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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第1期
收稿日期 : 2011-07-01
作者简介 : 刘明 , 男 , 硕士研究生 , 研究方向 : 分子疫苗 ; E-mail:breezemail@126.com
通讯作者 : 柳纪省 , 研究员 , 博士生导师 , 研究方向 : 动物传染病及其分子流行病学 , E-mail:liujixing@hotmail.com
A 型口蹄疫病毒 VP0 基因的克隆及原核表达
刘明 刘航 柳纪省
（中国农业科学院兰州兽医研究所 家畜疫病病原生物学国家重点实验室 农业部兽医公共卫生重点开放实验室，兰州 730046）
摘 要： 从实验室冻存的含 A 型口蹄疫病毒的细胞中提取 FMDV 总 RNA，通过 RT-PCR 获得 cDNA。并根据 FMDV 全基因
组序列设计了一对针对 VP0 基因的引物，通过 PCR 扩增得到目的基因 VP0 并亚克隆入 pMD18-T 载体。将鉴定出的阳性质粒和表
达载体 pET32a 用 BamHⅠ和 Hind Ⅲ双酶切回收后连接获得阳性重组质粒 pET32-VP0。用 IPTG 诱导重组质粒表达目的蛋白 VP0 并
用 SDS-PAGE 进行检测。表达产物用镍亲和树脂进行了纯化。结果证明，口蹄疫病毒 VP0 蛋白在大肠杆菌中获得了高效表达且表
达产物得到了纯化，为实验室进一步的研究提供了重要的材料。
关键词： 口蹄疫病毒 VP0 基因 原核表达
Cloning and Prokaryotic Expression of VP0 Gene of Foot-and-mouth
Disease Virus (FMDV) Type A
Liu Ming Liu Hang Liu Jixing
（Key Laboratory of Veterinary Public Health of the Ministry of Agriculture, State Key Laboratory of Veterinary Etiological Biology, Lanzhou
Veterinary Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Lanzhou 730046）
Abstract: Extract the RNA of FMDV tape A from frozen cells was extracted, and then the cDNA was acquired by RT-PCR. A special
primer pair was designed which contain BamHⅠ and Hind Ⅲ according to complete genome of FMDV. The target gene VP0 was amplified by
PCR and subcloned into pMD18-T vector. pMD-VP0 and expression vector pET-32a were digested by with BamH Ⅰ and Hind Ⅲ ; gene VP0
was ligated into pET-32a, which formed recombinant plasmid pET32-VP0 after identification. The interest gene was induced to express in E.coli
with IPTG and identified with SDS-PAGE. The target protein was purified with Ni-NTA Purification System. Result showed that the target protein
was expressed in E.coli and also purified.
Key words: Foot-and-mouth disease virus VP0 gene Prokaryotic expression
口蹄疫（foot-and-mouth disease, FMD）是由口蹄
疫病毒（foot-and-mouth disease virus, FMDV）感染偶
蹄类动物后引起的一种急性、热性、高度接触性传
染病。家畜中牛、猪、山羊、绵羊等均为易感动物。
FMDV 属于小核糖核酸病毒科口蹄疫病毒属，主要
有 7 个 血 清 型， 分 别 为 A、C、O、SAT1、SAT2、
SAT3 以及 AsiaI 型。每个血清型又包含若干个亚型。
由于 FMDV 血清型众多，加之传染性极强，因此，
FMD 给世界多个国家造成了严重的经济损失，同时
严重影响了世界畜牧业的发展。FMDV 基因组由大
约 8 500 个核苷酸组成的单股线状 RNA 组成。病毒
RNA 只含有一个完整的开放阅读框，编码一个前体
的多聚蛋白，该前体蛋白经裂解后形成 3 种结构蛋
白，即 VP0、VP1 和 VP3。VP0 进一步裂解为 VP4
和 VP2。VP4 属于内部蛋白［1］，是决定病毒抗原性
的主要成分，它含有 B 细胞抗原表位和 T 细胞抗原
表位，能单独诱导动物机体产生中和抗体。同时，
VP2 和 VP4 是经细胞激酶磷酸化的，使衣壳变的不
稳定可能有利于核酸脱壳［2］。
本研究采用原核表达系统表达了 A 型口蹄疫
VP0 基因，并将表达的蛋白进行了纯化，旨在为本
实验室的进一步研究工作提供基础材料。
2012年第1期 105刘明等 ：A 型口蹄疫病毒 VP0 基因的克隆及原核表达
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 毒株、菌种和载体 A 型口蹄疫病毒为兰州
兽医研究所传染病室分离冻存 ；感受态细胞 DH5α、
BL21（DE3）以及表达载体 pET-32a 均为本实验室
保存。pMD18-T Simple 载体购自 TaKaRa 公司。
1.1.2 酶 和 相 关 试 剂 限 制 性 内 切 酶 BamH Ⅰ、
Hind Ⅲ以及 T4 DNA Ligase 为 Biolabs 产品，Ex Taq
Polymerase、AMV 反转录酶、RNase Inhibitor、Oligo
（dT）18、质粒小提试剂盒以及胶回收试剂盒等均为
大连宝生物公司产品。RNA 提取试剂盒为 Invitrogen
公司产品。其他常规试剂均为实验室分析纯试剂。
1.2 材料
1.2.1 引 物 的 设 计 与 合 成 根 据 已 测 序 的 A 型
FMDV 基因序列，设计了一对针对 VP0 基因片段的
引物，并在上游引物中加入 BamH Ⅰ酶切位点，在下
游引物中加入 Hind Ⅲ酶切位点，引物由上海生物
工程有限公司合成。VP0-F:5-CGCGGATCCGGAGCC
GGGCAATCCAGC-3；VP0-R:5-ATTAAGCTTGCCTCC
TTCGAGGGGAGTTC-3（下划线部分为酶切位点）。
1.2.2 FMDV 总 RNA 的提取及 cDNA 的扩增 RNA
的提取方法按照 TRIzol LS Reagent 试剂盒（Invitrogen）
操作说明书进行。然后以提取的 RNA 为模板，Oligo
（dT）18 为引物，利用 AMV 逆转录酶合成 cDNA。扩
增条件为 ：42℃保温 1 h。
1.2.3 VP0 基 因 的 克 隆 以 合 成 的 A 型 口 蹄 疫
cDNA 为模板，按如下程序进行 PCR 扩增 ：95℃预
变性 5 min ；94℃ 1 min，58℃ 45 s，72℃ 1 min 共进
行 30 个循环 ；然后在 72℃延伸 10 min。结束后用
10 g/L 琼脂糖凝胶电泳观察结果。PCR 产物经胶回
收纯化后亚克隆入 pMD18-T 载体，连接产物转化至
感受态细胞 DH5α 内，挑斑并提取重组质粒进行初
步酶切鉴定，将初步鉴定为阳性的重组质粒送上海
生物工程有限公司进行测序鉴定。并将鉴定为阳性
的重组质粒命名为 pMD-VP0。
1.2.4 重组表达载体的构建及鉴定 用 BamH Ⅰ和
Hind Ⅲ分别酶切重组质粒 pMD-VP0 和表达载体 pET-
32a，并回收目的片段 VP0 及载体大片段。两者按
适当的比例用 T4 DNA Ligase 进行连接。连接产物转
化感受态细胞 BL21（DE3）后，经 PCR 扩增及双酶
切初步鉴定正确后送上海生物工程有限公司进行测
序鉴定。并将鉴定的阳性质粒命名为 pET32-VP0。
1.2.5 重组质粒的诱导表达及表达产物的检测 将
阳性重组质粒 pET32-VP0 转化至感受态细胞 BL21
（DE3）中，挑取单菌落接种于 5 mL 含 50 μg/mL 氨
苄抗生素的 LB 培养基中过夜培养。取 200 μL 培
养液接种于 20 mL 含同样浓度氨苄抗生素的 LB 培
养基中，37℃培养至 OD600 为 0.5-0.8（0. 6 为最佳）
时， 加 入 不 同 浓 度 的 IPTG（0.25、0.5、0.75 和
1.0 mmol/L）继续培养 6 h 后收集菌液。表达产物用
SDS-PAGE 分析检测。
1.2.6 表达产物的纯化 取诱导的菌液 1 mL，采
用 Ni-NTA Purification System 纯化包涵体蛋白。首先
用结合缓冲液（8 mol/L 尿素、50 mmol/L NaH2PO4、
300 mmol/L NaCl，pH8.0） 溶 解 包 涵 体， 然 后 取
2 mL Ni2+ NTA 树脂并用结合缓冲液平衡两次。加入
溶解的包涵体温和振荡 1 h，待自然沉降后弃去结合
缓冲液，并用洗涤缓冲液（8 mol/L 尿素、50 mmol/L
NaH2PO4、300 mmol/L NaCl、5 mmol/L 咪唑，pH8.0）
清 洗 3 次， 最 后 用 洗 脱 缓 冲 液（8 mol/L 尿 素、
50 mmol/L NaH2PO4、300 mmol/L NaCl、150 mmol/L
咪唑，pH8.0）洗脱两次，并收集洗脱液。
2 结果
2.1 VP0基因的PCR扩增
以合成的 A 型口蹄疫病毒 cDNA 为模板，利用
特异性引物进行 PCR 扩增，扩增产物在 10 g/L 的琼
脂糖凝胶上进行电泳，结果（图 1）可见约 900 bp
的扩增条带，与预期大小一致。
M. DNA 标准 DL2000 ；1. VP0 基因的扩增产物
图 1 VP0 基因的 PCR 扩增
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第1期106
2.2 重组表达载体的酶切鉴定
将重组表达质粒 pET32-VP0 用 BamHⅠ和 Hind Ⅲ
进行双酶切，酶切产物在 10 g/L 的琼脂糖凝胶上进
行电泳，结果（图 2）可见约 900 bp 的目的条带，
证明重组质粒构建成功。
析证实，VP2 与 VP1 和 VP3 位于 FMDV 衣壳蛋白表
面，而 VP4 则深埋于衣壳蛋白内部与核心 RNA 相
连。VP4 是决定病毒抗原性的主要成分，有研究证
明，空衣壳蛋白和野毒粒子都具有免疫原性，而缺
少 VP4 的壳微体则无免疫原性。因此可以认为 VP4
蛋白发挥着重要的免疫原性作用［3］。而且构成 VP4
B 细胞表位的“G-H”环突出于病毒粒子的表面，环
内的 RGD 序列高度保守，是病毒识别宿主的主要位
点。因此，VP0 蛋白是研究 FMDV 基因工程疫苗的
重要基础。
本研究选用 pET-32a 作为表达载体，该表达载
体带有 6 个 His 标签，His 是一种高度可溶的多肽，
当其与目的蛋白融合表达时，可极大的增加目的蛋
白的可溶性。同时，目的蛋白与 His 标签共同表达，
也有利于目的蛋白的纯化。尽管原核表达系统不能
对表达的蛋白进行翻译后的修饰，但由于该系统具
有表达量大，成本低廉等优点而经常被用来表达外
源蛋白［4］。同时有多种在大肠杆菌中表达的蛋白具
有一定生物学活性的报道［5-8］。
4 结论
本试验成功的提取了 A 型 FMDV 的总 RNA，通
过 PCR 扩增得到了 VP0 基因，并将其连接到了表达
载体上，得到了阳性表达质粒 pMD-VP0，转化诱导
后得到了高效表达，实现了体外高效表达 VP0 蛋白。
同时利用镍亲和树脂纯化出了目的蛋白，为实验室
的进一步工作提供了重要的基础材料。
参 考 文 献
［1］ Bomer C. The Bcl-2 protein family: sensors and cheekpoints for life or
1. 阳性质粒的 BamHⅠ和 Hind Ⅲ双酶切产物 ；M. DNA 标准 DL2000
图 2 重组表达质粒的酶切鉴定
2.3 表达产物的SDS-PAGE电泳分析及纯化
取诱导后的不同样品进行 SDS-PAGE 电泳，结
果（图 3）表明，重组表达质粒在约 55 kD 处有一条
特异的蛋白条带，并且发现当 IPTG 浓度为 1 mmol/L
时 蛋 白 的 表 达 量 最 高。 表 达 产 物 采 用 Ni-NTA
Purification System 纯化后，在约 55 kD 处同样有一
条特异的目的条带（图 4）。
1-4. 浓度分别为 0.25、0.5、0.75、1.0 mmol/L IPTG 诱导表达的 VP0 蛋白 ;
M. 蛋白质分子质量标准
图 3 不同浓度 IPTG 诱导表达 VP0 蛋白的
SDS-PAGE 电泳结果
1. 纯化的 VP0 蛋白 ；M. 蛋白质分子质量标准
图 4 纯化的 VP0 蛋白的 SDS-PAGE 分析
3 讨论
VP0 蛋白是 FMDV 衣壳蛋白经蛋白酶 3C 裂解
后的中间体，会进一步裂解为 VP4 和 VP2。分别编
码 85 个氨基酸和 218 个氨基酸。经 X-射线衍射分
2012年第1期 107刘明等 ：A 型口蹄疫病毒 VP0 基因的克隆及原核表达
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（责任编辑 李楠）