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研究报告

生物技术通报
BIOTECHNOLOGY
BULLETIN 2011年第 2期
环介导恒温扩增法快速检测短小芽孢杆菌
应琪 1
李太武1, 2
苏秀榕 1
李晔 1
周君 1
崔静 1
王中华 1
李松伟1
( 1宁波大学生命科学与生物工程学院,宁波 315211; 2宁波城市职业技术学院,宁波 315110)


摘
要:
短小芽孢杆菌 (Bacillus pum ilus)是一种能引起食源性疾病的腐败菌, 对其进行快速检测具有重要意义。针对
短小芽孢杆菌木聚糖 ( xynA )基因, 设计了 4条特异性引物 (两条内引物和两条外引物 ), 通过条件优化,首次将一种新颖的核
酸扩增技术


环介导恒温扩增技术应用于短小芽孢杆菌的快速检测。采用该技术, 63
温育 1 h的条件下扩增短小芽孢杆
菌 DNA,琼脂糖凝胶电泳得到特异性梯度条带。PCR和 LAMP的检测灵敏度分别约为 162和 16. 2拷贝每反应。结果表明,该
方法检测短小芽孢杆菌特异性强、灵敏度高、操作简便、检测成本低, 1 h即可完成,有望发展成为快速检测短小芽孢杆菌的有
效手段。
关键词:
短小芽孢杆菌
环介导恒温扩增技术 ( LAM P)
木聚糖 ( xynA )基因
快速检测
Establishment of Loop-mediated IsothermalAmplification
M ethod for Detection ofBacillus pum ilus
YingQ i
1
L iT aiwu1, 2
Su X iurong1
L iYe1
Zhou Jun1
Cui Jing1
W ang Zhonghua1
L i Songw ei1
(
1
Faculty of L ife Science and Biotechno logy, N ingbo University,N ingbo 315211;
2
N ingbo C ity Co llege of VocationalT echno logy,N ingbo 315110)


Abstrac:t
Bacillus pum ilus has been considered as one o f them ost im po rtant spo ilage bacter ia l wh ich a lso causes foodbo rne il-l
ness. A se t of four prim ers, tw o ou ter and two inne r pr ime rs, w as des igned specifically to recogn ize the xy lanase ( xynA ) gene ofB.
pum ilus. A fter the optim iza tion of loop-m ediated isotherm al am plification ( LAMP) reaction m ix, the LAMP me thod w as applied fo r
rap id detec tion o fB. pum ilus for the first tim e by incubation at 63
for on ly 1 h. LAMP am plification products had a ladder- like ap-
pearancew hen e lectrophoresed on an agarose ge.l The detection lim it o f the LAM P assay w as 16. 2 cop ies, w hich w as found to be high-
e r than the comm on ly used PCR m ethod. These resu lts suggested that detec tion ofB. pum ilus by LAMP is an effective and low-cost
procedure w ith high spec ific ity and sens itiv ity tha t requires no spec ia lized equ ipm ent. This assay is expected to becom e a valuable too l
for rap id de tection and identifica tion o fB. pum ilus.
Key words:
Bacillus pum ilus
Loop-m ed ia ted isotherm al amp lifica tion( LAM P)
Xy lanase( xynA ) gene
Rap id detec tion
收稿日期: 2010-07-12
基金项目:海洋公益性行业科研专项 ( 2011418007) ,宁波大学研究生科研创新基金项目 ( NG09JLA024)
作者简介:应琪,男,硕士研究生,研究方向:海洋生物学; E-m ai:l yingq i54172@ 163. com
通讯作者:李太武,教授,博士生导师,研究方向:应用海洋生物学技术; E-m ai:l litaiwu@ nbu. edu. cn
我国是世界渔业大国, 有丰富的渔业资源。现
在,我国水产养殖呈集约化和规模化快速发展,水产
业进入快速发展时期, 是世界上唯一养殖产量超过
捕捞产量的国家,养殖产量占到世界养殖总产量的
70%以上。水产品极易腐败变质,由于产量的增加,
容易出现鲜活鱼的沉积, 一旦腐败变质其价值就下
降很多,甚至可能完全丧失食用价值并造成重大的
经济损失。研究表明, 微生物是引起水产品腐败变
质的主要原因,其中, 芽孢杆菌属能产生芽孢, 对热
的抵抗力强,是水产品生产、贮藏和销售过程中最易
污染从而引起腐败, 导致人类疾病的微生物之
一 [ 1- 5]。短小芽孢杆菌 (Bacillus pum ilus )系芽孢杆
菌属,是一种能引发食源性疾病的腐败菌。汪立平
等 [ 2]发现短小芽孢杆菌是豆制品腐败变质的主要
腐败菌之一;此外, 有报道显示, 短小芽孢杆菌会引
起顽固性甲沟炎 [ 3]、婴幼儿败血症 [ 4]、产生毒素 [ 5]
生物技术通报 B iotechnology
Bulletin 2011年第 2期
等;最近在生食水产品中也发现了大量的短小芽孢
杆菌。因而寻求一种有效快速的检测技术, 实现对
其提前预防,减少经济损失就变得尤为重要。目前
研究较多的微生物快速检测方法主要有 [ 6] : 基于微
生物抗原的方法 (如放射免疫分析、酶免疫分析、荧
光免疫分析、时间分辨荧光免疫分析、化学发光免疫
分析、生物发光免疫分析等 ), 基于分子生物学及细
菌生化反应的方法。能取代传统的培养基检测的快
速检测方法必须具备简单、快速、高灵敏度、检测结
果准确以及检测成本低等特点,然而现有的快速检
测方法都存在一定的缺陷,限制其工业化应用,需要
进一步改进。
2000年, No tom i等 [ 7 ]发明的环介导的恒温扩增
技术 ( loop-med iated isothermal amplif ication, LAMP)
是一种利用能特异性结合于靶 DNA上 6个特定区
域的 4条引物和一种具有链置换活性的 DNA聚合
酶 ( B st DNA聚合酶 ) ,在恒温条件下高效扩增核酸,
1 h即可完成, 产物是由多重复靶序列的茎 -环状
DNA和花椰菜状 DNA所组成的混合物,反应产物
经琼脂糖凝胶电泳呈阶梯状。该技术具有高特异
性、快速 ( 1 h左右 )、灵敏、高效、操作简便、不需要
特殊仪器等优点,现已广泛应用于病毒及微生物的
快速检测。本研究根据短小芽孢杆菌木聚糖 ( xy-
nA )基因序列设计一套引物, 优化反应条件, 建立
LAMP检测方法, 拟验证 LAMP技术检测短小芽孢
杆菌的灵敏度和特异性。
1
材料与方法
1. 1
材料
短小芽孢杆菌 ( Bacillus pum ilus, G IM 1. 225)、
荧 光 假 单 胞 菌 ( P seudomonas f luorescens, GIM
1
209)、腐败希瓦氏菌 ( Shew anella pu trefaciens, GIM
1
305)、地衣芽孢杆菌 ( Bacillus licheniform is, GIM
1
283 )、枯 草 芽孢 杆 菌 ( Bacillus subtilis, GIM
1
185),苏云金芽孢杆菌 (Bacillus thuringiensis, GIM
1
27)、威尔氏李斯特菌 ( L isteria w elshim eri, GIM
1
232)均购于广东省微生物菌种保藏中心; B st
DNA聚合酶大片段购于 New Eng land B iolabs公司;
琼脂糖购于 Prom ega公司; 其他试剂均购于大连宝
生物工程公司。
1. 2
引物设计与合成
根据 GenBank公布的短小芽孢杆菌 xynA基因
( AY526092. 1, EU421717. 1, EF090270. 1)中的保
守序列,利用软件 PrimerExplorer V4( http: / /primer-
exp lorer. jp /elamp4. 0. 0 / index. h tm l)设计一套特异
性的 LAMP引物,包括两条外引物 F3、B3和两条内
引物 FIP、B IP。引物 (表 1)由上海生工生物工程技
术服务有限公司合成。
表 1
扩增 xynA基因的 LAMP引物序列
名称 引物序列 ( 5
- 3
) 长度
( n t)
F3 TCCGGAAAGCTTCCTGAAAG 20
B3 ATAATCGGTTGCCCACTTGA 20
FIP CATCGTACCAGCCGCCTGTTCTTAACTGGCGAGGGGATTC 40
B IP TGGCTTACTCTGCAGCCGTGCAAGCAGCTCTGCCTCTTC 39
1. 3
细菌基因组 DNA抽提与模板制备
细菌纯培养物 1mL于 6 000 r /m in离心 5 m in,
去上清, 加入 100
L无菌水, 混匀后, 100
水浴
10m in,冰浴 2 m in, 12 000 r /m in离心 5 m in, 取上清
液备用。以基因组 DNA作为模板, 以 F3和 B3为扩
增引物,进行 PCR扩增, 扩增产物大小为 246 bp,反
应体系总体积为 25
L,其中 10
缓冲液 2. 5
L,引
物 F3 /B3( 10
mol/L ) 1
L, dNTP( 2. 5mmol /L ) 2
L,
M gC l2 ( 2. 5mmo l/L ) 2
L, DNA模板 1
L, Taq酶 1
5
U,其余用 ddH 2O补足至 25
L。扩增程序 95
预变
性 5m in后, 按下列程序扩增 35个循环, 94
变性
30 s, 54
退火 30 s, 72
延伸 30 s。循环结束后 72

充分延伸 10m in, 4
保存。
1. 4
LAMP扩增条件的确立
反应体系 ( 25
L )中包括: 模板 DNA 2. 0
L,
FIP /B IP( 10
mo l/L )各 1. 6
L, F3 /B3( 10
mol/L )
各 0. 4
L, 10
B st DNA聚合酶缓冲液 2. 5
L,
dNTP ( 2. 5 mmo l/L ) 2. 0
L, B st DNA 聚合酶 ( 8
U /
L) 0. 8
L, M gC l2 ( 2. 5mmol /L )若干,加 ddH2O
至 25
L, 混匀, 反应混合物在一定温度下温浴后,
80
灭活 5 m in, 1. 5%的琼脂糖凝胶电泳检测扩增
结果。分别采用加入 0、1、2、3和 4
L M gC l2作为
Mg
2+量,根据扩增效果确定适宜 Mg2+浓度; 分别采
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2011年第 2期




应琪等:环介导恒温扩增法快速检测短小芽孢杆菌
用 61、63和 65
作为反应温度,根据扩增效果确定
适宜反应温度;分别采用 30、45和 60 m in作为反应
时间, 根据扩增效果确定适宜反应时间。
1. 5
LAMP灵敏度验证
取模板 DNA 10倍梯度稀释 ( 10- 1 - 10- 12 ) ,分
别作为模板,通过经优化的 LAMP和 PCR法扩增,
比较两者灵敏度差异, 以能出现电泳条带的最低模
板量作为最低检测极限, 用 1. 5%的琼脂糖凝胶电
泳进行分离,加样量 3
L, 于凝胶成像系统下观察。
1. 6
特异性验证
选取荧光假单胞菌、腐败希瓦氏菌、地衣芽孢杆
菌、枯草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌和威尔氏李斯特
菌 6种常见腐败细菌用于 LAMP特异性验证, 反应
体系和条件见前,时间为 1 h。
2
结果
2. 1
LAMP扩增条件的确立
选择不同扩增温度, 比较不同温度对于反应的
影响, 图 1所示, 反应温度为 63
达到最佳扩增效
果; 选择添加 MgC l2 ( 2. 5 mmo l/L ) 0 - 4
L 进行
LAMP反应, 图 2所示,不额外添加 MgC l2时条带清
晰明亮,出现阶梯状条带,扩增效果最佳; 在反应温
度为 63
,不额外添加 Mg2+离子的条件下, 45 m in
出现条带, 60 m in条带明显。另外, 肉眼观察反应
管,阳性反应管中反应体系较反应前混浊,而阴性对
照管未见混浊,掌上离心机离心,可见阳性管底部有
少量白色沉淀,而阴性对照管未出现。
M. DL2000 DNA M arker; 1.空白对照; 2, 3, 4.分别为 61、63、
65
恒温条件下扩增结果
图 1
反应温度对 LAMP的影响
2. 2
特异性
自然条件下,腐败的形成大都是由多种细菌共同
作用的结果。本研究选择了荧光假单胞菌、腐败希瓦
氏菌、地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌
和威尔氏李斯特菌 6种常见腐败细菌来验证 LAMP
的特异性。结果 (图 3)表明,短小芽孢杆菌 LAMP扩
增阳性,而荧光假单胞菌、腐败希瓦氏菌、地衣芽孢杆
菌、枯草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌和威尔氏李斯特
菌为阴性反应, 水作为阴性对照也无扩增条带。显
然,该 LAMP技术能特异性检测短小芽孢杆菌。
M. DL2000 DNA M ark er; 1 - 5.分别为 M gC l
2
( 2. 5 mm ol /L )
4、3、2、1、0
L条件下扩增结果; 6.空白对照
图 2
M g2+浓度对 LAMP的影响
M. DL2000 DNA M ark er; 1. 空白对照; 2. 短小芽孢杆菌;
3.苏云金芽孢杆菌; 4.威尔氏李斯特菌; 5. 荧光假单胞菌;
6.腐败希瓦氏菌; 7.地衣芽孢杆菌; 8.枯草芽孢杆菌
图 3
LAMP的特异性试验结果
2. 3
灵敏度
短小芽孢杆菌制备模板原始浓度约为 218. 5
ng /
L,相当于每微升中的拷贝数为 8. 1
1011,其 10
倍梯度稀释试验 (图 4-A )表明, LAMP检测的最低模
板浓度为原始模板浓度的 10- 11, 即 16. 2拷贝每反
应,扩增产物浓度与模板浓度相关性很小;而相应的
常规 PCR检测在模板浓度为原始模板浓度的 10- 10
处隐约有一条带,即最低检测极限约为 162拷贝每反
应,扩增产物浓度与模板浓度相关性较大,随着模板
浓度递减产物发生明显变化 (图 4-B )。LAMP检测的
灵敏度比常规 PCR方法高 1个数量级。
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生物技术通报 B iotechnology
Bulletin 2011年第 2期
M. DL2000 DNA M arker; 1. 空白对照; A. LAMP: 2
10- 12;
3
10- 11; 4
10- 10; 5
10- 9; 6
10- 8; B
PCR: 2. 10- 5; 3.
10- 6; 4. 10- 7; 5. 10- 8; 6. 10- 9; 7. 10- 10; 8. 10- 11; 9. 10- 12
图 4
LAMP(A )和 PCR ( B)方法
检测短小芽孢杆菌的灵敏度
3
讨论
随着人们生活水平的提高, 食品安全问题越来
越受到重视,已然成为一个重大的世界性公共问题。
近年来,全球各地连续发生的食源性疾病爆发事件
导致了大量经济损失;此外,据估计人们生产的食物
中有 25% 在收获后因微生物的腐败而造成损失。
因而找到一种快速检测细菌的方法迫在眉睫。
2000年, No tom i等 [ 7 ]发明的环介导恒温扩增技
术是一种新颖的核酸扩增技术。环介导恒温扩增具
有很高的专一性,要求 4种引物在靶基因上的 6个
不同部位完全匹配才能进行扩增; 环介导恒温扩增
实行的是恒温扩增,省去了昂贵的热循环仪的费用,
并且只要求简单的反应仪器


水浴锅加热即可;
环介导恒温扩增反应利用的是酶的链置换能力及内
引物作用而形成的环状结构,使其能在恒温下使靶
核酸序列呈指数级扩增, 有着较高的扩增速率。目
前,环介导恒温扩增结果判定的主要方法有:直接电
泳,直接观察扩增管的浊度;加入染料直接用肉眼判
定结果。至此, LAMP已广泛用于溶藻弧菌、粪肠球
菌、志贺菌、假结核耶尔森氏菌、迟钝爱德华氏菌、沙
门氏菌、肺炎链球菌、藤黄微球菌和金黄色葡萄球菌
等菌 [ 8- 22]的检测。
本试验在对 NCBI中已公布的短小芽孢杆菌的
核酸序列和特异性的分析基础上, 根据短小芽孢杆
菌木聚糖 ( xynA )基因序列设计一套引物, 优化了反
应条件, 建立了 LAMP检测方法。采用煮沸法提取
短小芽孢杆菌、荧光假单胞菌、腐败希瓦氏菌、地衣
芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌和威尔氏
李斯特菌的模板 DNA, 得到粗制品。用这些粗制模
板 DNA进行 LAMP反应,结果特异地检测出了短小
芽孢杆菌。
本研究建立的 LAMP技术在反应过程中核酸大
量合成,经低速离心, 肉眼可见, 因而可以直接通过
肉眼观察反应结果。虽然凝胶电泳检测更为准确,
但通过反应产生的焦磷酸镁沉淀来判断阳性反应或
者阴性反应也足够灵敏。此外, 与 PCR技术数小时
的反应时间相比, 该检测方法不需要特殊的仪器设
备和实验室条件, 仅需 1 h就能完成, 时间更短, 扩
增产物浓度与模板浓度相关性较小。总之, 本研究
建立的 LAMP技术检测短小芽孢杆菌法具有快速、
低成本、高灵敏度和高特异性的优点。虽然采用凝
胶电泳法检测更为准确, 但通过反应中产生的白色
沉淀来判断阳性反应或者阴性反应也足够灵敏, 尤
其适用于基层,具有广阔的应用前景。
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