值。用 Minitab15.0 软件对
试验数据进行回归拟合，并对拟合方程作显著性检
验和方差分析。
2 结果
2.1 Plackett-Burman设计筛选影响甲酯得率的因素
在之前单因素试验的基础上确定各个因素及因
素水平，采用 Plackett-Burman 设计从 7 个影响因素
中筛选出具有显著影响因素。每个因素取 2 个水平：
即高水平（+1）和低水平（-1）。如表 1 和表 2 所示。
试验结果利用 Minitab 15.0 软件进行回归分析，得到
R-sq 值为 98.2%，拟合度较高 ；且得到醇油比、酶
添加量、正己烷量影响显著，反应温度影响极显著。
2.2 最陡爬坡试验设计及其结果
由 Plackett-Burman 试验可知，对于酶法催化地
沟油制备生物柴油的工艺中，醇油比、酶添加量、
2013年第6期 185张学林等 ：响应面法优化小桐子油制备生物柴油工艺的研究
正己烷量影响显著，反应温度影响极显著。但本研
究主要考虑到能耗成本和具体生产实际，试验在其
他无显著影响的因素和最适反应温度（25℃）都采
用单因素得到的最佳水平下，进行最陡爬坡试验，
其中，醇油摩尔比和脂肪酶添加量有显著负效应，
正己烷添加量有显著正效应。根据这 3 个因素效应
大小比例设定其变化方向及步长，试验设计和结果
如表 3 所示。由以上试验结果可知，最高的甲酯得
率在第 2 次试验，故选其作为响应面的中心点，醇
油摩尔比、脂肪酶量和正己烷量分别为 1.8∶1、脂
肪酶添加量按每克油脂 120 U 添加、正己烷添加量
为油重的 11%。
表 3 最陡爬坡试验设计和结果
序号 醇油摩尔比 脂肪酶量（U/g） 正己烷量（w/w） 甲酯得率（%）
1 2.0∶1 130 5% 93.2
2 1.8∶1 120 8% 95.25
3 1.6∶1 110 11% 94.71
4 1.5∶1 100 14% 94.2
5 1.4∶1 90 17% 93.38
6 1.2∶1 80 20% 92.24
7 1.0∶1 70 23% 90.56
2.3 响应面设计确定显著影响因素的最佳水平
根据最陡爬坡试验确定的试验因素中心点，运
表 2 Plackett-Burman 试验设计结果
序号 A B C D E F G H 甲酯得率（%）
1 1 -1 1 1 -1 1 -1 -1 93.66
2 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 94.33
3 -1 1 1 1 -1 1 1 -1 91.11
4 1 1 -1 1 1 -1 1 -1 76.13
5 1 -1 1 -1 -1 -1 1 1 93.77
6 -1 1 -1 -1 -1 1 1 1 89.17
7 -1 -1 -1 1 1 1 -1 1 88.85
8 1 1 -1 1 -1 -1 -1 1 91.57
9 -1 -1 1 1 1 -1 1 1 91.45
10 1 -1 -1 -1 1 1 1 -1 77.29
11 1 1 1 -1 1 1 -1 1 79.23
12 -1 1 1 -1 1 -1 -1 -1 87.42
回归系数 -2.557 -2.060 1.608 0.963 -4.437 -1.280 -1.345 1.175
P 值 0.014 0.025 0.046 0.144 0.003 0.079 0.071 0.096
显著性 * * * **
R-sq=98.2%，R-Sq（adj）= 93.3%
* 表示差异显著 ；** 表示差异极显著
表 1 Plackett-Burman 试验设计及各因素水平
因素代码 名称 实际低值 实际高值
A 醇油比（mol/mol） 2∶1 3.2∶1
B 脂肪酶量（U/g） 130 210
C 正己烷量（w/w） 0.05 0.08
D 水添加量（w/w） 0.2 0.32
E 反应温度（℃） 25 40
F 反应时间（h） 24 38.5
G 甲醇添加次数 2 3
H 空白 -1 +1
用 Box-Behnken 的中心组合设计原理，对 Plackett-
Burman 试验确定的 3 个显著性影响因素各取 3 个水
平进行试验设计，设计的响应面因素和水平如表 4
所示，结果如表 5 所示。
利用软件 Minitab 15.0 对试验结果进行分析，得
到的二次回归方程如下 ：
甲酯得率 =9.88+42.81*A+0.51*B+2.62*C+0.07A
B+0.16*AC-4.47*10-4BC-15.3*A2-2.7*10-3B2-0.12*C2。
进一步对结果进行方差分析，如表 6 所示。由
表 6 的方差分析结果可以看出，该模型回归显著
（P<0.0001），二次项影响均是非常显著的，失拟项
为 0.8168， 不 显 著， 且 该 模 型 的 R-Sq=0.999，Adj
R-sq=0.998，因此，可以用该回归方程代替试验真
实点对试验结果进行分析。根据回归方程求一阶偏
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第6期186
导，得到甲酯得率的极大值是 ：A=1.72，B=112.5
U/g ；C=11.96%。也就是在醇油比为 1.72∶1 ；脂肪
酶量 112.5 U/g ；正己烷量 11.96%。在该条件下对模
型预测值进行试验验证，6 次验证试验结果平均值
为 95.85%，与模型预测值基本吻合，这能有效说明
该试验选用的模型是合理的。通过 Minitab 15.0 软件
对上述回归方程绘制响应面曲线，如图 1-图3。
表 4 响应面设计的因素和水平
编码 因素
水平
-1 0 +1
A 醇油摩尔比 1∶1 1.8∶1 2.6∶1
B 脂肪酶量（U/g） 80 120 160
C 正己烷量（%） 5 11 17
表 5 Box-Behnken 响应面试验设计
试验序号 醇油
脂肪酶量
（U/g）
正己烷量
（%）
实际得率
（%）
预测得率
（%）
1 0 -1 -1 84.74 84.88
2 -1 0 +1 84.3 84.5
3 0 -1 +1 88.9 88.96
4 +1 0 -1 78.22 78.02
5 0 0 0 96.18 96.09
6 0 +1 +1 90.34 90.2
7 -1 0 -1 81.63 81.75
8 +1 0 +1 83.96 83.84
9 0 0 0 95.96 96.09
10 -1 -1 0 85.2 84.94
11 0 0 0 95.81 96.09
12 -1 +1 0 81.15 81.09
13 0 +1 -1 85.75 85.69
14 +1 -1 0 77.8 77.86
15 0 0 0 96.24 96.09
16 0 0 0 96.27 96.09
17 +1 +1 0 83.5 83.76
3 讨论
近年来响应面法在优化生物柴油制备工艺得到
了广泛应用，并取得了良好的效果。Saraphirom 等［11］
利用响应面法优化利用甜高粱糖浆制氢工艺，可以
有效减少高粱糖浆制氢过程的误差，高静等［12］利
用响应面法优化脂肪酶催化废油脂合成生物柴油的
工艺，最佳工艺条件下，反应的转化率高达 94.6%。
已 有 的 研 究 表 明， 醇 油 摩 尔 比、 催 化 剂 用
量和有机溶剂的用量是影响反应转化率的重要因
素［13-15］。本试验研究与目前酶法制备生物柴油的工
艺相当，最重要的是本研究影响反应转化率的工艺
条件时都是在较低温度（约 25℃）条件下进行的，
得到以脂肪酶催化小桐子油制备生物柴油的转化率
高达 96%，达到了酶催化制备生物柴油的较高水平。
此外，小桐子作为能源作物，无论是种植面积和产
油率都决定了其作为一种生产生物柴油的原料奠定
了基础［16］。
4 结论
利用响应面分析方法对提高酶法催化小桐子油
制备生物柴油的工艺优化是有效的。因此，该工艺
表 6 响应面试验的方差分析结果
项目 平方和 自由度 均方 F 值 P 值 显著性
模型 688.42 9 76.49 1154.01 <0.0001 **
A 9.68 1 9.68 146.04 0.0214
B 2.1 1 2.1 31.7 <0.0001
C 36.81 1 36.81 555.32 <0.0001
AB 23.77 1 23.77 358.55 <0.0001
AC 2.36 1 2.36 35.55 0.0006
BC 0.046 1 0.046 0.7 0.4312
A2 403.74 1 403.74 6091.16 <0.0001
B2 81.04 1 81.04 1222.7 <0.0001
C2 76.85 1 76.85 1159.44 <0.0001
残差 0.31 7 0.066
失拟差 0.31 3 0.1 2.58 0.1915
净误差 0.16 4 0.04
总离差 688.88 16
图 1 醇油摩尔比和酶量对甲酯得率的影响
100
95
85
75
160
140
120
100
1.00
1.40
1.80
2.20
2.60
80
㜲㛚䞦䟿U/g 䞷⋩᪙ቄ∄
⭢䞟
ᗇ⦷
%
80
90
2013年第6期 187张学林等 ：响应面法优化小桐子油制备生物柴油工艺的研究
最佳的操作条件为 ：醇油摩尔比为 1.72∶1 ；脂肪酶
量按每克油脂添加 112.5 U 的量添加 ；正己烷添加
量为油重的 11.96% ；水添加量为油重的 20% ；反应
温度为 25℃ ；反应时间为 24 h，在该工艺条件下，
酶催化得到的甲酯得率最高，且具有较好的重复性；
另外，该工艺可完全在较低温度下完成酶的催化反
应，降低了工艺的能耗成本和生产的安全性。
参 考 文 献
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（责任编辑 李楠）
100
95
85
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17.00
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8.00
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5.00
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图 2 醇油摩尔比和正己烷量对甲酯得率的影响
图 3 酶量和正己烷量对甲酯得率的影响
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