全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
B IO TECHNOLOGY　BULL ETIN 2009年第 11期
短小芽孢杆菌肉碱转运系统 opuC
基因的克隆与序列分析
王岩 2 沈锡权 1 吴祖芳 1, 2
(1宁波大学生命科学与生物工程学院 ,宁波 315211; 2宁波大学应用海洋生物技术教育部重点实验室 ,宁波 315211)
　　摘 　要 : 　以前期获得的ω
- 1 2羟基脂肪酸高产突变菌株短小芽孢杆菌 (B acillus pum ilus) M 2F641的总 DNA为模板 ,利用
Primer Prem ier 5. 0软件设计 4对引物 ,对决定长链脂肪酸无效降解途径中肉碱转运的 OpuC转运系统的基因进行克隆 ,成功
获得了 opuCA、opuCB、opuCC和 opuCD的基因序列 ,并利用 MEGA 3. 1、DNAStar等软件进行序列分析。研究内容将为进一步利
用短小芽孢杆菌长链脂肪酸高效转化生产ω
- 1 2羟基脂肪酸菌株奠定基础。
关键词 : 　短小芽孢杆菌 ω
- 1 2羟基脂肪酸 　opuC基因 　序列分析
Clon ing and Sequence Analysis of opuC Gene of Carn itine
Transport System in B acillus pum ilus
W ang Yan2 　Shen Xiquan1 W u Zufang1, 2
(1 Faculty of L ife Science and B iotechnology, N ingbo University, N ingbo 315211;
2 Key Laboratory of Applied M arine B iotechnology, M inistry of Education, N ingbo University, N ingbo 315211)
　　Abs trac t: 　Chromosomal DNA ofω
- 1 2hydroxy fatty acids(HFA) high2yielding mutant B acillus pum ilus strains M 2F641 as a tem2
p late, the gene of OpuC transport system deciding carnitine transport in the course of long2chain fatty acid degradation was amp lified by
PCR, by which the sequences of opuC gene and the am ino acid sequences of O puC transport system were obtained. Results showed that
the length of the opuCA, opuCB , opuCC and opuCD sequences are 1 162 bp, 654 bp, 951 bp and 690 bp, respectively. By using the
MEGA 3. 1 DNAStar software for sequence analysis as well as phylogenetic analysis of OPUC, the results of which showed that the se2
quence of the fragment from B. pum ilus M 2F641 had a high sim ilarity with the OPUC transport system of B. pum ilus SAFR2
032 reported by the reference. This research could p rovide the base for bioconversion of long2chain fatty acids forω
- 1 2HFA p roduction
with high efficiency by B acillus pum ilus.
Key wo rds: 　B acillus pum ilus ω
- 1 2hydroxy fatty acids opuC gene Sequence analysis
收稿日期 : 2009208203
基金项目 :国家自然科学基金 (30840012) ,宁波市自然科学基金 (2007A610054)
作者简介 :王岩 (19822) ,女 ,山东烟台人 ,硕士研究生 ,从事生物催化分子机理研究 ; E2mail: ytziyan20817@1631com
通讯作者 :吴祖芳 , E2mail: wuzufang06@ yahoo. com. cn　　C18长链ω- 1、ω- 2、ω- 3 2羟基脂肪酸在食品、生物、化妆品、表面活性剂及绿色聚合物材料制备等具有重要用途 [ 1～4 ] ,主要通过饱和或不饱和脂肪酸的羟基化来得到 ,而传统有机化学合成中几乎不能进行这样直接的羟基化反应 [ 5, 6 ]。因此 ,由植物油源中脂肪酸非活泼甲基端 C2H键的羟基化是一种非常有用的转化反应。前期研究发现 ,采用增加脂肪酸溶解吸收的措施 ,脂肪酸消耗量提高但羟基脂肪 酸的转化率及产率并没有增加 ,由此推测 ,部分脂肪酸可能进入β2氧化途径被无效消耗。而在动植物和真菌细胞的脂肪酸β2氧化过程中 ,长链脂酰 CoA进入线粒体进行β2氧化需要肉碱作为运输载体 ,细菌细胞质内虽没有线粒体 ,但存在一定的功能区域 ,肉碱是否参与长链脂肪酸的运输至今还未见报道。因此 ,希望通过减少或阻断细菌体内肉碱的转运 ,看是否能减少脂肪酸及其转化产物羟基脂肪酸在细胞
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生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 11期
内的无效代谢 ,以实现ω2羟基脂肪酸的高产率。
肉碱 ( carnitine)又称β2羟基 2γ2N三甲基氨基丁
酸 ,属氨基酸的衍生物 ,广泛存在于动物性食品
中 [ 7 ] ,对于大多数细菌来说 ,肉碱主要靠从外界环
境中吸收获得 ,而不是细胞自身合成 ; Kets等 [ 8 ]用
核磁共振试验首次在植物乳杆菌中发现肉碱具有渗
透保护作用 ,此后在盐胁迫下的单核增生李斯特氏
菌细胞内也发现有肉碱的积累 [ 7, 9 ]。Kempf[ 10 ]在研
究枯草芽抱杆菌转运脂肪酸亲和性物质分子机制
时 ,指出共有 OpuA、OpuB、OpuC、OpuD和 OpuE共 5
个系统来转运亲和性物质 ,其中 OpuC包括 4个结
构基因 opuCA编码 ATPase, opuCC编码细胞外底物
结合蛋白 , opuCB 和 opuCD 编码整合细胞质膜蛋
白 [ 11, 12 ]。OpuC转运底物范围较广 ,包括肉碱和四
氢嘧啶、巴豆甜菜碱、Y2丁酰甜菜碱、O2硫酰基胆
碱、胆碱、脯氨酸甜菜碱和甘氨酸甜菜碱 [ 13, 14 ]。但
在枯草芽孢杆菌中 ,肉碱仅靠 opuC所编码的蛋白来
转运 [ 14 ]。OpuC已被鉴定属于受 ATP驱动结合蛋
白依赖的转运蛋白家族成员。
本研究根据 NCB I中已发表的短小芽孢杆菌
(B acillus pum ilus) SAFR2032 ( CP000813)及芽孢杆
菌属其它菌株的 OpuC转运系统的 4个结构基因序
列分别设计 4对引物 ,经 PCR扩增后获得 B acillus
pum ilusM 2F641的 opuCA、opuCB、opuCC和 opuCD基
因片段 ,并采用 DNA star、MEGA3. 1等软件对测序所
得的序列进行分析。
1　材料与方法
1. 1　菌株和质粒
短小芽孢杆菌 M 2F641由美国路易斯安拿大学
生物技术实验室赠送 ,本实验室保存 ;大肠杆菌 ( E.
coli) JM109本实验室保存 ; pMD182T vector,为 TaKa2
Ra产品。
1. 2　主要试剂和仪器
Ex2Taq DNA聚合酶、蛋白酶 K、DNA Marker为
TaKaRa产品 ;梯度 PCR仪、Eppendorf25804台式离
心机、自动凝胶成像仪。
1. 3 总 DNA的提取
按照 Murrray[ 15 ]的方法提取 B. pum ilus菌株 M 2
F641的基因组总 DNA ,方法略作改进。
1. 4　OpuC转运系统基因的克隆与序列分析
以 B. pum ilusM 2F641染色体 DNA为模板 ,利用
表 1中的特异性引物分别对 OpuC转运系统的 4个
基因序列进行 PCR扩增。
PCR反应体系为 25μl: 10 ×Buffer 2. 5μl, 25
mmol/L MgCl2 2 m l, 10 mmol/L dNTP混合液 1μl,
正反向引物各 0. 5 μl, Ex2Taq polymerase 0. 2 μl,
DNA 1μl, ddH2 O 16. 5μl, PCR反应条件 : 94℃, 5
m in; 30 ×(94℃, 50 s; 53℃, 50 s; 72℃, 50 s) ; 72℃,
10 m in; 16℃保温。
PCR产物经 1%琼脂糖凝胶电泳分离 ,紫外成
像检测。产物纯化按照 DNA 片段纯化试剂盒 (天
根生化科技有限公司 ) ,按操作说明进行。
PCR产物纯化回收后连接到 pMD182T载体上 ,
转化 E. coli JM109感受态细胞。 PCR筛选阳性克
隆 ,送上海英俊生物技术有限公司测序。测序结果
利用 MEGA3. 1、DNAStar等软件进行序列分析。
表 1 引物列表
引物名称 序列 (5’→3’)
opuCA1 GCTGAAACTAGAGAATGTATCTAAGACG
opuCA2 TCATTTCAATGGCAGACGCT
opuCB 1 TGGATCAAATCATCGATTTTC
opuCB 2 TCCTTCAATCCTTTTAAGCC
opuCC1 GAATCGAAAAACAAAATGG
opuCC2 TGTGCTTTTTCAGGAAATTC
opuCD1 TGCAGCAATTATGGACGTAT
opuCD2 GCAGATGTCATGTTTTTTTCA
2 结果与分析
2. 1 短小芽孢杆菌 OpuC转运系统基因的克隆
以短小芽孢杆菌染色体 DNA为模板 ,特异性引
物分别扩增其 OpuC转运系统各部分的核苷酸序
列 , PCR电泳显示 (图略 ) ,获得产物大小分别约为
1. 1 kb、0. 6 kb、0. 7 kb、0. 9 kb,与预期结果相符。
序列在 NCB I中进行 BLAST比对发现 ,克隆获
得的 4个核苷酸序列与已发表的 B. pum ilus SAFR2
032 (CP000813)的 opuCA、 opuCB 、opuCC和 opuCD
的核苷酸相似性分别为 88%、91%、89%和 91% ,所
编码的氨基酸序列相似性均达到 95%以上。用
ContigExp ress软件进行序列拼接后比对结果 (图 1)
显示 ,该片段与 B. pum ilus SAFR2032 的 opuC基因
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2009年第 11期 王岩等 :短小芽孢杆菌肉碱转运系统 opuC基因的克隆与序列分析
相似性为 89%。试验结果说明所克隆所得的 4个
核苷酸片段是 B. pum ilus M 2F641 OpuC转运系统的 opuCA、opuCB 、opuCC和 opuCD基因序列。
图 1 opuC基因的结构
2. 2　短小芽孢杆菌 opuC基因的特性分析
2. 2. 1　opuC基因特性 测序后得到的 opuCA长度
为 1 162 bp ,推测其编码一个 387氨基酸的蛋白质 ,
将该氨基酸序列在 GenBank进行 BLAST比对 ,发现
与 B acillus pum ilus SAFR2032 ( YP001488257)和 B a2
cillus pum ilus ATCC 7061 ( ZP03053942)的甘氨酸甜
菜碱 /肉碱 /胆碱转运系统 ATP结合蛋白 OpuCA的
同源性最高为 , 95% ;与 B acillus subtilis subsp. subti2
lis str. 168 ( NP391263 )、B acillus am yloliquefaciens
FZB42 ( YP001422672 )、B acillus lichen iform is ATCC
14580 ( YP080743 )、L isteria m onocytogenes EGD2e
(NP464953)的 OpuCA的同源性分别为 83%、83%、
80%、和 71% ;与 B acillus subtilis subsp. subtilis str.
168、B acillus am yloliquefaciens FZB42的胆碱转运系
统 ATP结合蛋白 OpuBA 的同源性分别为 81%和
78% ;与 B acillus subtilis的甘氨酸甜菜碱 /L2脯氨酸
转运 ATP结合蛋白 ProV 的同源性为 80%。使用
MEGA3. 1软件对这几种蛋白的氨基酸序列进行比
对分析 ,结果见图 2。
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生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 11期3 表示残基的保守性极高 ; :表示残基的保守性较高 ; . 表示残基保守性稍低
图 2 B. pum ilus M 2F641 O puCA蛋白与部分菌株肉碱转运系统 ATP结合蛋白的同源性比较
2. 2. 2　opuCB 基因特性 获得的 opuCB 基因片段
长度为 654 bp,编码一个含 218个氨基酸的蛋白质 ,
GenBank中进行 BLAST比对 ,发现与 B acillus pum i2
lus SAFR2032的甘氨酸甜菜碱 /肉碱 /胆碱转运系
统细胞质膜蛋白 OpuCB的相似性最高达到 97% ,与
B acillus lichen iform is ATCC 14580、B acillus am yloliq2
uefaciens FZB42、B acillus subtilis subsp. subtilis str.
168、L isteria w elsh im eri serovar 6b str. SLCC5334等的
甘氨酸甜菜碱 /肉碱 /胆碱转运系统细胞质膜蛋白
OpuCB的相似性 ,见表 2。
表 2 B. pum ilus M 2F641的与其它菌种 O puCB转运蛋白的氨基酸序列同源性比较
菌株 相似性 ( % ) 阳性率 ( % ) 得分值 ( score) 登录号
B acillus pum ilus SAFR2032 97 99 413 YP001488256
B acillus licheniform is ATCC 14580 82 92 362 YP080742
B acillus am yloliquefaciens FZB42 83 91 362 YP001422671
B acillus subtilis subsp. subtilis str. 168 81 91 353 NP391262
L isteria w elsh im eri serovar 6b str. SLCC5334 58 80 265 YP849641
L isteria m onocytogenes EGD2e 58 80 264 NP464952
L isteria m onocytogenes str. 4b F2365 58 80 264 YP176524
B acillus clausii KSM2K16 60 79 248 YP176525
21213　opuCC基因特性 　opuCC 基因长度为 951
bp,推测其编码一个包含 310个氨基酸的蛋白质。
在 GenBank中进行 BLAST分析 ,发现其与 B acillus
pum ilus SAFR2032的甘氨酸甜菜碱 /肉碱 /胆碱转运
系统的胞外底物结合蛋白 OpuCC ( YP001488255. 1)
的相似性最高为 95%; 与 B acillus subtilis ( ZP0359
3178)、B acillus licheniform is ATCC 14580 ( YP080741)、
B acillus am yloliquefaciens FZB42 ( YP00142267 )、
S taphylococcus carnosus subsp. carnosus TM300 ( YP0026
35023)的 OpuCC同源性分别达到 70%、69%、66%
和 56%。
2. 2. 4　opuCD 基因特性 测序获得的 opuCD 核苷
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2009年第 11期 王岩等 :短小芽孢杆菌肉碱转运系统 opuC基因的克隆与序列分析
酸序列长度为 690 bp,编码一个含 229个氨基酸的
蛋白质 ,经 BLAST后发现该蛋白与 B acillus pum i2
lus SAFR2032的甘氨酸甜菜碱 /肉碱 /胆碱转运系
统胞质膜蛋白 OpuCD ( YP001488254)相似性最高 ,
达到 97% ,与 B acillus subtilis subsp. subtilis str. 168、
B acillus am y loliquefaciens FZB42、L isteria m onocyto2
genes str. 4b F2365、B acillus clausii KSM 2K16 的
OpuCB同源性分别为 85%、86%、73%和 63%。使
用 MEGA3. 1软件对这几种蛋白的氨基酸序列进行
比对分析 ,结果见图 3。
3 表示残基的保守性极高 ; :表示残基的保守性较高 ; . 表示残基的保守性稍低
图 3 B. pum ilus M 2F641 O puCD蛋白与部分菌株肉碱转运系统胞质膜蛋白的同源性比较
2. 3 短小芽孢杆菌 OpuC蛋白进化关系分析
利用 MEGA3. 1软件构建 B. pum ilusM 2F641及
已发表的部分菌株 OpuC蛋白的 N2J进化树 (图 4)。
结果表明 B acillus pum ilus M 2F641与 B acillus pum i2 lus SAFR2032 和 B acillus pum ilus ATCC 7061 的OpuC蛋白的同源性最高 ,处于同一个小分支 ,而与M acrococcus caseoly ticus JCSC5402的同源性最低。
图 4 B. pum ilus及部分已发表的菌株 O puC蛋白的分子系统树
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3 讨论
肉碱在脂肪酸的代谢过程中起着举足轻重的作
用 ,是运输长链脂酰 CoA参加β2氧化的载体。目前
为止 ,革兰氏阴性菌和革兰氏阴性菌的模式菌 E. coli
和 B. stu tilis的甘氨酸甜菜碱 /肉碱 /胆碱转运系统的
ProU和 OpuC中已经被克隆和鉴定 [ 16 ]。本试验成功
地从ω
- 1 2羟基脂肪酸高产突变株 B acillus pum ilus M2
F641中克隆了甘氨酸甜菜碱 /肉碱 /胆碱转运系统 ,
获得了 opuC基因的全序列及其编码的氨基酸序列。
本研究结果对下一步利用大肠杆菌 2芽孢杆菌
穿梭温敏质粒 pKSV7作为自杀载体 [ 17～21 ] ,实现对
长链脂肪酸无效降解代谢途径中 opuC基因的敲除
或抑制提供了研究基础 ,有望通过基因调控手段实
现 B. pum ilus M 2F641的ω
- 1 2羟基脂肪酸高效化生
产 ,具有广泛的工业和商业价值。
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