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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第10期
木聚糖酶（1，4-β-D-xylanase，EC 3.2.1.8）是一
种重要的工业用酶，在造纸工业、食品、能源、饲
料及环境等领域中显示了广阔的应用前景，特别是
在纸浆生物漂白中的巨大应用潜力早已引起各界的
高度关注［1-3］。应用木聚糖酶预处理纸浆，其直接
收稿日期 : 2012-04-20
基金项目 : 国家自然科学基金项目（31101219）
作者简介 : 郑宏臣 , 男 , 博士研究生 , 研究方向 : 发酵工程 ; E-mail: hongchenzheng@yahoo.cn
通讯作者 : 路福平 , 男 , 教授 , 博士生导师 , 研究方向 : 微生物生物活性物质开发与工业微生物育种等 ; E-mail: lfp@tust.edu.cn
碱性木聚糖酶产生菌的筛选、XynG1-3基因克隆表达及
酶学性质研究
郑宏臣 刘逸寒 刘晓光 韩杨 王建玲 路福平
（天津科技大学生物工程学院 工业发酵微生物教育部重点实验室 工业酶国家工程实验室
天津市工业微生物重点实验室，天津 300457）
摘 要： 从造纸厂周边碱性土壤中分离、筛选到一株产碱性木聚糖酶的细菌 G1-3，根据形态和生理、生化特性并结合 16S
rDNA序列分析，鉴定菌株 G1-3为短小芽孢杆菌，命名为 Bacillus pumilus G1-3。利用克隆表达载体 pET-22b（+），实现了 Bacillus
pumilus G1-3碱性木聚糖酶基因 XynG1-3在 E. coli BL21 中的表达。经氨基酸序列分析，木聚糖酶 XynG1-3属于 GH11家族的小分
子木聚糖酶。重组木聚糖酶 XynG1-3经镍离子亲和层析一步纯化后，获得凝胶电泳条带单一的蛋白样品，经 SDS-PAGE检测其分
子量为 24 kD。对酶学性质进行分析，重组酶 XynG1-3最适作用温度为 55℃，最适作用 pH为 8.0 ；该酶在 60℃保温 1 h，残余酶
活保持为原来的 56%，pH作用范围较广，在 pH10.0下保存 1 h，残余酶活仍能保持 75%，为耐碱性木聚糖酶。
关键词： 短小芽孢杆菌 碱性木聚糖酶 筛选 鉴定 克隆 表达 酶学性质
Screening of Alkaline Xylanase Producing Strains and Cloning，
Expression and Characterization of Xylanase Gene XynG1-3
Zheng Hongchen Liu Yihan Liu Xiaoguang Han Yang Wang Jianling Lu Fuping
（Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology，Ministry of Education，National Engineering Laboratory for Industrial Enzymes，
Tianjin Key Laboratory of Industrial Microbiology，College of Biotechnology，Tianjin University of
Science and Technology，Tianjin 300457）
Abstract: A new alkaline xylanase-producing strain was isolated from alkaline soil around paper mill and was identified as Bacillus
pumilus G1-3 based on the evidence from its physiological and biochemical characteristics and 16S rDNA sequences. The gene coding for
XynG1-3 consists of 687 bp was cloned into the expression vector pET-22b and expressed in E. coli BL21（DE3）. XynG1-3 was determined
to be a new xylanase belonging to glycoside hydrolase family 11 based on its amino acid sequence. The recombinant xylanase was purified
by Ni2+-NTA affinity chromatography. The molecular weight of the purified XynG1-3 was estimated to be 24 kD by sodium dodecyl sulfate-
polyacrylamide gel electrophoresis. It revealed optimal activity at 55℃ and pH8.0 and remained high activity over a large range of pH （6.0-10.0）
which remained at least 75% residual activity at pH 10.0 for 1 h.
Key words: Bacillus pumilus Alkaline xylanase Screening Identification Cloning Expression Enzymic properties
作用就是降解浆中的木聚糖，降低浆中半纤维素的
含量，进而使纸浆中再沉淀的纤维素-半纤维素-木
素复合体结构变得松弛，形成脱木素或有利于脱木
素的状态。通过木聚糖酶的预处理，不仅可以提高
纸浆的白度，降低打浆的能耗，改善浆料的强度性
2012年第10期 107郑宏臣等 ：碱性木聚糖酶产生菌的筛选、XynG1-3 基因克隆表达及酶学性质研究
能，而且，可以减少后继工序中化学漂剂的用量，
降低废液中有毒物质的含量，减轻环境污染［4］。然
而，目前工业生产的大多为霉菌来源的木聚糖酶，
其最适反应温度大多在 50-60℃左右，最适 pH 多为
中性偏酸，大大制约了木聚糖酶在造纸工业中高温
高碱环境下的应用［1， 3， 5］。由于来源于细菌的木聚糖
酶，其耐碱性和热稳定性方面要优于真菌和放线菌，
所以成为目前造纸用木聚糖酶的研究热点［6］。近年
来国内外学者纷纷从不同环境中筛选出可以生产木
聚糖酶的细菌。巴西的 Alves-Prado 等［7］在巴西塞
拉多地区的土壤中分离到一株高产木聚糖酶的细菌
Lysinibacillus sp. strain P5B1，该木聚糖酶的最适作用
温度及 pH 分别为 55℃和 6.0 ；印度的 Menon 等［8］
从印度海洋化工研究院实验盐农场的沉积物中筛选
分离出一株产耐盐木聚糖酶的短小芽孢杆菌 GESF1，
并对该木聚糖酶进行了分离纯化和酶学性质研究，
该酶的最适作用温度及 pH 分别为 40℃和 8.0。在我
国，沈阳农业大学的代义等［9］从长白山天池等地分
离筛选出一株高产木聚糖酶的短小芽孢杆菌 HJ-04，
所产木聚糖酶的最适作用温度为 60℃，最适作用
pH 为 6.5 ；东北林业大学的包怡红等［10］从东北林
大学林场落叶堆下的土壤中筛选出一株高产木聚糖
酶的类芽孢杆菌，并测定该木聚糖酶的最适作用温
度为 50℃，最适作用 pH 为 6.0。
本研究从天津广聚源造纸厂周边的碱性土壤中
分离筛选获得了一株可高产碱性木聚糖酶的耐碱性
细菌，经鉴定为短小芽孢杆菌，并实现该碱性木聚
糖酶基因在大肠杆菌中的表达，经纯化后对该重组
木聚糖酶酶学性质进行研究，旨在丰富木聚糖酶资
源，使其为工业应用作贡献。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 土样 土样为 2010 年 5 月 14 日采集于天津
广聚源造纸厂周边碱性土壤。
1.1.2 主要试剂 稻壳木聚糖，天津市光复精细化
工研究所 ；桦木木聚糖，Sigma 公司 ；3，5-二硝基水
杨酸分析纯，中国医药集团上海化学试剂公司 ；麸
皮、玉米芯，由天津蓟县购得，经粉碎后备用。限
制性内切酶、DNA 连接试剂盒和 Taq DNA 聚合酶购
自 TaKaRa 公司 ；DNA 标准分子量 Marker 和蛋白质
标准分子量 Marker 购自 MBI Fermentas 公司。其它
化学试剂均为国产分析纯。
1.1.3 培养基 富集培养基（%）：稻壳木聚糖 1，
蛋白胨 0.5，NaCl 0.5，pH9.0。选择培养基（%）：
稻壳木聚糖 1，NH4NO3 0.5，MgSO4 0.03，NaCl 0.5，
K2HPO4 0.2，（NH4） 2SO4 0.1，琼脂 2，pH9.0。斜面
培养基（%）：酵母粉 0.5，蛋白胨 1，NaCl 0.5，琼脂 2，
pH9.0。种子培养基配制（%）：酵母粉 0.5，蛋白胨 1，
NaCl 0.5，pH9.0。产酶培养基配制（%）：麸皮粉 4.0，
酵母粉0.5，蛋白胨1，K2HPO4 0.5，MgSO4 0.05，pH9.0。
1.1.4 质粒与宿主菌 质粒 pET-22b（+），宿主菌 E.
coli DH5α 和 E. coli BL21 均由本实验室保存。pUM-T
载体购自 TaKaRa 公司。
1.2 方法
1.2.1 木聚糖酶活测定方法 取 0.1 mL 经适当稀释
的酶液，加入等体积 1% 的木聚糖（Sigma）底物溶
液（pH9.0）混匀，50℃水浴恒温反应 10 min，立即
向试管中加入 0.6 mL DNS 试剂并混匀终止反应，然
后在沸水中煮沸 10 min，冷却后加水定容至 5 mL，
充分摇匀，以灭活酶液做对照，测量样品 540 nm 波
长处的吸光度［11］。
木聚糖酶活力单位的定义为 ：1 mL 酶液每分钟
产生 1 μmoL 的还原糖（以木糖计）为一个活力单位
（IU）。
1.2.2 富集培养 称取 1 g 土样，加入到 100 mL 的
无菌水中，充分摇匀，制成菌悬液，分别取 1 mL 菌
悬液接入到事先灭好菌的 5 mL 富集培养基中，37℃
富集培养 48 h。
1.2.3 平板初筛 将富集培养后的菌液 10 倍逐级稀
释，分别取稀释倍数为 10-3、10-5、10-7 的菌悬液 0.5
mL 涂布于选择培养基平板，37℃培养 48 h，挑取透
明圈较大的单菌落进行分离纯化，挑入斜面培养基
保藏原始菌种。
1.2.4 摇瓶复筛 将培养 16 h 的种子培养液按 2%
的接菌量接入产酶培养基，产酶培养基的装液量为
250 mL 三角瓶装液 50 mL，180 r/min，37℃培养 72 h，
培养物经4 000 r/min离心10 min，取上清液为粗酶液。
应用 DNS 法分别测各粗酶液的木聚糖酶酶活力。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第10期108
1.2.5 细胞形态观察与生理、生化特征鉴定 具体
实验方法参见微生物学实验技术［12］和伯杰细菌鉴
定手册［13］。
1.2.6 细菌的 16S rDNA 序列分析 以产酶菌株的
基因组 DNA 为模板，应用细菌 16S rDNA 通用引物
27F（AGAGTTTGATCMTGGCTCAG）和 1492R（TAC-
GGYTACCTTGTTACGACTT），PCR 扩增产酶菌株的
16S rDNA序列，PCR 扩增程序：95℃ 5 min；94℃ 45 s，
55℃ 45 s，72℃ 90 s，30 个循环 ；72℃延伸 10 min。
将得到的 DNA 片段连接到 pUM-T 载体上，应用化
学转化法转化到 E. coli DH5α 感受态中［14］，37℃培
养 12-16 h，挑取阳性转化子由北京六合华大基因科
技股份有限公司测序，测序结果在 GenBank 中进行
序列比对，利用 Mega5.05 软件构建系统进化树。
1.2.7 木聚糖酶基因的克隆 根据已报道的短小芽
孢杆菌木聚糖酶基因，分析其保守序列，设计引物：
上游引物 CCCAAGCTTATGAATTTGAGAAAATTAAG
ACTGTTG（下划线为 Hind III 酶切位点）和下游引
物 CCGCTCGAGTTAGTTGCCAATAAACAGCTGATT
G（下划线为 Xho I 酶切位点），以产酶菌株的基因
组 DNA 为模板进行 PCR 扩增，反应程序为 ：95℃ 5
min ；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 60 s，30 个循环 ；
72℃ 延长 10 min。
1.2.8 表达载体的构建 PCR 产物纯化后，经 Hind
III 和 Xho I 双酶切，与同样双酶切后的载体 pET-22b
（+）用 DNA 连接试剂盒中的 Solution I 在 16℃的条
件下连接 4 h，连接产物（pET-XynG1-3）经纯化后，
应用化学转化法转化到 E. coli BL21 感受态中［14］，
37℃培养 12-16 h，菌体 PCR 筛选阳性重组子。
1.2.9 重组酶的诱导表达与纯化 将大肠杆菌工程
菌 株 E. coli BL21（pET-XynG1-3） 接 种 于 5 mL 含
Amp（终浓度为 100 μg/mL）的 LB 液体培养基中，
37℃水浴振荡培养过夜，按 2% 的接种量转接于装
有 50 mL 含 Amp（终浓度为 100 μg/mL）的 LB 培养
基中，37℃，180 r/min 培养 2-3 h（OD600=0.8-1.0），
加入 IPTG（终浓度为 1 mmol/L），20℃，100 r/min
诱导 16 h。发酵液经 4 000 r/min 离心 10 min，所得
细胞进行超声破碎后，4℃ 12 000 r/min 离心 10 min
取上清，即得到基因工程菌产碱性木聚糖酶的粗酶
液，对所得粗酶液应用镍离子亲和层析进行一步
纯化［15］。
1.2.10 木聚糖酶的最适作用 pH 及 pH 稳定性 木
聚糖酶最适作用 pH 的测定 ：在不同 pH（5.0、6.0、
7.0、8.0、9.0、10.0），温度为 55℃的条件下测定重
组木聚糖酶的酶活力，以最高酶活为 100%，计算各
条件下的相对酶活。所用缓冲液分别为 ：醋酸-醋酸
纳缓冲液（pH5.0），磷酸缓冲液（pH6.0-7.0），Tris-
盐酸缓冲液（pH8.0-9.0），甘氨酸-氢氧化钠缓冲液
（pH10.0）。
木聚糖酶的 pH 稳定性测定：将重组木聚糖酶纯
酶液分别调至不同 pH（5.0、6.0、7.0、8.0、9.0 和
10.0），温度 55℃条件下，保温 1 h 后，测定各自的
残余酶活力，初始酶活定为 100%。所用缓冲液同上。
1.2.11 木聚糖酶的最适作用温度及温度稳定性 木
聚糖酶最适作用温度的测定 ：在不同温度（40℃、
45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃和 80℃），pH
8.0 条件下测定重组木聚糖酶的酶活力，以最高酶活
为 100%，计算各条件下的相对酶活。
木聚糖酶的温度稳定性测定 ：将重组木聚糖
酶纯酶液分别置于不同温度（30℃、40℃、50℃、
60℃、70℃、80℃），pH 为 8.0 的条件下，保温 1 h 后，
测定各自的残余酶活力，初始酶活定为 100%。
2 结果
2.1 产碱性木聚糖酶菌种的筛选及鉴定
2.1.1 菌株筛选 经过筛选平板初筛共得到 24 株产
透明圈的菌株，选取其中 10 株透明圈相对较大的菌
株进行摇瓶发酵复筛，经 37℃摇瓶发酵 72 h，测定
各菌株的木聚糖酶酶活，结果见表 1。得到酶活最
高为 35.67 IU/mL 的菌株 G1-3，保存菌种，进行菌
种鉴定。
2.1.2 菌种鉴定 菌株 G1-3 菌体形态呈细杆状、革
兰氏染色呈阳性（图 1）；在 LB 培养基上培养 12 h
左右产生芽孢，能利用葡萄糖、甘露醇、木糖为碳
源进行生长，降解淀粉，水解酪蛋白但不水解酪氨酸；
PCR 扩增得到长为 1 437 bp 的 16S rDNA 序列，将
其与 GenBank 数据库中已知微生物的 16S rDNA 序
列进行比对，最高相似度为 99%，并从中选取相似
度较高的 8 个 16S rDNA 序列构建系统进化树，结果
如图 2 所示。菌株 G1-3 在系统进化树上与 Bacillus
2012年第10期 109郑宏臣等 ：碱性木聚糖酶产生菌的筛选、XynG1-3 基因克隆表达及酶学性质研究
pumilus YPB 处于同一分支，进化距离最短，可信度
达到 100%。综上所述，菌株 G1-3 可鉴定为短小芽
孢杆菌，命名为 Bacillus pumilus G1-3。
2.3 碱性木聚糖酶基因的克隆表达
2.3.1 碱性木聚糖酶基因 XynG1-3 的扩增及序列分
析 以短小芽孢杆菌 G1-3 的基因组为模板，PCR
扩增得到木聚糖酶基因的全长为 687 bp，命名
为 XynG1-3，其编码 228 个氨基酸，理论分子量
为 25.444 kD，其中前 27 个氨基酸为信号肽，第
38-221 个氨基酸为糖苷水解酶 GH11 家族的保守序
列，单催化区域，无纤维素结合区域，属于小分子
的 GH11 家族木聚糖酶。XynG1-3 基因序列已上传
GenBank 中，登录号为 ：JX112348.1，与 GenBank
中已知基因序列进行对比，结果有 13 条序列与其相
似度在 88%-99% 之间。另外，XynG1-3 基因编码
的氨基酸序列与 GenBank 中 GH11 家族木聚糖酶序
列的相似度较高，其中，与来源于 B. pumilus IPO 的
木聚糖酶 XYNA 和来源于 Bacillus pumilus BYG 的木
聚糖酶 XynBYG 的相似度为 99% ；与来源于 Bacillus
pumilus ARA 的 木 聚 糖 酶 Bpu XynA 的 相 似 度 为
97% ；与来源于 Bacillus pumilus SAFR-032 的木聚糖
酶和来源于 Bacillus amyloliquefaciens TA208 的木聚
糖酶 xynA2 的相似度分别为 88% 和 77％，序列比对
结果以及 XynG1-3 和 XynBYG 三维结构，见图 3 和
图 4。
2.3.2 重组木聚糖酶的诱导表达与纯化 将木聚糖
酶基因 XynG1-3 克隆到表达载体 pET-22b（+），转
化到 E. coli DH5α 中，提取质粒，得到重组质粒
pET-XynG1-3，并进行单、双酶切验证（图 5-b）；
验证正确的重组质粒在 E. coli BL21 中进行表达，经
IPTG（终浓度为 1 mmol/L）在 20℃下诱导 16 h，得
到的重组木聚糖酶在胞内相对较多（图 5）。并且酶
活检测结果显示，1 mL 发酵液中，菌体沉淀所得
粗酶酶活为 10.75 U/mL ；而发酵液上清中仅有 2.47
IU/mL，可见，E. coli BL21 中的重组木聚糖酶绝大
部分在胞内。因此，收集重组菌细胞进行超声破碎，
然后应用镍离子亲和层析进行一步纯化，得到电泳
表 1 不同菌株的木聚糖酶活力
菌株编号 木聚糖酶活力（IU/mL）
1-3 3.3
1-6 2.74
3-1 4
6-2 2.73
9-1 5.48
G1-1 10.95
G1-2 15.74
G1-3 35.67
G4-1 18.32
G5-1 2.93
图 1 菌株 G1-3的革兰氏染色图（×1000）
图 2 基于 16S rDNA序列比对构建的系统进化树
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第10期110
纯木聚糖酶，其相对分子量约为 24 kD（图 5），与
理论分子量相近。
2.4 重组碱性木聚糖酶的酶学性质
2.4.1 温度对重组木聚糖酶的影响 将纯化后的重
组木聚糖酶 XynG1-3 在不同温度下测定酶活，结果
（图 6）所显示，该酶的最适作用温度为 55℃。在
40-60℃范围内测定酶活，相对酶活在 89% 以上。
另外，如图 7 所示，该酶在 60℃保温 1 h，残余酶
活可保持在 56% 以上，当温度达到 70℃以上时该酶
失活较快。可见，该木聚糖酶在 60℃以下时稳定性
较好。
2.4.2 pH 对重组木聚糖酶的影响 将纯化后的重
组木聚糖酶 XynG1-3 在不同 pH 下测定酶活，结果
如图 8 所示，该酶的 pH 作用范围较广，其最适作
用 pH 为 8.0，并且在 pH9.0 条件下的相对酶活为
90%。可见，此木聚糖酶属于碱性木聚糖酶 ；该木
聚糖酶在不同 pH 条件下的稳定性 , 如图 9 所示，在
pH6.0-10.0保存 1 h，残余木聚糖酶酶活在75%以上。
本图序列由 NCBI 网站获得，经软件 DNAMAN 绘制而成，比对中的 5 个木聚糖酶均属于 GH11 家族，其中，XynG-3 来源
于 B. pumilus G1-3 ；XYNA 来 源 于 B. pumilus IPO（GenBank ：P00694.2）；XynBYG 来 源 于 Bacillus pumilus BYG（GenBank ：
ACH67614.1）；Bpu XynA 来源于 Bacillus pumilus ARA（GenBank ：ADK27486.1）；SAFR-032 来源于 Bacillus pumilus SAFR-032
（GenBank ：YP_001487058.1）；xynA2 来源于 Bacillus amyloliquefaciens TA208（GenBank ：YP_005541332.1），※ 标记的氨基酸
残基为催化位点
图 3 XynG1-3与其他 GH11家族木聚糖酶的氨基酸序列比对图
本图由蛋白质分析软件 Pymol 根据相应木聚糖酶的氨基酸序列绘制而成，红色代表催化位点的氨基酸残基 ；黄色代表有差异
的两个氨基酸残基及其疏水表面 ；蓝色代表周围的疏水氨基酸残基及其疏水表面
图 4 木聚糖酶 XynG1-3（a）与 XynBYG（b）的蛋白质三维结构对比图
2012年第10期 111郑宏臣等 ：碱性木聚糖酶产生菌的筛选、XynG1-3 基因克隆表达及酶学性质研究
可见，该木聚糖酶的 pH 适用范围较广，尤其是在
碱性条件可保持较高稳定性，使其在造纸工业的生
物制浆、生物漂白以及污水处理等方面具有潜在的
应用前景［8］。
3 讨论
在目前已报道的木聚糖酶中，由于来源不同，
所产木聚糖酶的性质也各不相同。虽然目前报道的
细菌木聚糖酶与霉菌木聚糖酶相比，具有相对较好
的耐碱性，但其最适作用 pH 大多数仍是中性偏酸
的，只有少数菌生产的木聚糖酶最适作用pH为碱性，
而为了使木聚糖酶在造纸工业中得到理想的应用效
果，急需在各种极端环境中发掘出更多性质更优良
的碱性木聚糖酶，以满足制浆造纸工业的特殊需要。
本研究从造纸厂周边碱性土壤中分离筛选出一株高
产碱性木聚糖酶的菌株 Bacillus pumilus G1-3，PCR
扩增得到编码碱性木聚糖酶的基因 XynG1-3，并实
现了该基因在 E. coli BL21 中的表达，重组木聚糖酶
经纯化后，测定了其基本酶学性质，确定该酶的最
适作用温度和 pH 分别为 55℃和 8.0，在低于 60℃，
以及较宽的 pH 范围内（pH6.0-10.0）可保持较高的
稳定性。
图 5 重组木聚糖酶的 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳图
M. 分子量标准蛋白 ；1，8. 带有 pET-22b 空质粒的 E. coli BL21 胞外
蛋白和胞内蛋白；2-4. 带有 pET-XynG1-3 的 E. coli BL21 胞外蛋白；
5-7. 带有 pET-XynG1-3 的 E. coli BL21 胞内蛋白 ；9. 纯化后的木聚
糖酶 XynG1-3
图 6 重组酶 XynG1-3的最适温度
图 7 重组酶 XynG1-3的热稳定性
图 8 重组酶 XynG1-3的最适 pH
图 9 重组酶 XynG1-3的 pH稳定性
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第10期112
目前已报道的不同来源的 GH11 家族的木聚糖
酶超过 100 个，其氨基酸序列的相似度在 49%-99%
之间，有着相似的空间结构和作用机制，其空间结
构是由两个 β-折叠片和一个 α-螺旋构成，蛋白整
体呈“右手型”。其催化机制都是由两个酸性氨基
酸残基参与的广义的酸碱催化反应［16］。经氨基酸
序列比对与分析（图 3），确定木聚糖酶 XynG-3 属
于 GH11 家族的小分子木聚糖酶，与已报道的 GH11
家族的木聚糖酶有很高的相似性。其中，相似度最
高的是日本学者 KO 等［17］于 1992 年报道的来源于
B. pumilus IPO 的木聚糖酶 XYNA，相似度 99%，只
有一个氨基酸的差异，该报道是应用定点突变技
术确定了该酶的活性位点为其成熟肽的 Glu-93 和
Glu-182。由图 3 的比对结果可以看出，这两个谷氨
酸活性位点在同属于 GH11 家族的 6 个木聚糖酶中
是较保守的。因此，可以判断 XynG1-3 的活性位点
也为其成熟肽的 Glu-93 和 Glu-182。但是，关于木聚
糖酶 XYNA 的酶学特性的研究还未见报道。另有与
XynG1-3 相似度为 99% 的木聚糖酶 XynBYG，相差
两个氨基酸（图 3），其最适作用 pH 为 8.0-9.0，与
XynG1-3 相近，但其最适作用温度为 50℃，在 55℃
保温 30 min 酶活下降超过一半［18］。可见，XynG1-3
与 XynBYG 相比有相对较好的温度稳定性，通过对
两个差异氨基酸所在位置及周围氨基酸环境的分析，
发现 XynG1-3 成熟肽中的 Met-171 和 Ile-173（对应
XYNA中的Ile-171和Lys-173） 分布在蛋白质的表面，
周围有多个保守的疏水氨基酸（图 4）。因此，推断
用具有强疏水性的 Ile-200 代替极性氨基酸 Lys-173，
增强了该表面区域的疏水相互作用从而提高了蛋白
的热稳定性，而 Met-171 与 ILe-173 同属于疏水性
氨基酸，对蛋白的热稳定性影响不会很大。对比
XynG1-3 与 Bpu XynA 的序列，相似度为 97%，有 7
个氨基酸差异，而其最适作用 pH 和温度分别为 6.6
和 50℃［19］，与 XynG1-3 相比差异较大。综上可见，
同属 GH11 家族的木聚糖酶，虽然空间结构与大部
分序列都很保守，但个别氨基酸的变化仍会导致酶
学特性上的差异，对这些序列进行比对分析，有利
于了解木聚糖酶结构与功能的关系，可以为木聚糖
酶进一步的定向改造提供有用的理论依据［20］。因此，
本研究从造纸环境中经菌种分离筛选以及基因的克
隆表达，所得到的碱性木聚糖酶 XynG1-3，进一步
丰富了木聚糖酶资源，在工业上具有广泛地应用前
景，尤其适用于造纸工业中的生物纸浆及生物漂白。
4 结论
本试验从天津广聚源造纸厂的碱性土壤中分
离筛选到一株高产碱性木聚糖酶的菌株 Bacillus
pumilus G1-3，克隆得到其木聚糖酶基因 XynG1-3，
并实现了其在 E. coli BL21 中的表达。对纯化后的重
组木聚糖酶 XynG1-3 进行了详细的序列分析和酶学
性质研究。该木聚糖酶 XynG1-3 与已报道的 GH11
家族木聚糖酶有较高相似性，但显示了更为优良的
酶学特性，其最适作用温度和 pH 分别为 55℃和 8.0；
在 60℃保温 1 h，残余酶活可保持在 56% 以上 ；在
pH6.0-10.0保存 1 h，残余木聚糖酶酶活在75%以上。
参 考 文 献
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（责任编辑 狄艳红）