全 文 ：·技术与方法·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2015, 31(3):64-69
RNA 干 扰（RNA interference，RNAi） 作 为 生
物界普遍存在的一种抵御外来基因感染的保守机制，
本质上是一种由内源性或外源性双链 RNA（double
strand RNA，dsRNA）引起的靶基因特异性沉默效应
（gene silence），已被广泛应用于基因敲除、基因调控、
功能分析和疾病防治等方面，并在基因治疗（gene
therapy）中崭露头角［1-4］。能引起 RNAi 效应的分子
称为干扰性小 RNA 分子（interfering small RNA），多
为 19-29 个核苷酸（nt）的非编码 RNA（non-coding
RNA，ncRNA），主要包括小干扰 RNA（small inter-
fering RNA，siRNA）、 微 小 RNA（microRNA，miR-
NA） 和 piwi 蛋 白 RNA（piwi interacting RNA，piwi-
RNA）几类，是 RNAi 效应的最终“执行者”。
目前，干扰性小 RNA 分子的产生主要依赖于化
收稿日期 ：2014-09-02
基金项目 ：国家“863”计划项目（2012AA020810），国家自然科学基金项目（81271692），华侨大学“中央高校基本科研业务费”项目
（JB-JC1004），华侨大学人才引进项目（14BS111）
作者简介 ：侯莹，女，硕士研究生 ；研究方向 ：非编码 RNA ；E-mail ：hy552014@163.com
通讯作者 ：唐明青，男，博士，副研究员，研究方向 ：非编码 RNA，基因药物，病毒载体 ；E-mail: Tangmingqing2222@163.com
从功能部件看小干扰 RNA 表达载体的发展
侯莹1  孙西魁1  唐明青1，2
（1. 华侨大学生物医学学院 & 分子药物研究院，泉州 362021 ；2. 分子药物教育部工程研究中心，厦门 361021）
摘 要 ： RNA 干扰作为转录后基因沉默的有效途径，在基因调控、功能分析及疾病防治等领域发挥重要作用。小干扰 RNA
表达载体的诞生实现了 RNA 干扰技术持续、稳定和可控性应用，是实现基因沉默的理想选择。目前干扰性小 RNA 表达载体虽已
发展到第二代，也开发出多种商品化的产品，但依然未能很好地解决其高效、安全、可控性方面的矛盾，发展陷入了瓶颈期。因此，
从载体自身角度出发，通过系统分析其功能部件的特点，纵观小 RNA 载体的历史渊源、发展现状、存在问题和发展方向等问题，
为干扰性小 RNA 表达载体的优化与选择提供相关理论指导。
关键词 ： 小干扰 RNA ；表达载体 ；表达元件 ；短发夹式 RNA 载体 ；人工微小 RNA 载体
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.04.009
Evaluating the Development of Small Interfering RNA Expression
Vector from Its Functional Elements
Hou Ying1 Sun Xikui1 Tang Mingqing 1，2
（1. School of Biomedical Sciences and Institute of Molecular Medicine，Huaqiao University，Quanzhou 362021 ；2. Engineering Research
Center of Molecular Medicine，Ministry of Education，Xiamen 361021）
Abstract: RNA interference as a potent gene silencing approach plays important parts in gene regulation, functional study and gene
therapy. The small interfering RNA expression vector achieves a sustainable, stable and controllable application of the RNAi technology, and
becomes a promising way for gene silencing. Although the interfering RNA expression vector has progressed to the second generation, and many
commercial products were availabe, the discrepancies among efficiency, safety and controllability of these vectors still exist. The development
of the interfering RNA expression vector seems get into a lag phase. Therefore, this article analysed the history and development of these small
interference RNA expression vectors on the basis of their functional blocks, providing a theoretical fundation for the vector’s optimization and
selection.
Key words: small interference RNA ；expression vector ；expression component ；short haipin RNA vector ；artificial microRNA vector
2015,31(3) 65侯莹等：从功能部件看小干扰 RNA表达载体的发展
学合成（chemical synthesized）和载体表达（vector
expression）两种途径。前者由于体外合成错误率高、
体内稳定性差、成本高及后续操作条件苛刻等原因，
极大的限制了其在现代生物学中的应用和发展 ；而
干扰性小 RNA 的载体化表达，即将目的小 RNA 嵌
入特定的载体中进行表达，能很好的弥补化学合成
型小 RNA 的诸多不足，有望实现长效、安全、可控
性表达，为个体化及靶向性基因治疗奠定了基础［5］。
当前干扰性小 RNA 表达载体虽然已经发展到第二
代，也开发出了多种商品化的产品，但依然未能很
好的解决其高效、安全、可控性方面的矛盾，发展
陷入了瓶颈期。因此，本文从载体自身角度出发，
通过系统分析其功能部件的特点，纵观小 RNA 载体
的历史渊源、发展现状、存在问题和发展方向等问题，
为干扰小 RNA 表达载体的优化与选择提供相关理论
指导。
1 功能部件
干扰性小 RNA 表达载体是一类经济、高效的
载体，由启动子（promoter）、表达骨架（expression
backbone）、目的小 RNA 序列及辅助元件（auxiliary
component）组成。在实际元件组装中，先将目的小
RNA 序列插入表达骨架后形成小 RNA 表达框，随
后在表达框的上下游分别加入相应的启动子和辅助
元件而形成完整的干扰性小 RNA 表达载体。因此，
小 RNA 表达框的确定是整个干扰性小 RNA 表达载
体构建的核心部分。目前主要通过化学合成和 PCR
法来获取目的小 RNA 表达框［6，7］，前者适用于较短
小的小 RNA 表达框，而后者适于长片段的小 RNA
表达框［5，8］。
1.1 启动子
启 动 子 是 DNA 链 上 一 段 能 与 RNA 聚 合 酶
（RNA polymerase）结合并促进起始 RNA 合成的序列，
是基因表达不可缺少的元件。用于干扰性小 RNA 表
达载体的启动子主要为 RNA 聚合酶Ⅲ启动子（Pol
Ⅲ）及 RNA 聚合酶Ⅱ启动子（Pol Ⅱ）两类（表 1）。
前者如 U6 和 H1，具有固定的起始位点，遇到 4-6
个连续的胸腺嘧啶（T）即终止转录，能高效、精
确地合成目的小 RNA 序列，但此类启动子不宜携
带较大片段的报告基因或其他功能性基因，同时缺
乏组织特异性，且易产生脱靶效应（off-target）和
细胞毒性（cytotoxicity），目前主要用于 siRNA 的载
体化表达［5，6］。而 Pol Ⅱ启动子如 CMV 和 CAG 等，
无固定的启动位点，启动能力强，可携带大片段的
报告基因或其他功能性基因亦不会因少数连续的胸
腺嘧啶而终止转录，因此更有利于实现靶向性和可
控性表达，广泛用于内源性 miRNA 及人工 miRNA
表 1 三类干扰性小 RNA 表达载体的对比分析
载体类别 启动子
表达框
架特点
缺点 优点 研究热点 经典代表 参考文献
shRNA
载体
Pol Ⅲ启动子，
如 U6、H1
外源性序
列，紧密
的发夹结
构
脱靶效应，易产生细
胞毒性，干扰内源性
mRNA 通路，不能进行
组织特异性调控，不能
与蛋白基因协同表达
靶点单一，沉默效应强
烈，预测及鉴定容易
优化发夹环
序列、结构
和大小
pSUPER ［5，6，11］
miRNA
载体
内源性 Pol Ⅲ
启动子、Pol Ⅱ
启动子
内源性序
列，无须
严格配对
发夹结构
miRNA 数量有限，异构
序列多，单一序列靶点
多，沉默效应温和，预
测及鉴定难度大
单一序列可同时靶向多
个靶点，不易产生细胞
毒性，安全，可与其他
小 RNA 式蛋白协同表
达，可进行组织特异性
调控
寻找 miRNA
靶点，基因
功能研究
Let-7 ［9，12，13］
amiRNA
载体
Pol Ⅱ启动子，
如 CMV、UbC、
35S
人工合成
序列，非
严格配对
发夹结构
异构序列多，沉默效应
温和，预测及鉴定困难
单一序列靶点单一，不
易产生细胞毒性，安全，
可与其他小 RNA 式蛋
白协同表达，可进行组
织特异性调控
优化发夹环
序列、结构
和大小，开
发新型载体
表达骨架
miR30/miR155 ［14-19］
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.366
（artificial miRNA，amiRNA）的载体化表达［9，10］。
1.2 表达骨架
表达骨架由具有发夹结构（hairpin structure）的
小 RNA 分子模板及侧翼序列（flanking sequence）构
成。其中发夹结构由正义链（sense strand）、反义链
（antisense strand）及连接两部分的套索结构（lariat）
组成，是目的小 RNA 序列能否成功表达的决定性因
素［5，11］。研究发现，通过模拟内源性 miRNA 分子
的骨架结构，能够有效避免外源性目的小 RNA 在体
内表达时所产生的细胞毒性及对内源性 miRNA 通路
的干扰作用［20］，amiRNA 表达骨架则采用此种方法
构建。课题组前期研究亦表明，不同表达骨架对相
同目的小 RNA 序列的表达效率最高可相差 3 个数量
级，同一表达框对不同目的小 RNA 序列的表达效率
最多相差近 150 倍，而且不同种属来源的表达框在
相同宿主中表达效率相差多达 82 倍。这不仅体现了
表达骨架对干扰性小 RNA 表达载体的决定性作用，
更暗示了其与目的小 RNA 序列、宿主起源之间的密
切关系。鉴于此，今后的研究更应注重表达骨架的
结构和进化关系上的问题。
1.3 目的小RNA序列
与常见蛋白基因表达载体不同，干扰性小 RNA
表达载体中的目的序列主要为长约 20 bp 的非编码
序列，其本质是特定 mRNA 分子的反向互补序列。
目前常见的小 RNA 序列主要有 siRNA、amiRNA 和
miRNA 三种，前两种可先借助软件设计获取理论
上的干扰性小 RNA 序列，再通过功能性实验最终
获取目的干扰性小 RNA 序列［14］，而后者主要参考
miRNA 文库（miRNA database），如 miRbase［12，21］。
1.4 辅助元件
成功构建一个干扰性小 RNA 表达载体除了具
有上述主要元件外，还需要其他元件的辅助，如报
告基因（reporter gene）、增强子（enhancer）、终止
子（terminato）等。报告基因是整个实验操作的指
示剂，如绿色荧光蛋白（green fluorescent proteins，
GFP）、增强绿色荧光蛋白（enhance green fluorescent
proteins，EGFP）、β-半 乳 糖 苷 酶（LacZ）、 荧 光 素
酶（fluc）等［5，15］，由于这些报告基因都是近 1 kb
的大片段，目前大多局限应用在 pol II 启动子所在
的干扰性小 RNA 表达载体中。增强子是用来增强启
动子工作效率的顺式作用元件，能有效促进目的小
RNA 的转录，常用的有 SV40［22］、Ago2［8］等。终止
子是小 RNA 序列转录的终止序列，常用的有 TTTTT
（T）序列［23］和 SV40polyA 序列［24］。前者仅限用于
Pol III 启动子所在的干扰性小 RNA 表达载体，而后
者则多见于 Pol II 启动子所在的干扰性小 RNA 表达
载体。
2 发展趋势
第一个干扰性小 RNA 载体 pSUPER 的诞生让人
们看到了干扰性小 RNA 载体化表达的重要性和优越
性［6］。随后，干扰性小 RNA 载体迎来了 5 年的黄金
发展期，各种标志性的干扰性小 RNA 载体相继被报
道［5，17，18］，但近几年却未见革命性突破。目前，人
们根据干扰性小 RNA 载体中表达骨架和目的小 RNA
的不同，将 RNA 表达载体分为短发夹式 RNA 载体
（short hairpin RNA vector，shRNA vector）、 内 源 性
miRNA 载体（miRNA vector）和人工合成 miRNA 载
体（artificial miRNA vector，amiRNA vector）3 大 类
（表 1）。不同类别的载体不仅反映了其自身结构特
性的差异，同时也体现了不同的历史渊源。shRNA
载体作为早期干扰性小 RNA 载体的代表，其衍生产
品早已被广泛应用。而 amiRNA 载体则代表了干扰
性小 RNA 载体发展的第二个重要时期，正日益受到
人们青睐。当然，miRNA 载体作为 amiRNA 载体的
模拟对象，一直是 amiRNA 载体诞生和改进的源泉
与动力。
2.1 shRNA载体
早在 2002 年，研究者将目的 siRNA 序列嵌入
至短发夹式小 RNA 表达骨架中，成功实现了干扰性
小 RNA 的载体化表达，构建了第一个 shRNA 表达
载体［5］。shRNA 表达载体的诞生开启了 RNAi 载体
化的先河，给小 RNA 的表达带来了一个全新的突破。
因此，shRNA 载体亦被称为第一代干扰性小 RNA 表
达载体。
shRNA 载体的表达骨架由两段反向互补排列的
核苷酸序列及一小段用于形成茎环结构的间区组成，
能转录产生一个具有紧密发夹环（tight hairpin turn）
结构的 RNA 序列。随后，转录产物流向 siRNA 发
2015,31(3) 67侯莹等：从功能部件看小干扰 RNA表达载体的发展
生途径，在胞内 Dicer 酶的作用下直接加工成目的
siRNA，发挥特异性抑制靶基因的作用，因此能产
生高效率的基因沉默现象［5］。与传统的化学合成型
siRNA 相比，shRNA 表达载体时效性更长，成本更
低，较少量的 shRNA 表达载体即可产生良好的抑制
效果（表 1），被广泛应用于个体及系统性基因调控
研究和 RNAi 文库（RNAi library）的建设。
由 于 shRNA 载 体 主 要 采 用 Pol III 启 动 子 和
TTTTT（T）终止子进行目的小 RNA 序列的转录，
不能进行组织特异性调控，也不宜携带报告基因或
其他功能性基因，这很大程度的影响了其在现代基
因治疗中的应用前景（表 1）。同时，随着研究的深入，
shRNA 载体的其他诸多缺陷也开始引起人们的重视，
如存在脱靶效应［17］、易产生细胞毒性和干扰内源性
miRNA 通路［21，25］等问题（表 1）。鉴于此，后续的
研究主要集中在载体结构优化上，以期实现 shRNA
载体高效、安全、特异性表达。Schopman 等［11］通
过优化载体中发夹环的序列、结构和大小，成功设
计了靶向 HIV-1 基因的高效 shRNA 表达载体，使对
靶基因的抑制率提高到原来的 7 倍 ；Chumakov 等［26］
在优化茎环结构的基础上同时实现了多目的小 RNA
序列的串联表达，并采用不同种 Pol Ⅲ启动子分别
调节，大大提高了 siRNA 的表达率及对靶基因的抑
制率。
2.2 miRNA载体
miRNA 表达载体作为一类高效、低毒的表达
载体，主要通过 Pol II 或 Pol Ⅲ启动子完成内源性
miRNA 序列及其表达框的转录，形成的 miRNA 原
始 转 录 本（pri-miRNA） 在 核 内 经 Drosha 酶 形 成
miRNA 前体（pre-miRNA），出核后在胞质 Dicer 酶
作用下形成成熟 miRNA，发挥基因调控作用。但目
前亦已发现存在不依赖于 Dicer 加工而直接由 AGO2
完成加工和功能链选择 的 miRNA（miR-451），且
与恶性肿瘤的发生密切相关［27］。miRNA 载体的研
究主要集中于其携带的 miRNA 与疾病发生的关系，
而非载体自身，是研究疾病发病机制的有力手段。
Liang 等［9］ 以 miR-26a 为基础构建了 pHsa-miR-26a
表达载体，并成功转染至人肝癌细胞，为进一步研
究 miR-26a 在肝癌发生发展过程中的作用提供了有
力手段 ；Yang 等［13］以同样方法构建了 miRNA-218
表达载体，为抑制乳腺癌的转移提供了一种新的治
疗策略。
2.3 amiRNA载体
在意识到 shRNA 载体可能存在内源性差的问题
之后，Zeng 等［17］尝试以人源 miR-30a 原始转录本
（pri-hsa-miR-30a）为小 RNA 表达骨架，成功构建
了能模拟内源性 mRNA 通路的干扰性小 RNA 载体，
即 amiRNA 载体，第二代干扰性小 RNA 表达载体由
此诞生。随后，Chung 等［18］又以鼠 miR-155 原始转
录 本（pri-mmu-miR-155） 为 小 RNA 表 达 骨 架， 同
样实现了目的小 RNA 分子长效、安全、可控性表达。
目 前， 以 pri-hsa-miR-30a 和 pri-mmu-miR-155 为 小
RNA 表达骨架的 amiRNA 载体是唯一被广泛认可和
商业化的载体［28，29］。
amiRNA 载体的表达框是由内源性 miRNA 前体
衍生而来，长度远大于 shRNA 载体的表达框，因此
采用 Pol II 启动子来完成其转录，转录产物在体内
产生一个无须严格配对的茎环结构，随后在核内由
Drosha 酶作用转化为 amiRNA 前体（Pre-amiRNA），
出核后在 Dicer 酶的作用下加工为成熟的 amiRNA，
发挥靶基因调控作用［26］。由于该过程模拟了内源
性 miRNA 的发生途径［30］，因此与第一代干扰性小
RNA 载体相比，amiRNA 载体具有组织特异性强、
时间及沉默水平可控性好、毒性低、综合沉默途径
效果佳等优点（表 1），广泛用于基因功能研究和
RNAi 文库建设，是干扰性小 RNA 载体的未来发展
趋势。
由于 amiRNA 载体在体内采用与内源性 miRNA
相同的发生通路，产生大量的异构小 RNA 序列（Iso-
RNA）在所难免，存在靶点多、预测难、作用温和的
缺点，不利于靶向性和个体化治疗研究（表 1）。鉴
于 amiRNA 载体在基因治疗中潜力的凸显，围绕如
何提高 amiRNA 靶向性、表达效率及扩充载体使用
范围的研究日益增多，期望建立更为高效、经济、
适用范围更广的 amiRNA 载体。有研究者在商品化
表达载体的基础上，对 miRNA-30 或 miRNA-155 前
体结构进行改造，通过更换茎环结构保守区域的
碱基，设计错配结构，改变限制性酶切位点等手
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.368
段，以探究不同小干扰 RNA 分子二级结构对沉默
效果的影响，以期望构建一个高效率的 amiRNA 载
体［10，31］。Hu 等［15］通过对表达骨架结构的成功改
造，实现了单启动子操控多基因串联表达并同时沉
默多个靶基因的目的，该方法经济高效，为 amiRNA
载体的构建提供了一种新的思路。在意识到 amiRNA
表达骨架具有明显的种属特异性及进化保守性后，
研究者开始了不同物种及进化关系的 miRNA 前体的
研究，陆续开发出以鼠 miRNA-21 原始转录本（pri-
mmu-miR-21）［19］、鸡 miRNA-126 原始转录本（pri-gga-
miR-126）［32］及植物源的 miRNA 的原始转录本［7，33］
为表达骨架的载体，均实现了目的小 RNA 的成功表
达和靶基因沉默。不同种属 miRNA 原始转录本的成
功开发，扩宽了 amiRNA 表达载体的应用范围，加
快了 RNAi 基因药物的研发进程。
3 结语
RNAi 干扰技术发展至今已成为较为成熟且应用
最为普遍的基因调控策略，在基因治疗领域拥有较
好的前景。但值得注意，风险与优势并存。shRNA
载体潜在的脱靶效应及细胞毒性、amiRNA 载体的
表达效率及种属特异性等问题都极大限制了小干扰
RNA 表达载体的临床应用进程。课题组前期研究
亦发现，现有的商品化载体对某些小 RNA 序列不
仅表达效率低下，而且忠诚度不高。最近我们通过
生物信息学、文库筛查、结构突变等方式已经获得
了一种表达效率比市售商品高 9 倍的 amiRNA 载体
（HD7），目前正在对 HD7 进行通用性和安全性的
研究。
未来，相信随着对 RNAi 发生过程的进一步认
识，会增强小干扰 RNA 表达载体的沉默效果并弱
化脱靶效应，构建全基因组功能确认的 RNAi 文库，
并靶向潜在的药物靶点，为基因治疗奠定基础。针
对于此，未来的发展应侧重以下几个方面 ：（1）载
体表达框的设计与优化，完善序列设计策略与工具，
构建表达骨架与目的小 RNA 匹配程度较高的表达
框，实现表达骨架、目的序列及受体细胞三者之间
的完美匹配；（2）增强递送系统与表达系统的特异性，
针对不同系统进行化学修饰，提高递送系统的靶向
性，或开发新的递送系统和表达系统，增强表达载
体的适用范围 ；（3）多种技术综合应用，如锌指核
酸酶（ZFNs）、单倍体细胞插入诱变、成簇的规律
间隔的回文重复序列（CRISPR）等技术将会互补基
因沉默手段，扩展了解和解决人类疾病的使用工具，
更好地促进人类基因组学的研究。
参 考 文 献
［1］ Wheeler LA, Vrbanac V, Trifonova R, et al. Durable knockdown
and protection from HIV transmission in humanized mice treated
with gel-formulated CD4 aptamer-siRNA chimeras［J］. Mol Ther,
2013, 21（7）：1378-1389.
［2］ Li Y, Lu J, Han Y, et al. RNA interference functions as an antiviral
immunity mechanism in mammals［J］. Science, 2013, 342（6155）：
231-234.
［3］ Dow LE, Premsrirut PK, Zuber J, et al. A pipeline for the generation
of shRNA transgenic mice［J］. Nat Protoc, 2012, 7（2）：374-
393.
［4］ Wu CS, Yen CJ, Chou RH, et al. Downregulation of microRNA-15b
by hepatitis B virus X enhances hepatocellular carcinoma prolifera-
tion via fucosyltransferase 2-induced Globo H expression［J］. Int J
Cancer, 2014, 134（7）：1638-1647.
［5］ Brummelkamp TR, Bernards R, Agami R. A system for stable
expression of short interfering RNAs in mammalian cells［J］.
Science, 2002, 296（5567）：550-553.
［6］ Moffat J, Grueneberg DA, Yang X, et al. A lentiviral RNAi library
for human and mouse genes applied to an arrayed viral high-content
screen［J］. Cell, 2006, 124（6）：1283-1298.
［7］ Yan F, Lu Y, Wu G, et al. A simplified method for constructing
artificial microRNAs based on the osa-MIR528 precursor［J］. J
Biotechnol, 2012, 160（3）：146-150.
［8］ Diederichs S, Jung S, Rothenberg SM, et al. Coexpression of
Argonaute-2 enhances RNA interference toward perfect match
binding sites［J］. Proc Natl Acad Sci USA, 2008, 105（27）：
9284-9289.
［9］ Liang G, Chen S, Zhu Y, et al. Construction of miRNA eukaryotic
expression vector and its stable expression in human liver cancer
cells［J］. Procedia Environ Sci, 2011, 8 ：451-456.
［10］ Wu P, Wilmarth MA, Zhang F, et al. miRNA and shRNA
expression vectors based on mRNA and miRNA processing［J］.
Methods Mol Biol, 2013, 936 ：195-207.
2015,31(3) 69侯莹等：从功能部件看小干扰 RNA表达载体的发展
［11］ Schopman NC, Liu YP, Konstantinova P, et al. Optimization of
shRNA inhibitors by variation of the terminal loop sequence［J］.
Antiviral Res, 2010, 86（2）：204-211.
［12］ Wang CM, Wang Y, Fan CG, et al. miR-29c targets TNFAIP3,
inhibits cell proliferation and induces apoptosis in hepatitis B
virus-related hepatocellular carcinoma［J］. Biochem Biophys Res
Commun, 2011, 411（3）：586-592.
［13］ Yang L, Li Q, Wang Q, et al. Silencing of miRNA-218 promotes
migration and invasion of breast cancer via Slit2-Robo1
pathway［J］. Biomed Pharmacother, 2012, 66（7）：535-540.
［14］ Baek MN, Jung KH, Halder D, et al. Artificial microRNA-based
neurokinin-1 receptor gene silencing reduces alcohol consumption
in mice［J］. Neurosci Lett, 2010, 475（3）：124-128.
［15］ Hu T, Fu Q, Chen P, et al. Construction of an artificial MicroRNA
expression vector for simultaneous inhibition of multiple genes in
mammalian cells［J］. Int J Mol Sci, 2009, 10（5）：2158-2168.
［16］ Wu J, Bonsra AN, Du G. pSM155 and pSM30 vectors for miRNA
and shRNA expression［J］. Methods Mol Biol, 2009, 487（2）：
205-219.
［17］ Zeng Y, Wagner EJ, Cullen BR. Both natural and designed micro
RNAs can inhibit the expression of cognate mRNAs when expressed
in human cells［J］. Mol Cell, 2002, 9（6）：1327-1333.
［18］ Chung KH, Hart CC, Al-Bassam S, et al. Polycistronic RNA
polymerase II expression vectors for RNA interference based on
BIC/miR-155［J］. Nucleic Acids Res, 2006, 34（7）：e53.
［19］ Yue J, Sheng Y, Ren A, et al. A miR-21 hairpin structure-based
gene knockdown vector［J］. Biochem Biophys Res Commun,
2010, 394（3）：667-672.
［20］ Boudreau RL, Monteys AM, Davidson BL. Minimizing variables
among hairpin-based RNAi vectors reveals the potency of
shRNAs［J］. RNA, 2008, 14（9）：1834-1844.
［21］ Kozomara A, Griffiths-Jones S. miRBase ：integrating microRNA
annotation and deep-sequencing data［J］. Nucleic Acids Res,
2011, 39（suppl 1）：D152-D157.
［22］ Shibata A, Iwaki A, Fukumaki Y. A novel expression system for
artificial miRNAs containing no endogenous miRNA precursor
sequences［J］. J RNAi Gene Silencing, 2007, 3（1）：237-237.
［23］ Schopman NC, Liu YP, Konstantinova P, et al. Optimization of
shRNA inhibitors by variation of the terminal loop sequence［J］.
Antiviral Res, 2010, 86（2）：204-211.
［24］ Liu C, Zhang L, Sun J, et al. The artificial microRNA mediates
GUS-GFP gene silencing using ath-miR169d precursor as
backbone［J］. Life Sci J, 2009, 6（2）：1-7.
［25］ van Gestel MA, van Erp S, Sanders LE, et al. shRNA-induced
saturation of the microRNA pathway in the rat brain［J］. Gene
Ther, 2014, 21（2）：205-211.
［26］ Chumakov SP, Kravchenko JE, Prassolov VS, et al. Efficient
downregulation of multiple mRNA targets with a single shRNA-
expressing lentiviral vector［J］. Plasmid, 2010, 63（3）：143-
149.
［27］ Cifuentes D, Xue H, Taylor DW, et al. A novel miRNA processing
pathway independent of Dicer requires Argonaute2 catalytic
activity［J］. Science, 2010, 328（5986）：1694-1698.
［28］ Carrasquillo R, Tian D, Krishna S, et al. SNF8, a member of the
ESCRT-II complex, interacts with TRPC6 and enhances its channel
activity［J］. BMC Cell Biology, 2012, 13（1）：33-44.
［29］ Pu C, Wang L, Miao X, et al. Optimized Tandem amLRNA Mediates
Stronger Inhibitory Effects on Hepatitis B Virus Infection［J］. J
Gastrointestin Liver Dis, 2011, 20（3）：271-278.
［30］ Yan H, Deng X, Cao Y, et al. A novel approach for the construction
of plant amiRNA expression vectors［J］. J Biotechnol, 2011, 151
（1）：9-14.
［31］ Fellmann C, Hoffmann T, Sridhar V, et al. An optimized microRNA
backbone for effective single-copy RNAi［J］. Cell Rep, 2013, 5
（6）：1704-1713.
［32］ Chen SCY, Stern P, Guo Z, et al. Expression of multiple
artificial microRNAs from a chicken miRNA126-based lentiviral
vector［J］. PLoS One, 2011, 6（7）：e22437.
［33］ Bhagwat B, Chi M, Su L, et al. An in vivo transient expression
system can be applied for rapid and effective selection of artificial
microRNA constructs for plant stable genetic transformation［J］.
J Genet Genomics, 2013, 40（5）：261-270.
（责任编辑 狄艳红）