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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第10期
麻疯树有很高的经济价值，是国际上研究最多
的能生产生物柴油的能源植物之一，是世界公认的
最有可能成为未来替代化石能源的具有巨大开发潜
力的树种［1］。目前国内外关于麻疯树的组织培养和
植株再生的研究已有不少，主要是采用腋芽快繁［2，3］，
子叶［4，5］、上胚轴再生［6］和叶片再生［7］这几种方法。
最近 Li 等［8］以麻疯树的子叶为外植体，在芽的诱
收稿日期 : 2012-03-08
基金项目 : 林业公益性行业科研专项“麻疯树基因工程与抗寒育种研究”（200904038）
作者简介 : 王琼 , 女 , 硕士 , 讲师 , 研究方向 : 植物基因育种 ; E-mail: wangqiong7640@yahoo.com.cn
通讯作者 : 陈介南 , 男 , 博士 , 教授 , 研究方向 : 林木遗传育种和生物能源 ; E-mail: chenj@besti.org
麻疯树悬浮细胞系的建立与优化
王琼 孔倩倩 李志辉 陈介南
（中南林业科技大学生物环境科学与技术研究所，长沙 410004）
摘 要： 以麻疯树无菌幼苗为外植体，研究疏松愈伤组织诱导方案及不同培养条件对麻疯树悬浮细胞生长的影响，旨在建
立麻疯树悬浮细胞体系。结果表明，麻疯树疏松愈伤组织诱导的最适培养基及激素组合为：MS+2，4-D 0.6 mg/L+BA 1.0 mg/L + 蔗糖
30 g/L，此培养基上诱导出的愈伤组织湿润松散，颜色鲜艳。接种愈伤组织进行悬浮培养的液体培养基最适激素组合为：NAA 0.2
mg/L+2, 4-D 1.0 mg/L+BA 0.5 mg/L。初代愈伤组织适宜用于悬浮培养，摇床转速应低于 120 r/min为宜，这样培养的悬浮细胞分散度
最高。培养基中添加 500 mg/L水解酪蛋白能有效地促进悬浮细胞的生长。悬浮细胞振荡培养过程中悬浮细胞生长的时间进程为起
始培养的第 5天前，细胞增殖十分缓慢；第 5-11天期间生长迅速；第 13天后基本停止生长。在上述优化培养条件下，麻疯树悬
浮细胞系增长速率最快，细胞生长状态最佳。
关键词： 麻疯树 愈伤组织 悬浮细胞
Establishment and Optimization of Suspension Cell
System of Jatropha curcas
Wang Qiong Kong Qianqian Li Zhihui Chen Jienan
（Institute of Biological and Environmental Science & Technology，Central South University of Forestry and Technology，Changsha 410004）
Abstract: By using an aseptic seedling stem section of planlet as explants, the effect of different scheme of loose callus induction and
the different culture condition was determined for the culture of suspension cell of Jatropha curcas. Cell suspension cultures of Jatropha curcas
were established. The result shows that the most suitable hormone combination of loose callus induction is MS+2, 4-D 0.6 mg/L+ BA1.0 mg/L +
Sucrose 30 g/L, in which the callus is humid, loose and colorful, and the optimal subculture medium’s compounding formula is NAA 0.2 mg/L+
2, 4-D 1.0 mg/L+BA 0.5 mg/L. The optimal subculturing time of the suspension cell is the first generation and the rotation speed should be lower
than 120 r/min in the culture of oscillation, which have the highest cell dispersion. Adding 500 mg/L casein hydrolysate in medium can promote
the growth of suspension cell. The schedule of suspension cell growth showed that cell grow lagged in 0-5 days and enhanced greatly in 5-11
days and almost ceased after 13 days of cultivation. Under the optimal culture conditions, the growth rate of suspension cell of Jatropha curcas
was fastest and growing state of cells was the best.
Key words: Jatropha curcas Callus Suspension cell
导中通过添加赤霉素，使诱导频率达到了 94%，这
是目前再生频率最高的成果。另外，Timir 等［9］还
进行了体胚发生的研究，先用幼嫩的叶片为外植体
诱导出乳白色的胚性愈伤组织，再在含有 IBA 和 KT
的培养集中诱导出球型胚，从而诱导出完整的植株，
实现了由体胚发生途径来诱导植株的途径。本实验
室［10］以温室中的麻疯树叶片为材料，研究了 6-BA
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第10期174
和 IBA 对愈伤组织和不定芽诱导率的影响，麻疯树
叶盘再生率达到90.9%，平均不定芽个数达到4-6个。
在麻疯树转化技术的研究上，中国科学院华南
植物所李美茹［11］通过梯度试验检测不同外植体对
卡那霉素、潮霉素和除草剂，以及头孢霉素的敏感性，
从而确定了基因转化筛选的最佳抗生素浓度，使用
GUS 染色的方法来确定最佳的转化条件。在此基础
上，该研究小组［8］以子叶为外植体，建立以潮霉素
和除草剂为筛选标记和以 GUS 为报告基因的农杆菌
转化体系，获得转基因植株，转化效率可达到 13%。
植物悬浮细胞能作为转基因技术的受体材料，
应用于植物转基因方面的研究。麻疯树主要分布于
热带和亚热带地区，绝大多数生长在美洲和亚洲热
带地区，使麻疯树受到地域、温度等方面的限制，
这必将制约麻疯树的深入研究和广泛开发利用。植
物细胞培养不失为解决上述问题的一个好办法，直
到目前为止，未见有关于麻疯树细胞悬浮培养方面
的报道。本研究建立了麻疯树悬浮培养细胞系，并
对其悬浮培养的生长特性作了初步探讨，旨在为麻
疯树细胞的大规模悬浮培养和后续研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
选用本实验室在云贵采集的优质种源中的麻疯
树种子为试验材料。
1.2 方法
1.2.1 无菌苗的培养 剥去麻疯树种子的坚硬外壳
后，用清水洗净浸泡 48 h，用滤纸吸去种子表面水
分置于 100 mL 的锥形瓶中，用 3%-10%（V/V）的
次氯酸钠消毒 15 min，无菌水冲洗 3-5 次，消毒过
程中不断震荡锥形瓶。如气温较高，消毒时间应相
应缩短。灭菌后的种子在置有 MS 培养基的培养皿
上萌发，萌发培养基中加 3% 蔗糖，1% 琼脂，不
加任何激素，pH5.8。培养瓶在 4℃冰箱中，黑暗放
置 2 d，以利于发苗一致。再转移到 25℃组培室中，
12/12 h 光 / 暗培养［12］。
1.2.2 疏松愈伤组织诱导 将麻疯树无菌苗茎段接
种于 MS、1/2MS、DCR、WPM4 种基本培养基，分
别添加不同浓度的细胞分裂素 BA（0、0.5、1.0、1.5
和 2.0 mg/L），不同浓度的蔗糖（10-46 g/L），7.2 g/L
琼脂，pH 值调至 5.8，放入恒温培养室中进行疏
松愈伤组织的诱导，温度设为 25±2℃，光照强
度 3 000 lx，光照时间 12 h/d，室内空气湿度 65%-
70%。
1.2.3 悬浮细胞的培养 分别选取生长良好，质地
疏松的初代、继代 2 次和继代 4 次的愈伤组织接种
到液体培养基中，恒温振荡培养，每 3 d 更换一次
新鲜培养基，平行接种 4 瓶，探讨不同继代次数愈
伤组织对悬浮细胞的影响。
将疏松愈伤组织以 15 g/L 的量接入不同配比的
培养基，添加蔗糖 30 g/L，抗坏血酸（Vc）0.1 g/L，
pH 值 5.8，恒温振荡培养，温度 25℃，转速 110 r/min。
每 3 d 更换一次新鲜培养基，平行接种 4 瓶，探讨
不同激素浓度及培养基类型对悬浮细胞生长的影响。
将 500 mg/L 水解酪蛋白（CH）加入不同生长调
节剂组合和培养基类型的液体培养基中，与未加入
CH 的相同培养基做对比，pH 值调节至 5.8，恒温振
荡培养，温度 25℃，转速 110 r/min。每 3 d 更换一
次新鲜培养基，平行接种 4 瓶，测量培养基中细胞
的生物量，探讨不同CH浓度对悬浮细胞生长的影响，
如表 1 所示。
表 1 不同浓度激素和 CH组合的培养基
编号 培养基 CH（mg/L）
1 MS+NAA 0.2 mg/L+2，4-D 0.5 mg/L+BA 0.5 mg/L 5 000
2 MS+NAA 0.2 mg/L+2，4-D 1.0 mg/L+BA 0.5 mg/L 5 000
3 MS+NAA 0.2 mg/L+2，4-D 1.5 mg/L+BA 0.5 mg/L 5 000
把 15 g/L 愈伤组织接入装有液体培养基的三角
瓶中，恒温振荡培养，转速分别设定为 100、110、
120 和 130 r/min，每 3 d 更换一次新鲜培养基，培养
15 d 后，探讨摇床转速对悬浮细胞生长的影响。
1.2.4 悬浮细胞生长特性的测定 从培养的第 1 天
起，每 2 d 取 1 次样直到 19 d，每个样本 5 瓶，3 次
重复，称重法测细胞鲜质量，计算细胞的增长速率：
μ=（W1-W0）/W0×100%，式中 ：μ 为悬浮细胞增长
速率 ；W1 为取样的细胞克数 ；W0 为初始接种克数。
以培养时间为横坐标，增长量为纵坐标，绘制生长
曲线。
2012年第10期 175王琼等 ：麻疯树悬浮细胞系的建立与优化
2 结果
2.1 愈伤组织的诱导与分化
以麻疯树无菌苗茎段为外植体，分别以 MS、
1/2MS、DCR 和 WPM 为基本培养基，并添加不同浓
度的 BA。对外植体进行培养，选取适合麻疯树愈伤
诱导的基本培养基，20 d 后统计结果，见表 2。
表 2 不同浓度 BA与基本培养基组合对愈伤组织诱导率的影响
编号 培养基 BA（mg/L） 愈伤组织诱导率（%） 平均诱导率（%）
1 MS 0.00 16.51 53.06
2 0.50 41.09
3 1.00 77.32
4 1.50 70.93
5 2.00 59.47
6 1/2MS 0.00 11.67 30.08
7 0.50 29.82
8 1.00 45.96
9 1.50 43.31
10 2.00 23.24
11 DCR 0.00 9.12 45.52
12 0.50 38.46
13 1.00 68.70
14 1.50 65.26
15 2.00 46.08
16 WPM 0.00 4.56 23.28
17 0.50 18.34
18 1.00 36.07
19 1.50 32.16
20 2.00 25.29
由图 1 可以看出，在 BA 水平相同的情况
下，不同基本培养基对愈伤组织的平均诱导率
存在较大差别，诱导率顺序从高到低依次为 ：
MS>DCR>1/2MS>WPM，因此，对于愈伤组织的启动
诱导，最适培养基为 MS 基本培养基。此外，同一
种培养基不同 BA 水平之间，愈伤组织的诱导率也
有较大变动，在 BA 浓度为 0 mg/L 时，诱导率均处
于较低的水平，培养基中添加 BA 后，诱导率即发
生较为明显的变化，并且在 1.0 mg/L 这一水平达到
最大值，2.0 mg/L 时，诱导率下降，说明 BA 对愈伤
组织的诱导也有较大的影响，培养基中 BA 的浓度
应以 1.00 mg/L 左右为佳。
在蔗糖浓度 10-46 g/L 的 10 个不同处理中接种
的初代愈伤组织，培养 20 d 后，不同蔗糖浓度对愈
伤组织生长状况的影响如图 2 所示。蔗糖浓度和愈
伤组织的生长、分化有一定的关系，试验结果表明
当蔗糖浓度为 22-34 g/L，愈伤组织的生长较好，而
图 1 不同浓度 BA与基本培养基组合下麻疯树愈伤组
织生长变化曲线
蔗糖浓度达到 30 g/L 的愈伤组织生长状况最好。但
愈伤组织的生长状况还与培养基的渗透压也有一定
关系，而渗透压的高低又与培养基中蔗糖的浓度水
平呈正相关。蔗糖浓度较低，愈伤组织的质地疏松，
含水量高，培养基的渗透压较低 ；当蔗糖浓度逐渐
升高时，培养基的渗透压也随之升高，则愈伤组织
质地越来越紧密，含水量也明显下降。从图 2 中愈
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第10期176
伤组织的增值率来看，其受蔗糖浓度的影响也较为
明显，蔗糖浓度为 30 g/L 时愈伤组织的生长、分化
达到最佳。
伤组织接种到将 6 种不同处理的培养基中的悬浮细
胞体系培养至第 15 天时，进行观察。如表 3 所示，
结果表明基本培养基中加入不同的细胞分裂素会影
响愈伤组织的分化和悬浮细胞的生长。加入 BA 细
胞分裂素，培养基中的悬浮细胞体系生长较好，愈
伤组织呈淡黄色，分散成较小的细胞团，培养基澄
清，贴壁细胞较少。而当加入 KT 细胞分裂素，培
养基中悬浮细胞体系生长较差，愈伤组织暗黄色，
细胞团较大，培养基有少许浑浊，贴壁细胞数目较
多。显微镜下观察，3 种培养基内的细胞团中的细
胞都具有明显的细胞壁，细胞近似长方形，排列紧
密，几乎没有单个游离细胞。另外，不同浓度的细
胞生长素2，4-D会影响细胞的生长状况，如图3所示，
将 0.5、1.0、1.5 和 2.0 mg/L 2, 4-D 加入到 MS+NAA
0.2 mg/L+BA 0.5 mg/L 培养基中，分取少量细胞悬液
放置于倒置显微镜（目镜 40×，物镜 50×）下观
察，发现当 2，4-D 浓度为 1.0 mg/L 时，培养基中悬
浮细胞系生长状况最好，细胞呈长圆形，排列疏松，
没有明显的细胞壁，细胞内液泡较小，游离细胞的
数目较多。而浓度越大，细胞个体越大，且细胞之
间排列紧密，游离细胞数目较少。因此，悬浮细胞
培养的最适培养基为 ：MS+NAA 0.2 mg/L+2，4-D 1.0
图 2 不同蔗糖浓度和愈伤组织增值率的关系
以麻疯树无菌苗为材料，综合叶片在不同浓
度激素和蔗糖的基本培养基中，诱导出愈伤组织的
形态、质地和诱导率大小，确定麻疯树疏松愈伤组
织诱导的最适培养基及激素组合为 ：MS+2，4-D 0.6
mg/L+BA 1.0 mg/L + 蔗糖 30 g/L 。如图 3 所示，该配
比培养基中诱导出的愈伤组织生长状况好，疏松易
碎，适合用于悬浮细胞培养。
2.2 悬浮细胞的培养及优化
将 1.5 g 颜色鲜黄、质地疏松、分散性高的愈
图 3 麻疯树无菌苗（A）、新鲜的愈伤组织（B）和愈伤分化后的悬浮细胞液（C）
表 3 不同培养基组成成分对悬浮细胞的影响
激素配比 生长情况 细胞大小 细胞数目 悬浮液浑浊度
NAA 0.2 mg/L +2，4-D 0.5 mg/L+BA 0.5 mg/L 较好 小 较少 较清
NAA 0.2 mg/L +2，4-D 1.0 mg/L+BA 0.5 mg/L 好 小 多 清
NAA 0.2 mg/L+ 2，4-D 1.5 mg/L+BA 0.5 mg/L 较好 小 多 清
NAA 0.2 mg/L+ 2，4-D 2.0 mg/L+BA 0.5 mg/L 较好 小 多 清
NAA 0.2 mg/L +2，4-D 0.5 mg/L+KT 0.5 mg/L 较差 大 较少 较浑浊
NAA 0.2 mg/L+2，4-D 1.0 mg/L+KT 0.5 mg/L 较差 大 较少 较浑浊
NAA 0.2 mg/L+2，4-D 1.5 mg/L+KT 0.5 mg/L 较差 大 少 混浊
NAA 0.2 mg/L+2，4-D 2.0 mg/L+KT 0.5 mg/L 较差 大 少 混浊
2012年第10期 177王琼等 ：麻疯树悬浮细胞系的建立与优化
mg/L+BA 0.5 mg/L。
研究不同继代次数愈伤组织对悬浮细胞培养的
影响，如表 4 所示。取初代愈伤组织和继代两次的
愈伤组织分别接入 MS 基本培养基。培养 15 d 后，
肉眼观察，接入初代愈伤组织的液体培养基颜色澄
清，愈伤组织呈淡黄色，培养基中出现很多直径约
1.0-2.0 mm 的细胞团聚体 ；接入继代两次愈伤组织
的液体培养基颜色稍浑浊，愈伤组织呈黄色，培养
基中细胞团聚体较少，且大部分直径大于 2 mm，约
2.0-4.0 mm 左右。放于倒置显微镜下观察，发现接
入初代愈伤组织的细胞团更加分散，且细胞更加饱
满，培养基中已有单个的游离细胞存在，而接入继
代愈伤组织的培养基中未发现游离的细胞。结果表
明初代愈伤组织更适合用来建立悬浮细胞培养体系。
表 4 不同继代次数愈伤组织对悬浮细胞培养的影响
愈伤组织 培养基颜色 愈伤组织颜色 细胞分散程度 游离细胞数目
初代愈伤 澄清 奶油色 分散较均匀，直径 1.0-2.0 mm 的细胞团 较多
继代 2 次 稍浑浊，略带淡黄色 淡黄色 较分散，直径 2.0-4.0 mm 的细胞团 少量
继代 4 次 浑浊，呈淡黄色 淡黄色，有褐色斑点 较分散，直径 2.0-3.0 mm 的细胞团 无
研究水解酪蛋白对悬浮细胞生长的影响，培养
15 d 后，测量各培养系中细胞干重，不同培养基中
细胞的生物量增殖量变化，如图 4 所示。添加 CH
500 mg/L 的 3 个不同激素浓度组合的培养基中，细
胞的生物量均发生变化，说明 CH 可以有效的促进
悬浮培养细胞生长，加速细胞内的合成反应，从而
使细胞的生物量增加。因此，对于麻疯树悬浮细胞
的培养，CH 是一种有益的有机氮添加物。
1. MS+NAA 0.2 mg/L+2，4-D 0.5 mg/L+ BA 0.5 mg/L; 2. MS +NAA
0.2 mg/L+2，4-D 1.0 mg/L+BA 0.5 mg/L; 3. MS+NAA 0.2 mg/L+2，4-D
1.5 mg/L+BA 0.5 mg/L
图 4 CH对悬浮细胞生物量的影响
采用气浴恒温振荡进行麻疯树细胞悬浮培养时，
摇床转速对细胞生长也有很大影响，试验中研究了
摇床转速分别为 90、100、110 和 120 r/min 时细胞
生长状况（数据未列出）。当摇床转速低于 100 r/min
时，细胞生长缓慢，且分散性差，同时出现褐化。
当摇床转速高于 120 r/min 时，培养液起沫、挂壁现
象严重，显微镜下观察衰败、破碎细胞较多。试验
结果（未列出）表明，采用 110 r/min 转速的悬浮培
养系的细胞则分散性较好，小细胞团呈淡黄色，显
微镜下观察，衰败、破碎细胞数目很少。因此，悬
浮细胞培养时摇床转速以 110 r/min 为宜。
在悬浮细胞系培养的初期，有许多长弯形、月
牙形、长条形等不规则形状的细胞出现，这类细胞
的细胞质稀薄，液泡大，呈透明状。随着继代次数
的增加，此类细胞逐渐减少，近球形和球形细胞逐
渐增多，且细胞质也由稀变浓。经过 1-2 月的继代
培养，不规则细胞逐渐被淘汰，最终建立起稳定快
速生长的悬浮细胞系（图 5）。用孔径为 40 目镍网
过滤掉大细胞团，得到由小细胞团（2-20 个细胞）（图
5-A）和单细胞（图 5-B）构成的培养物，该培养物
细胞呈圆球形，细胞核明显，细胞胞质浓厚，内含
物丰富。
从麻疯树悬浮培养细胞的生长曲线（图 6）可
以得到如下结论 ：生长曲线呈“S”型，即增长量呈
先上升后下降的趋势。接种第 1-5 d 为延迟生长期，
图 5 麻疯树疏松的细胞团（A）和单个细胞（B）图片
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第10期178
增长量很小，仅仅增长 50% ；第 5-11 天为快速生长
期，增长量急剧增加 ；第 13 天增长量最大，其值超
过 200%，第 15-19 天为生长减慢期，增长量下降。
系沿瓶壁缓慢旋转，培养基通气量不足，细胞团受
到的剪切力较小，生理代谢水平较低，造成细胞粘
连，不容易分散。当摇床转速高于 120 r/min 时，由
于随着摇床转速的提高，培养基中氧含量增加，剪
切力增大，而当转速继续提高时，剪切力则成为制
约细胞生长的主要因素，对细胞造成不可逆转的伤
害，致使细胞大量衰败、破碎。
此外，培养基 pH 值也对悬浮细胞的生长有一
定得影响。试验发现，悬浮培养 3 d 后，培养基的
pH 值会下降 0.5-1.2，呈现弱酸性，这对于麻疯树
悬浮细胞的生长是不利的。因此，悬浮培养系每 3 d
更换一次新鲜培养基，以保证细胞处在适宜的 pH
值范围内。从悬浮细胞生长曲线可知第 13 天增长量
最大。经过 1-2 月的继代培养，不规则细胞逐渐被
淘汰，由小细胞团和单细胞构成的培养物，细胞呈
圆球形，细胞核明显，细胞胞质浓厚，内含物丰富［13］，
最终建立起稳定快速生长的悬浮细胞系。
4 结论
本研究在麻疯树组织培养的基础上，以疏松愈
伤组织为材料，建立了麻疯树悬浮细胞培养系，并
探讨了各种不同培养条件对悬浮细胞生长的影响。
结果表明，麻疯树疏松愈伤组织诱导的最适培养基
及激素组合为 ：MS+2，4-D 0.6 mg/L+ BA 1.0 mg/L+
蔗糖 30 g/L，悬浮细胞培养系的最适激素组合为 ：
NAA 0.2 mg/L+2，4-D 1.0 mg/L +BA 0.5 mg/L。试验中
将初代愈伤组织用于悬浮培养，当摇床转速为 110
r/min，添加 500 mg/L 水解酪蛋白时，能有效地促进
悬浮细胞的生长。本试验还证实了悬浮细胞的生长
曲线基本呈 “S”型，第 13 天增长量最大，细胞分
散度最高。
参 考 文 献
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（Jatropha curcas L.）：influence of additives. International Journal
图 6 麻疯树悬浮细胞生长曲线
3 讨论
离体植物组织和细胞的培养中，一般使用植物
生长调节剂来启动细胞分裂和促进细胞生长。试验
结果表明，2，4-D 与 KT 组合虽然也能诱导出疏松愈
伤组织，但用于悬浮细胞液体培养基时，无法培养
出稳定、良好的悬浮细胞体系，这其中的机理还有
待于进一步研究。相对固体培养基，植物细胞悬浮
培养在液体培养基中进行时，培养物与培养基的接
触面积增大，对培养基内各种无机离子和有机成分
等的消耗也相应的增加。因此，培养基中常添加一
些有机物来补充消耗掉的养分。本研究以水解酪蛋
白作为有机添加物，结果表明，它能有效地促进麻
疯树悬浮培养细胞的生长，使培养系的生物量增加。
初代、2 次继代和 4 次继代的愈伤组织用于悬浮培
养时，以初代愈伤组织较为适宜，悬浮培养系中的
细胞分散度最高。这可能是因为初代愈伤的植物细
胞刚刚脱分化，在内源和外源植物激素的作用下，
细胞的生命力更加旺盛，细胞生长迅速。而经过两
次继代的愈伤组织中，细胞有部分已经老化，细胞
次生代谢物质积累，有些次生代谢物质对细胞本身
又产生毒害作用，细胞开始逐渐进入程序性死亡过
程，细胞内的各种生理活动逐渐减慢，细胞分裂速
度下降，细胞壁脆弱易碎，细胞在震荡培养过程中
容易破碎解体。采用气浴恒温振荡箱培养，不同转
速下悬浮培养系中细胞的生长状况差异可能是由于
培养基中氧气含量和液体培养基对细胞的剪切力大
小造成的。当摇床转速低于 100 r/min 时，由于培养
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（责任编辑 狄艳红）