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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第4期
脂肪酶（EC 3.1.1.3，Lipase），全称为三酰基甘
油酯水解酶（triacylglycerol acylhydrolase），是指能
够分解或者合成甘油三酸酯酯键的酶［1］。脂肪酶是
科学研究中被关注的最早的酶类之一，已经有 100
多年的研究历史［2］。脂肪酶广泛存在于动物、植物
及微生物中，在动物体中脂肪酶控制着消化、吸收
收稿日期 ： 2013-12-23
基金项目 ： 国家高技术研究发展计划（“863”计划）（2012AA020403），国家自然科学基金项目（31201296/C200101），生物反应器工程国
家重点实验室开放课题，南京林业大学引进高层次人才科研基金项目，江苏高校优势学科建设工程资助项目
作者简介 ： 苏二正，男，博士，副教授，研究方向 ：分子酶学与生物催化 ；E-mail ：ezhsu@njfu.edu.cn
通讯作者 ：苏二正 ；魏东芝，男，博士，教授，研究方向 ：微生物工程、生物催化工程 ；E-mail ：dzhwei@ecust.edu.cn
短小芽孢杆菌脂肪酶基因的克隆、表达及酶学性质研究
苏二正1  吴向萍2  高蓓2  魏东芝2
（1. 南京林业大学轻工科学与工程学院 酶与发酵工程实验室，南京 210037 ；2. 华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室
鲁华生物技术研究所，上海 200237）
摘 要 ： 从土壤样品中通过筛菌过程获得一株产脂肪酶的菌株，经 16S rRNA 鉴定属于短小芽孢杆菌，根据已报道的来源于
芽孢杆菌的脂肪酶基因设计引物，克隆获得其全长基因，命名为 lipS6，大小为 648 bp，编码 215 个氨基酸，经比对其与已报道的
脂肪酶基因 B26 有 96% 的同源性。构建重组表达质粒 pET32a-lipS6，在大肠杆菌中实现了可溶表达，酶活达到 2 000 U/mL。重组
脂肪酶 LipS6 的最适温度为 30℃，最适 pH 为 9，低浓度的 Ca2+ 与 Mn2+ 对其有很明显的激活作用，疏水性有机溶剂对其毒害作用小，
在正己烷体系中可以催化酯化反应，最适酯化底物酸为十四酸，底物醇为正丁醇。
关键词 ： 脂肪酶 短小芽孢杆菌 基因克隆 重组表达 性质
Gene Cloning，Expression and Characterization of the Lipase from
Bacillus pumilus S6
Su Erzheng1 Wu Xiangping2 Gao Bei2 Wei Dongzhi2
（1. Enzyme & Fermentation Technology Laboratory，College of Light Industry Science and Engineering，
Nanjing Forestry University，Nanjing 210037 ；2. State Key Laboratory of Bioreactor Engineering，New World Institute of Biotechnology，
East China University of Science and Technology，Shanghai 200237）
Abstract:  A lipase-producing strain was screened from the soil samples. It was identified as Bacillus pumilus by the 16S rRNA method.
According to the reported lipase genes from Bacillus, the primers were derived and the full-length gene was cloned, named “lipS6”, which had
the size of 648 bp, encoding 215 amino acids. “lipS6” held 96% homology with the reported lipase gene B26. Recombinant plasmid pET32a-
lipS6 was construced and expressed in E. coli. “lipS6”could be expressed in soluble form, and the lipase activity reached 2 000 U/L. The
optimum temperature of recombinant lipase LipS6 was 30℃, and the optimum pH was 9. Low concentrations of Ca2+ and Mn2+ could activate the
activity of lipase LipS6. The harmful effect of hydrophobic organic solvent on the lipase LipS6 was little. LipS6 could catalyze the esterification
reaction in the n-hexane system, with the myristic acid and n-butanol as the optimum substrates. These properties show that LipS6 can be used in
the fields of pulp and paper, leather, textiles and bioenergy.
Key words:  Lipase Bacillus pumilus Gene cloning Recombinant expression Characterization
及脂肪重建等过程，在植物体中脂肪酶存在于能量
储藏组织中，而微生物如细菌、酵母、霉菌、放线
菌等则可产生大量的不同性能的脂肪酶。
微生物脂肪酶具有耐有机溶剂、异构体选择性、
底物专一性、高度位置选择性和高催化活性的特
点［3］，可用于催化酯化、酯交换、醇解、胺解、酰
2014年第4期 133苏二正等 ：短小芽孢杆菌脂肪酶基因的克隆、表达及酶学性质研究
化等反应。因此，对微生物来源脂肪酶的研究得到
了各国科研人员的广泛关注，极大地带动了脂肪酶
在诸多工业领域的应用。
近年来，微生物脂肪酶的分子生物学研究进展
非常迅速，由 NCBI 检索结果知，自 1985 年 Gotz 等［4］
报道的来源于 Staphylococcus 的脂肪酶基因至今，已
有 20 000 多条脂肪酶基因被克隆并提交 GenBank 等
公共数据库。来源不同的脂肪酶基因大小不同，同
源程度不同，性质相差很大。芽孢杆菌来源的脂肪
酶目前已有很多被克隆［5-7］，通过分析芽孢杆菌属
脂肪酶的一级结构发现，其氨基酸序列中存在“Ala-
X1-Ser-X2-Gly”保守五肽，而其它属脂肪酶含有的是
“Gly-X1-Ser-X2-Gly”的保守五肽，第一个 Gly 被突
变为 Ala 后，酶的活性并没有被改变，这一现象说
明第一个氨基酸起到增加保守五肽的柔韧性以及减
少其空间位阻的作用，以便于底物与酶的催化中心
之间能够更好地结合而进行催化作用［8］。此外这类
脂肪酶活性中心没有“lid”覆盖，底物可以很容易
地进出活性中心，因而酶的催化活性较高。
本研究从土壤样品中筛选获得一株产脂肪酶的
短小芽孢杆菌菌株，并对其脂肪酶基因进行克隆，
在大肠杆菌中实现重组表达，研究其基本酶学性质
和催化性能，旨在为其进一步应用奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 土壤样品 取自上海奉贤农村菜地、生活用
水废水沟，上海徐汇饭店废水、垃圾桶和火锅店，
云南昆明高新区食品厂、饮料厂，内蒙古乌兰察布
大草原蒙古包生活废渣、煤堆、马粪堆。
1.1.2 培养基 富集培养基（W/W，%）：酪蛋白胨
0.6，大豆蛋白胨 0.2，NaCl 0.2，pH 自然。
平板筛选培养基（W/W，%）：胰蛋白胨 1.0，
酵母提取物 0.5，NaCl 1.0，琼脂 1.2，橄榄油乳化
液 1.0，0.01 g/mL 的罗丹明 B 0.1。摇瓶发酵培养基
（W/W，%）：胰蛋白胨 1.0，酵母提取物 0.5，NaCl 1.0，
橄榄油乳化液 1.0。LB 培养基（W/W，%）：胰蛋白
胨 1.0，酵母提取物 0.5，NaCl 1.0，pH7.0。
1.1.3 菌 株、 质 粒、 酶 及 其 它 试 剂 药 品 E. coli
DH5α 感受态菌株、E. coli BL21（DE3）感受态菌株
购于天根生物有限公司。pMD19-T 载体购于 TaKaRa
公 司，pET32a 质 粒 由 本 实 验 室 保 存。Premix Taq
DNA 聚合酶、限制性内切酶、T4 DNA 连接酶购自
Fermentas 公司。蛋白胨、酵母提取物购自 Oxoid 公司。
其它试剂药品均为国产或进口分析纯。
1.2 方法
1.2.1 产脂肪酶菌株的筛选 称取各土壤样品 1.0 g
加 入 含 30 mL 富 集 培 养 基 的 250 mL 三 角 瓶 中 于
37℃、180 r/min，振荡培养 1 d，将培养物摇匀，取 1.0
mL 转接到新的含有 30 mL 富集培养基的 250 mL 三
角瓶中，同样条件富集 3 次。吸取 0.1 mL 富集后的
培养液稀释后涂布于平板筛选培养基上，倒置培养
1-2 d 后挑取有较大红色水解圈的菌落划线接种于平
板筛选培养基上，初步筛选获得产脂肪酶的单菌落。
将获得的单菌落接种于摇瓶发酵培养基中培养
2 d，吸取发酵液 1.0 mL，点入打孔的含罗丹明 B 的
平板筛选培养基中，于 37℃恒温培养，观察孔周围
的颜色变化，取变色圈较大的对应菌株作菌种鉴定。
1.2.2 菌种鉴定 取 2.0 mL 过夜培养的菌液，4℃
离心收集菌体，按文献［9］方法提取菌种基因组
DNA 作为模板，按照文献［10］进行 16S rDNA 序
列 PCR 扩增，上游引物 ：5-AGAGTTTGATCCTGG-
CTCAGG-3 ；下游引物 ：5-AAGGAGGTGATCCAGC-
CGCA-3。扩增条件为：94℃预变性 5 min；94℃变性
45 s，55℃退火 45 s，72℃延伸 90 s，30 个循环 ；于
72℃延伸 8 min，将产物放置 4℃保存。对 PCR 产物
进行电泳验证，并将含有目的片段的样品送生工测
序，将测序结果在 NCBI 上进行比对。
1.2.3 脂肪酶酶活测定 以乳化橄榄油作为底物采
用碱滴定法测定脂肪酶酶活［11］。0.5 mL 待测酶液加
入 2.0 mL 100 mmol/L pH7.0 的磷酸钠缓冲液中，于
水浴摇床上 37℃保温 5 min，加入于 37℃预保温的
乳化橄榄油底物 2.5 mL 于 180 r/min 下反应 10 min，
用 10 mL 无水乙醇终止反应。对照中先加 10 mL 无
水乙醇灭活再加底物。在上述条件下，每分钟水解
橄榄油产生 1.0 μmol 游离脂肪酸所需的脂肪酶量定
义为一个脂肪酶活力单位（U）。
1.2.4 短小芽孢杆菌脂肪酶基因的克隆 根据已经
报道的来源于芽孢杆菌属的脂肪酶基因的保守序列
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第4期134
设计引物 ：正向引物 S6-F1 5-AATCCGGTTTGTGAT-
GGTCCA-3 和反向引物 S6-R1 5-GTTGACGACGAT-
GAGATCCGCT-3，以短小芽孢杆菌菌株 S6 的基因组
DNA 作模板，PCR 扩增保守序列片段，具体过程 ：
94℃预变性 5 min ；94℃变性 45 s，55℃退火 45 s，
72℃延伸 90 s，30 个循环 ；72℃延伸 8 min，于 4℃
下保存。将 PCR 产物电泳验证并割胶回收，将回收
的片段与 pMD19-T 载体连接，转化入 E. coli DH5α
的感受态细胞，挑取阳性克隆进行测序。将测序结
果在 NCBI 上进行比对，根据比对结果，设计全长
基因序列引物 ：正向引物 S6-F2 5-CGGGATCCATG-
AAAGTGATTCGATTTA-3（下划线为 BamH I 酶切
位点），反向引物 S6-R2 5-CCGGAAGCTTAATTCGT-
ATTCTGTCC-3（下划线为 Hind III 酶切位点），PCR
扩增出 lipS6 全长基因序列，条件为 ：94℃预变性
5 min ；94℃ 变 性 45 s，61℃ 退 火 45 s，72℃ 延 伸
90 s，30 个循环 ；72℃延伸 8 min，于 4℃下保存。
将 PCR 产物电泳验证并割胶回收，获得的 DNA 片
段与 pMD19-T 载体连接，将连接后的产物转化入 E.
coli DH5α 的感受态细胞中，PCR 验证后挑取阳性克
隆菌试管培养，将培养的菌液送至华大基因测序，
提取阳性克隆菌液质粒，命名为 T-S6。
1.2.5 重组质粒的构建与表达 用 BamH I 和 Hind
III 对 T-S6 和 pET32a 进行双酶切，琼脂糖凝胶电泳
回收目的片段和空载体双酶切后的片段，将回收的
目的片段和载体片段用 T4 DNA 连接酶连接，转化
入 E. coli DH5α 感受态细胞，挑选阳性菌落提取质粒，
将验证正确的重组质粒命名为 pET32a-lipS6。
将重组质粒 pET32a-lipS6 转化 E. coli BL21 中，
挑取单菌落接种于含有 100 mg/L Ampicilin 的 50 mL
LB 液体培养基，37℃培养至 OD≈0.8，加入 IPTG
至终浓度 0.5 mmol/L，20℃下诱导培养 10 h。低温
离心收集菌体，将菌体重新悬浮在含 15 mL 预冷的
20 mmol/L pH8.0 的磷酸盐缓冲液中，超声破碎，工
作条件为功率 200 W，工作 4 s，间歇 5 s，超声破碎
20 min，将破碎完的菌体裂解液在 4℃下 10 000 r/min
离心 10 min，沉淀用相同体积的缓冲液溶解，取全
菌体、上清、沉淀进行 SDS-PAGE 凝胶电泳。
1.2.6 短小芽孢杆菌脂肪酶基本酶学性质研究 最
适温度测定 ：按照 1.2.3 方法，分别于 20、25、30、
35、40 和 50℃下测定脂肪酶的活力。
热稳定性测定 ：将脂肪酶液分别放置在 30、
40、50、60℃的水浴中保温，分别在 15、30、45 及
60 min 时取样测定酶活。
最 适 pH 测 定 ：配 制 pH 为 6.0、7.0、8.0 的 磷
酸盐缓冲液，pH 为 8.0、9.0、10.0、11.0 的硼砂缓
冲液，然后按 1.2.3 方法在不同 pH 测定脂肪酶活力。
pH 稳定性测定 ：将脂肪酶液分别加入不同 pH
值的缓冲液中在 4℃中放置 3 h，然后将酶液的 pH
调回到测酶活 pH 测定酶活。
金属离子、表面活性剂及抑制剂的影响 ：向测
酶活体系中添加各种金属离子使其终浓度分别为 1
和 8 mmol/L，添加各种表面活性剂使其终浓度为 1
mmol/L，添加 EDTA 使其终浓度为 5 mmol/L，再按
照 1.2.3 的方法测定酶活。
有机溶剂的影响 ：将 75 μL 酶液与 25 μL 有机
溶剂混合，用封口膜密封，在 30℃摇床中放置 3 h
后测定残余酶活。所用有机溶剂为甲醇、乙醇、乙腈、
丙酮、苯、DMSO、正己烷及氯仿。
1.2.7 短小芽孢杆菌脂肪酶酯化性质研究 酯化反
应最适脂肪酸的测定 ：用脂肪酶冻干粉催化丁酸、
己酸、辛酸、癸酸、十二酸、十四酸、十六酸与正
己醇反应，反应体系为 ：1 mmol 酸 +1 mmol 正己醇
+5 mL 正己烷 + 酶的冻干粉，在 30℃摇床中 150 r/min
下反应 8 h，取 1 mL 反应液 8 000 r/min 离心 1 min，
取上清进行气相检测。
酯化反应最适底物醇的测定 ：将丁醇、己醇、
辛醇、癸醇、十二醇与十四酸反应，反应体系为 ：
1 mmol 醇 +1 mmol 十四酸 +5 mL 正己烷 + 酶的冻干
粉，在 30℃摇床中 150 r/min 反应 8 h，取 1 mL 反应
液 8 000 r/min 离心 1 min，取上清进行气相检测。
气相条件 ：HP-5 毛细管柱（30.0 m×320 μm×
0.25 μm），气化室温度 260℃，检测室温度 280℃，
柱 温 120℃ 保 持 1 min， 然 后 以 10℃/min 升 到
280℃，最后再保持 2 min，载气为氮气，流速为 1.2
mL/min，进样量为 1 μL。
2 结果
2.1 产脂肪酶菌株的筛选和菌种鉴定
经过开始的富集培养，平板的初筛以及复筛，
2014年第4期 135苏二正等 ：短小芽孢杆菌脂肪酶基因的克隆、表达及酶学性质研究
最后摇瓶发酵产酶验证等过程，最终从内蒙古乌兰
察布大草原蒙古包生活废渣中筛选获得一株产较高
脂肪酶活性的菌株，命名为 S6。对 S6 菌株进行 16S
rDNA 鉴定，所得 16S rDNA 基因序列长度大约为
1 500 bp，将此序列在 GenBank 核酸数据库中进行比
对，结果与短小芽孢杆菌的同源性为 99%，构建系
统进化树，如图 1 所示。
Bacillus pumilusEU939702
Bacillus sp. CF0-6JN836276
Bacillus sp. LPPA1479HE613375
Bacillus sp. MM26JN7913790
Bacillus sp. A-28EU661798
Bacillus sp. B-26EU661810
Bacillus sp. ML289JN791352
Bacillus sp. C-3 2008EU661788Bacillus pumilusHM462438
Bacillus pumilusEU709753
S6
7
2
2
5
2
2
5
12
图 1 S6 菌 16S rDNA 克隆文库细菌进化树
2.2 脂肪酶基因的克隆与序列分析
根据保守序列引物进行 PCR，获得一段保守序
列，测序比对发现，获得的基因片段与已报道的也
是来源于短小芽孢杆菌的脂肪酶基因 lipB26 有 98%
的同源性。根据 lipB26 基因序列设计全长基因引
物 lipS6-F2 和 lipS6-R2，梯度 PCR 后，将得到的基
因片段连入 T 载体进行测序。由测序结果可知，所
得到的基因大小为 648 bp，编码 215 个氨基酸，在
NCBI 上进行比对，结果显示，获得的基因序列与已
报道的 lipB26 的全长基因有 96% 的同源性，23 个碱
基不同，氨基酸序列有 3 个不同，在第 30 个左右由
Ile → Met，Ala → Lys，Glu → Ala。将此脂肪酶基因
命名为 lipS6，提交 GenBank，序列号为 JN594059。
2.3 重组表达载体的构建及蛋白表达
将构建成功的重组表达质粒 pET32a-lipS6 转入
E. coli BL21 中进行诱导表达，SDS-PAGE 电泳分析
结果（图 2）显示，在 35 kD 左右有一个明显的条
带，由于 pET32a 质粒带有 Trx-tag 融合标签，所以
目的蛋白比实际要大。pET32a-lipS6 在大肠杆菌中
实现可溶性表达（图 2，Lane 2）。收集菌体超声破碎，
离心取上清进行酶活测定，活力达到 2 000 U/mL。
2.4 脂肪酶LipS6的酶学性质
2.4.1 最适温度和热稳定性 图 3-A 显示，脂肪酶
66.2
kD
1 2 3
45.0
33.0
26.0
20.0
14.4
1 ：全菌体 ；2 ：菌体破碎后上清 ；3 ：菌体破碎后沉淀
图 2 重组质粒 pET32a-lipS6 在大肠杆菌中的表达
LipS6 的最适温度为 30℃，酶活以最适温度为中心，
呈上升或下降趋势，在 20℃时有 70% 以上的相对酶
活，在 60℃时有 60% 左右的相对酶活。热稳定性测
定表明该脂肪酶稳定性较差，60℃处理 1 h 后，残
余酶活小于 5%，该酶在 30℃的稳定性较好（图 3-B）。
2.4.2 最适 pH 和 pH 稳定性 图 4-A 显示，脂肪酶
LipS6 的最适 pH 为 9，为一碱性脂肪酶，在 pH8-10
之间均具有较高的相对酶活，pH 为 6 或 11 时，酶
活急剧下降。pH 稳定性试验表明该酶的 pH 稳定性
范围较宽，在 pH7-11 的缓冲液中存放 3 h 残余酶活
仍保持 80% 以上，说明耐碱性能优越（图 4-B）。
2.4.3 金属离子、表面活性等的影响 不同化学试
剂对脂肪酶 LipS6 酶活的影响见表 1。低浓度（1
mmol/L）的 Ca2+ 与 Mn2+ 对脂肪酶 LipS6 有很明显的
激活作用，酶活提高 1.5 倍左右。高浓度（8 mmol/L）
Mn2 对 LipS6 有轻微的抑制作用。Fe2+、Ag+、Cu2+ 及
Mg2+ 对 LipS6 有较明显的抑制作用。SDS、Tween80
及 Triton X-100 三种表面活性剂对 LipS6 也有较明显
的抑制作用。EDTA 对 LipS6 有轻微的抑制作用。
2.4.4 有机溶剂的影响 表 2 显示，有机溶剂的影
响随着其极性的变化而变化。高极性的有机溶剂如
甲醇、乙醇、乙腈、丙酮等对 LipS6 的毒害作用大，
残余酶活低。疏水性有机溶剂如正己烷对 LipS6 的
酶活几乎没有影响。中等极性的有机溶剂如氯仿、
苯的影响介于高极性有机溶剂与疏水有机溶剂之间。
DMSO 作为一个高极性的有机溶剂其对 LipS6 的毒
害作用并不像丙酮、乙腈那样明显。
2.5 非水相中脂肪酶LipS6催化酯化反应特性
由于脂肪酶 LipS6 在正己烷溶剂中的稳定性
很高，因此进一步考察了 LipS6 在正己烷中催化合
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第4期136
成反应的能力和特性。结果（图 5）显示，脂肪酶
LipS6 催化酯化反应的最适底物脂肪酸为十四酸，从
正丁酸到十四酸随着脂肪酸碳链增长，脂肪酸的酯
化转化率增加，从十四酸到十八酸随着脂肪酸碳链
的增长，脂肪酸的酯化转化率下降（图 5-A）。脂肪
酶 LipS6 催化酯化反应对短链脂肪醇转化率高，随
着碳链的增长，酯化转化率下降（图 5-B）。
3 讨论
脂肪酶生物催化的优点有很多，能够在常温常
压的条件下进行反应因而所需的条件比较温和，催
化的效率高、特异性强并且不易产生副产物，用化
学催化方法易产生有害物质的缺点能够避免，此外，
反应不需要辅酶，反应体系简单，便于产物的提取
以及精制，可以提高产品的质量，使脂肪酶在工业
上的应用越来越广泛［12］。
芽 孢 杆 菌 脂 肪 酶 属 于 subfamillyI.4， 该 类 脂
0 30 60 90
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
30℃
40℃
50℃
60℃
R
el
at
iv
e
ac
tiv
ity
%
Timemin
B
20 30 40 50 60
60
70
80
90
100
110
R
el
at
iv
e
ac
tiv
ity
%
Temperature ℃
A
图 3 温度对脂肪酶 LipS6 活力的影响最适温度（A）及热稳定性（B）
6 7 8 9 10 11
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
R
el
at
iv
e
ac
tiv
ity
%
pH
A
6 7 8 9 10 11
20
30
40
50
60
70
80
90
100
R
el
at
iv
e
ac
tiv
ity
%
pH
B
图 4 pH 对脂肪酶 LipS6 活力的影响最适 pH（A）及 pH 稳定性（B）
表 1 不同的化学试剂对脂肪酶活力的影响
化学试剂 浓度（mmol/L） 相对酶活（%）
Control 100.00
Fe2+ 1 68.65
8 32.72
Ag+ 1 40.41
8 17.87
Cu2+ 1 67.28
8 27.63
Ca2+ 1 142.48
8 100.35
Mg2+ 1 49.94
8 13.92
Mn2+ 1 151.78
8 92.24
SDS 1 32.29
Tween80 1 17.62
Triton X-100 1 19.06
EDTA 5 84.44
2014年第4期 137苏二正等 ：短小芽孢杆菌脂肪酶基因的克隆、表达及酶学性质研究
杆菌 B26，该菌产 Ca2+ 不依赖脂肪酶。国内黄瑛等［14］
最早于 2008 年对短小芽孢杆菌脂肪酶进行了克隆和
易错 PCR 改造。2009 年以来，Kumar 等［15］、Ismael
等［16］、Zhang 等［17］、张搏等［18］及李俊峰等［19］进
行了产脂肪酶短小芽孢杆菌菌株的筛选、原始菌株
发酵产酶条件的优化、克隆表达及部分酶学性质的
研究，使短小芽孢杆菌脂肪酶日益受到关注。由前
人的研究结果来看，同样来源于短小芽孢杆菌的脂
肪酶的分子性质、酶学性质也存在着差异。因此，
本研究同样进行了产酶菌株的筛选、克隆表达及酶
学性质研究，进一步丰富短小芽孢杆菌源脂肪酶的
种类，奠定其应用基础。
本研究从环境样本中筛选获得一株产脂肪酶
短小芽孢杆菌 S6，通过芽孢杆菌脂肪酶保守序列
设计引物 PCR 扩增获得 S6 菌脂肪酶的保守序列片
段，进一步根据 B26 菌脂肪酶序列设计引物 PCR 获
得 S6 菌脂肪酶全长序列，基因大小为 648 bp，编码
215 个氨基酸，该脂肪酶基因与 Zhang 等［17］报道的
短小芽孢杆菌 B106 脂肪酶基因大小一致，基因序列
同源性为 88%，氨基酸序列同源性为 95%，比张搏
等［18］报道的同样来源于短小芽孢杆菌 HZbp 脂肪酶
基因大。由于短小芽孢杆菌脂肪酶分子量小，在大
肠杆菌中表达时易形成包涵体，为了减少包涵体量，
提高可溶性表达，本研究选用质粒 pET32a 进行异源
表达，该质粒具有 Trx 融合蛋白，能够帮助表达蛋
白形成正确的二硫键，可增加蛋白的溶解性及活性。
S6 菌脂肪酶表达后上清中有明显的条带，可溶表达
量达到 50%，酶活达到 2 000 U/mL，通过表达条件
的优化可以进一步提高重组菌培养的细胞密度和可
溶表达量，这一部分工作将另文发表。
脂肪酶 LipS6 为典型的碱性脂肪酶，其最适 pH
为 9， 比 B106、B26 脂 肪 酶 的 最 适 pH（8.0、8.5）
高［13，17］，与 H2 菌脂肪酶最适 pH 一样［19］，其在
pH7-11 范围内稳定性好，稳定 pH 范围宽。由于制
浆造纸、皮革、纺织业的工艺特点，需要使用碱性
脂肪酶来改善传统工艺，LipS6 的碱性最适条件及优
越的碱性耐受性，显示出其在这些领域的应用前景。
前人对于短小芽孢杆菌脂肪酶的性质研究都没有涉
及其在非水相中催化合成反应的能力，本研究发现
脂肪酶 LipS6 在非水相生物催化常用有机溶剂正己
表 2 有机溶剂对脂肪酶活力的影响
有机溶剂 浓度（V/V） 相对酶活（%）
甲醇 25 15.30
乙醇 25 8.36
乙腈 25 8.22
丙酮 25 10.30
DMSO 25 62.92
正己烷 25 98.70
氯仿 25 46.95
苯 25 45.66
↓б䞨↓ᐡ䞨 ↓䗋䞨ᴹᵪⓦࡲ
ᴹᵪⓦࡲ
↓Ⲩ䞨ॱҼ䞨ॱഋ䞨 ॱޝ䞨ॱޛ䞨0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
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⦷%

↓б䞷 ↓ᐡ䞷 ↓䗋䞷 ↓Ⲩ䞷 ॱҼ䞷0
10
20
30
40
50
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⦷%

A
B
图 5 脂肪酶 LipS6 在正己烷中催化酯化反应的底物特异性
最适酸（A）及最适醇（B）
肪 酶 与 subfamillyI.5 或 其 它 亚 族 脂 肪 酶 的 同 源 性
很 低（<15%）， 具 有 分 子 量 小、 碱 性 偏 好 性、 催
化 功 能 多 等 特 点。 目 前 为 止， 研 究 较 多 的 芽 孢
杆 菌 脂 肪 酶 主 要 来 源 于 Bacillus subtilis、Bacillus
stearothermophilus、Bacillus thermocatenulatus、
Bacillus thermoleovorans［13］。 国 内 外 对 短 小 芽 孢 杆
菌（Bacillus pumilus）脂肪酶的研究报道较少。国外
Kim 等［13］最早于 2002 年筛选获得了一株短小芽孢
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第4期138
烷中稳定性高，因此考察了其在正己烷中催化酯化
的能力，发现其可以高效地催化脂肪酸与脂肪醇的
酯化反应，这个性能的揭示预示着 LipS6 也可以应
用于催化制备生物柴油。DMSO 是非水相生物催化
中常用的助溶剂，LipS6 在 25% 的 DMSO 中仍能保
持较高的酶活，这个性能将有助于开发 LipS6 在非
水相中催化那些难溶底物的生物转化。
4 结论
筛选获得一株产脂肪酶的短小芽孢杆菌 S6，通
过 PCR 扩增获得其全长基因大小为 648 bp，利用
pET32a 质粒实现了其在大肠杆菌中的可溶表达，通
过 Ni-NTA 亲和纯化后纯酶的最适温度为 30℃，最
适 pH 为 9，耐碱性能优越，低浓度 Ca2+、Mn2+ 对其
有激活作用，在正己烷中稳定性高，于非水相体系
中可以催化酯化反应。
参 考 文 献
［1］ Haki GD, Rakshit SK. Developments in industrially important ther-
mostable enzymes：a review［J］. Bioresource Technol, 2003, 89（1）：
17-34.
［2］ 张树政 . 酶制剂工业（下册）［M］. 北京 ：科学出版社 , 1984 ：
655-670.
［3］ Jaeger KE, Reetz MT. Microbial lipase form versatile tools for
biotechnology［J］. Trends Biotechnol, 1998, 16（9）：396-403.
［4］ Götz F, Popp F, Korn E, Schleifer KH. Complete nucleotide sequ-
ence of the lipase gene from Staphylococcus hyicus cloned in Staphy-
lococcus carnosus［J］. Nucleic Acids Res, 1985, 13（16）：5895-
5906.
［5］ Ma J, Zhang Z, Wang B, et al. Overexpression and characterization of
a lipase from Bacillus subtilis［J］. Protein Expres Purif, 2006, 45（1）：
22-29.
［6］ Nthangeni MB, Ramagoma F, Tlou MG, Litthauer D. Development
of a versatile cassette for directional genome walking using cassette
ligation-mediated PCR and its application in the cloning of complete
lipolytic genes from Bacillus species［J］. J Microbiol Meth, 2005,
61（2）：225-234.
［7］ Rosenstein R, Götz F. Staphylococcal lipases ：biochemical and
molecular characterization［J］. Biochimie, 2000, 82（11）：1005-
1014.
［8］ Uppenberg J, Hansen MT, Patkar S, Jones TA. The sequence, crystal
structure determination and refinement of two crystal forms of lipase
B from Candida antarctica［J］. Structure, 1994, 2（4）：293-308.
［9］ Ogino H, Hiroshima S, Hirose S, et al. Cloning, expression and char-
acterization of a lipase gene（lip3）from Pseudomonas aeruginosa
LST-03［J］. Mol Gen Genomics, 2004, 271 ：189-196.
［10］ 林容霞 , 马延和 , 谭天伟 . 低温脂肪酶产生菌的筛选及鉴
定［J］. 北京化工大学学报 , 2006, 33（1）：31-35.
［11］ Burker JF, Maugeri F, Rodrigues MI. Optimization of extracellular
lipase production by Geotrichum sp. using factorial design［J］.
Bioresource Technol, 2004, 91 ：77-84.
［12］ 吴向萍 . 产脂肪酶菌株的筛选、脂肪酶基因的克隆与表达及
其性质研究［D］. 上海 ：华东理工大学 , 2012.
［13］ Kim HK, Choi HJ, Kim MH, et al. Expression and characterization
of Ca2+-independent lipase from Bacillus pumilus B26［J］.
Biochim Biophys Acta, 2002, 1583（2）：205-212.
［14］ 黄瑛 , 蔡勇 , 杨江科 , 闫云君 . 基于易错 PCR 技术的短小芽孢
杆菌 YZ02 脂肪酶基因 BpL 的定向进化［J］. 生物工程学报
2008, 24（3）：445-451.
［15］ Kumar R, Mahajan S, Kumar A, Singh D. Identification of variables
and value optimization for optimum lipase production by Bacillus
pumilus RK31 using statistical methodology［J］. New Biotechnol,
2011, 28（1）：65-71.
［16］ Ismael BJ, Rodrigo ML, Mario LC, Amelia F. Kinetic studies of
Gly28 ：Ser mutant form of Bacillus pumilus lipase ：Changes in
kcat and thermal dependence［J］. Biochim Biophys Acta, 2010,
1804（12）：2222-2227.
［17］ Zhang HZ, Zhang FL, Li ZY. Gene analysis, optimized production
and property of marine lipase from Bacillus pumilus B106
associated with South China Sea sponge Halichondria rugosa［J］.
World J Microbiol Biotechnol, 2009, 25 ：1267-1274.
［18］ 张搏 , 朱绮霞 . 短小芽孢杆菌 HZbp 脂肪酶基因的克隆表达［J］.
工业微生物 , 2010, 40（5）：49-53.
［19］ 李俊峰 , 李红芳 , 段效辉 , 等 . 耐有机溶剂脂肪酶产生菌的
筛选及其粗酶酶学性质［J］. 食品科学 , 2012, 33（3）：116-
120.
（责任编辑 李楠）