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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第3期
收稿日期 : 2011-08-17
基金项目 : 国家自然科学基金项目（30872221）, 广东省关键领域重大项目［粤科计字（2005）162 号］
作者简介 : 欧阳敏 , 女 , 硕士研究生 , 研究方向 : 微生物与生化药学 ; E-mail: greetings28@163.com
通讯作者 : 孙晗笑 , 女 , 教授 , 博士生导师 , 研究方向 : 微生物与生化药学 ; E-mail: sunhx718@yahoo.com.cn
一株脂肪酶产生菌的筛选及产酶条件优化研究
欧阳敏 孙晗笑 莫雪梅 李秀英 张光
（暨南大学药学院基因组药物研究所，广州 510632）
摘 要： 通过利用溴甲酚紫显色培养基初筛和酶活测定法复筛得到产脂肪酶的一株细菌 HP2，经形态学观察和生理生化测
定初步鉴定该菌株为不动杆菌属。并对该菌株的摇床培养产酶条件进行了初步研究，采用正交试验对 HP2菌株发酵产脂肪酶的条
件进行了优化，得到最佳发酵条件为初始 pH为 7.7，培养温度为 35℃，接种量（V/V）为 1.5%，发酵周期为 48 h，酶活力达到
129.7 U/mL。
关键词： 脂肪酶 不动杆菌属 筛选 发酵 正交设计
Screening of Lipase Production Bacteria and Optimization of
the Lipase Production
Ouyang Min Sun Hanxiao Mo Xuemei Li Xiuying Zhang Guang
（Institute of Genomic Medicine，College of Pharmacy，Jinan University，Guangzhou 510632）
Abstract: HP2 was obtained from oil-strained soil sample by the color agar plate method and colorimetric analysis. By morphological
observation, physiological and biochemical identification, it is a lipase producing bacteria belongs to Acinetobacter. The fermentation conditions
of a lipase from HP2 were determined by the single-factor experiment and orthogonal design. The optimum fermentation conditions for enzyme
production were as follows, initial pH value as 7.7, fermentation temperature at 35℃, inoculum concentration 1.5%, and fermentation time 2
days. In the conditions, the lipase activity will reached 129.7 U/mL.
Key words: Lipase Acinetobacter Screening Fermentation Orthogonal design
脂肪酶（酰基甘油水解酶，E.C. 3.1.1.3）是
一种广泛分布于动物、植物和微生物中的酶，能
够进行可逆的甘油酯键水解，因此也能够进行甘油
酯合成［1］。脂肪酶是一类具有多种催化能力的酶，
可以催化三酰甘油酯及其他一些水不溶性酯类的
水解、醇解、酯化、转酯化及酯类的逆向合成反应，
除此之外还表现出其他一些酶的活性，如磷脂酶、
胆固醇酯酶、酰肽水解酶活性等［2］。脂肪酶不同
活性的发挥依赖于反应体系的特点，如在油水界面
促进酯水解，而在有机相中可以酶促合成和酯交
换。脂肪酶的催化特性在于在油水界面上其催化
活力最大，早在 1958 年 Sarda 和 Desnnelv 就发现
了这一现象。溶于水的酶作用于不溶于水的底物，
反应是在两个彼此分离的完全不同的相的界面上
进行，这是脂肪酶区别于酯酶的一个特征。脂肪酶
广泛存在于动物、植物和微生物中，是重要的工业
酶制剂品种之一，可以催化解脂、酯交换、酯合成
等多种化学反应，在轻工、化工、食品、医药、纺织、
生物能源和环保等行业有广泛的应用［2-5］。正因为
脂肪酶具有良好的醇解、胺解、酯化和转酯等特
性，可被用于有机合成、药物中间体合成、手性化
合物拆分等领域［6］。酶法拆分具有反应条件温和、
高度选择性、产物纯度高副反应少、环境污染小等
优点。近年手性技术主要用于药物中间体的制备。
手性技术通常是对化学合成路线中某个手性中间
体进行不对称合成或拆分，再合成单一手性药物。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第3期112
在有机相中，脂肪酶催化消旋体的拆分，为制备单
异构体手性药物提供了重要的技术手段［7］。脂肪
酶虽然已经用于多种手性药物的制备但目前获得
脂肪酶的成本较高，所以寻找一株适用的微生物脂
肪酶产生菌，可为我国手性药物的产业化创造良好
的应用前景。
在自然界中，脂肪酶主要存在于动物胰脏、植
物种子和微生物当中。由于微生物脂肪酶种类多、
来源广、周期短，具有比动物脂肪酶广的 pH、作用
温度范围以及对底物的专一性，所以比动植物脂肪
酶在酶理论研究和实际应用中更为重要［9］。在微生
物界中细菌大约有 28 个属，放线菌 4 个属，酵母菌
10 个属，其他真菌 23 个属，共计 65 个属的微生物
能产脂肪酶，但产酶量高的菌株却不多［10］。而细菌
脂肪酶一般为碱性，某些细菌还能耐高温，具有广
泛的温度及 pH 适应性，适合用于大规模工业生产
的要求。本研究的目的是大量的筛选工作得到产脂
肪酶的菌株，并从中挑选出一株高产脂肪酶的菌株
进行后续的发酵优化研究，为今后生产上的应用打
下一定的基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 分离样品 来自于河南山区油污土壤共 460
株菌株。
1.1.2 培养基 平板筛选培养基（g/L）：橄榄油乳
化液 100，（NH4）2SO4 1，K2HPO4 1，KCl 0.5，NaCl 1，
MgSO4·7H2O 0.5，FeSO4 0.1，1.6% 溴甲酚紫 1，琼
脂 15，pH 6.5-7.0。摇瓶复筛培养基（g/L）：橄榄油
30，蔗糖 60，豆饼粉 20，K2HPO4 3，MgSO4·7H2O 0.2，
KCl 0.5，（NH4） 2SO45，pH7.0-7.2。种子液培养基（g/L）：
胰蛋白胨 10，酵母提取物 5，NaCl 10，pH7.0。发
酵培养基（g/L）：蔗糖 60，豆饼粉 20，KH2PO4 3，
MgSO4·7H2O 2，KCl 0.5，（NH4） 2SO45 ；橄榄油 30
mL/L，pH7.0-7.2。
1.2 方法
1.2.1 脂肪酶产生菌的筛选 脂肪酶产生菌的初筛：
按 2% 聚乙烯醇 ：橄榄油为 3 1 的比例混匀后用高
速匀浆分散机分散 5 次，每次 1 min，制成乳白色的
橄榄油乳化液 ；配制培养基。
在橄榄油平板上接种待测菌株，28℃培养 72 h
观察菌落周围有无黄色的水解圈。挑取变色圈直径
与菌落直径之比（Hc）大于 1.5 的菌落进行复筛，
共筛选到胞外脂肪酶活力较高的菌株 7 株。
脂肪酶产生菌的复筛 ：挑取变色圈直径与菌落
直径之比大的菌落进行摇瓶培养测酶活。 具体方法
如下 ：挑取培养成熟的菌种于液体种子培养基中，
28℃，150 r/min 条件下振荡培养 24 h，按 5%（V/V）
的接种量接入发酵培养基中继续振荡培养 72 h。离
心后测定发酵上清液中脂肪酶活力，进一步确定高
产菌株。
取一定量的发酵液到离心管中4℃，4 000 r/min
条件下离心 15 min，取上清液即为粗酶液进行酶活
测定。测定方法参照文献［11］提供的铜皂法，以橄
榄油为底物运用紫外分光光度计进行测定。脂肪酶
酶活力单位定义为 ：在一定条件下每分钟催化水解
脂肪产生 1 μmol 脂肪酸所需的酶量定义为一个脂肪
酶活力单位（U）。酶活计算公式：X=（CV）/tv；式中：
X 为脂肪酶活力（U/mL）；C 为脂肪酸浓度（μmol/mL）；
V 为脂肪酸溶液的体积（mL）；v 为酶液的用量（mL）；
t 为作用时间（min）。
1.2.2 菌株的形态学鉴定及生理生化特征 观察菌
株 HP2 在平板培养基上的菌落形态和光学显微镜
下革兰氏染色后的菌体形态。生化生理测定参考文
献［12］和［13］所叙述的方法进行。
1.2.3 脂肪酶菌株的发酵优化试验 单因素试验 :
培养方法与 1.2.1 相同，替换不同的条件，如培养温
度、接种量、种龄、起始 pH 值、装量等，分别考
察其对产酶的影响。每处理重复 5 次。
正交优化试验 : 在单因素试验基础上，选取初
始 pH、培养温度、接种量、发酵周期 4 因素为考察
对象，每因素选取 3 个水平，按 L9（34）正交表安
排试验。因素水平见表 1。
表 1 L9（34）因素水平
水平
因素
A. 培养温度（℃） B. 起始pH C. 接种量（%） D. 发酵周期（h）
1 30.0 7.1 1.5 24
2 35.0 7.4 2.5 48
3 40.0 7.7 3.5 72
2012年第3期 113欧阳敏等 ：一株脂肪酶产生菌的筛选及产酶条件优化研究
2 结果
2.1 铜皂法标准曲线
酶活力测定方法用的是铜皂法，以橄榄油为底
物，用甲苯终止酶反应后萃取生成的脂肪酸，并用
醋酸铜显色，通过铜皂的吸光度来测定生成的脂肪
酸的量，从而得到脂肪酶的活力。本试验经油酸标
准溶液比色后，测得 710 nm 下的 OD 值（x）与油
酸浓度（y：nmol/mL）进行线性回归，得到油酸标
准曲线方程结果为 ：y = 2.01x - 0.0599，R2 = 0.9992。
相关系数很显著，表明油酸标准溶液浓度与消光值
呈直线关系，通过直线方程可以进一步测得脂肪酶
酶活力。
2.2 脂肪酶产生菌筛选结果
对 460 株菌株进行初筛后得到 126 株产脂肪酶
菌株。再挑取变色圈直径与菌落直径之比（Hc）大
于 1.5 的 38 株菌落进行复筛，共筛选到胞外脂肪酶
活力较高的菌株 7 株。结果见表 2。从表 2 可知，
根据变色圈直径与菌落直径之比值的大小，筛选出
2.3 菌种形态学特征
对该菌株 HP2 进行平板培养菌落形态观察和革
兰氏染色光镜下观察，结果见图 1。 该菌为革兰氏
阴性球状菌，单个或双个排列。菌株 28℃ 24 h 在琼
脂培养基上形成直径约 1-2 mm、圆形、边缘整齐、
隆起、表面光滑、湿润有粘性的淡黄色不透明菌落。
上述这些结果与不动杆菌属特征相符。
表 2 脂肪酶产生菌筛选结果
菌株 Hc 酶活（U/mL）
HN-1 1.7 54.3
HN-2 2.3 53.6
MD-4 1.85 62.5
HP-2 2.51 70.7
GNY-2 1.9 52.6
GNW-8 2.47 69.1
GNW-21 1.69 45.9
7 株酶活较高的菌株。经摇瓶发酵复筛后，确定命
名为 HP2 的菌株作为后续试验研究菌株。
2.4 部分生理生化性质测定结果
试验菌株 HP2 为专性需氧菌，在麦康凯平板生
长良好，菌落无色或淡粉红色，48 h 后呈深红色。
双糖铁培养基（KIA）底层及斜面均不变色，氧化酶、
硝酸盐还原试验、动力试验呈阴性，鉴于这 3 项试
验均为阴性者在革兰阴性杆菌中极为罕见，可初步
确定为 HP2 为不动杆菌属的细菌。
同时结合形态学观察和其他生理生化特征（表
3）综合考察，初步确定菌株 HP2 具有典型的不动
杆菌属（Acinetobacter）的特征，所以把 HP2 确定为
不动杆菌属细菌。
2.5 发酵条件对菌株HP2的脂肪酶活力的影响
2.5.1 发酵温度对菌株 HP2 的脂肪酶活力的影
响 将接种后的三角瓶分别置于 20℃、25℃、30℃、
35℃、40℃、45℃的恒温振荡培养箱中振荡培养 72 h，
测定酶活。图 2 表明，随着培养温度的升高，脂肪
酶的活力增大。到 35℃时，脂肪酶活力最大，超过
35℃，酶活下降。因此，适宜的产酶温度为 35℃。
2.5.2 起始 pH 值对菌株 HP2 的脂肪酶活力的影
响 调节发酵培养基的起始 pH 值分别为 6.5、6.8、
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第3期114
7.1、7.4、7.7、8.0，其他条件不变，测定酶活。图
3 结果表明，培养基起始 pH 值为 7.7 左右时，脂肪
酶活力最大。说明脂肪酶产生菌 HP2 在中性偏碱条
件下有利于脂肪酶的合成和分泌。
2.5.3 接种量对菌株 HP2 的脂肪酶活力的影响 改
变接种量，分别考察 1.5%、2.5%、3.5%、4.5%、5.5%
对脂肪酶活力的影响。从图4可见，当接种量为2.5%
时，脂肪酶活力达 88.9 U/mL。当接种量超过 2.5%，
酶活下降明显。
表 3 菌株 HP2部分生理生化特性
项目 结果 项目 结果
葡萄糖产酸 + 氧化酶 _
接触酶 + 脲酶 +
葡萄糖产气 + 吲哚 _
精氨酸双水解酶 + 动力 _
鸟氨酸脱羧酶 + 硝酸盐还原 _
苯丙氨酸脱氨酶 + 硫化氢 +
丙二酸盐利用 + 乳糖 +
溶血 _ 麦芽糖 +
液化明胶 _ 甘露醇 _
30℃ + 蔗糖 +
37℃ + 木糖 _
42℃ _ 枸橼酸盐利用 +
+. 阳性，-. 阴性
图 2 发酵温度对脂肪酶酶活力的影响
图 3 起始 pH值对脂肪酶酶活力的影响
图 4 接种量对脂肪酶酶活力的影响
2.5.4 种龄对菌株 HP2 的脂肪酶活力的影响 在发
酵培养基中分别接入 2.5% 培养 6、12、18、24 及
30 h 的液体种子，35℃，150 r/min 的条件下振荡培
养 72 h，测定酶活。图 5 结果显示，接种种龄在 18 h，
脂肪酶活力达 94.6 U/mL。
图 5 种龄对脂肪酶酶活力的影响
2.5.5 装液量对菌株 HP2 的脂肪酶活力的影响 在
250 mL 三角瓶中分别装入 40 、60 、80、100 和
120 mL 液体发酵培养基，其他条件不变情况下振荡
培养 72 h，测定酶活。图 6 结果表明，随着装液量
的增加，脂肪酶活力增加，当装液量为 100 mL 时，
脂肪酶活力达 92.3 U/mL。但装液量增加，脂肪酶活
力显著下降。因此，合适的装液量为 100 mL/250 mL
三角瓶。
2012年第3期 115欧阳敏等 ：一株脂肪酶产生菌的筛选及产酶条件优化研究
2.5.6 发酵周期对菌株 HP2 的脂肪酶活力的影响
将三角瓶置于以上最适温度、起始 pH 值、接种量、
装液量、菌龄等条件下振荡培养，分别于 24、48、
72、96 和 120 h 取样测定酶活。图 7 表明，发酵周
期为 72 h 时，脂肪酶活力最大，达 102.5 U/mL。
图 6 装液量对脂肪酶酶活力的影响
图 7 发酵周期对脂肪酶酶活力的影响
2.6 正交试验结果
在单因素试验的基础上，选用培养温度、起始
pH 值、接种量和发酵时间作为考察的 4 个因素，分
别选取 3 个水平，以脂肪酶活力为考察指标。结果
见下表 3。根据发酵条件正交试验设计，通过对发
酵结果分析，得知在发酵过程中影响因素最大的是
发酵周期，其次为起始 pH 值。最佳发酵条件组合
是 A2B3C1D2，即初始 pH 为 7.7，培养温度为 35℃，
接种量1.5%，发酵周期48 h，酶活力达到121.3 U/mL。
按以上试验得到的最佳发酵工艺条件发酵验证 5 批，
每批次 5 次重复，测得平均菌株 HP2 的脂肪酶活力
3 讨论
脂肪酶可以催化油脂的选择性水解及其他的酯
类的转酯、氨解等反应，是一种重要的工业用酶，
被广泛应用于油脂水解、食品风味的改进、医疗医药、
皮革绢纺脱脂、低等油脂的改性等［14］。近年来还大
量用作生物柴油制备过程中的催化剂，酶法生产生
物柴油技术具有产物提取简单、反应条件温和、甘
油容易回收和无废物产生等优点［15, 16］。另外，Han
Soojin 等［17］发现不动杆菌属的细菌所产的胞外脂肪
酶具有甲醇耐受性，而对乙醇则不耐受。这一点使
该菌脂肪酶在用于酯化反应生产生物柴油方面具有
一定的应用潜力。
虽然微生物发酵生产的水平取决于生产菌种的
性能，但有了优良的菌种之后还必须研究生产菌的
最佳发酵条件。优化产酶条件以提高酶产量、压缩
生产成本在工业上具有重要意义［18］。但用于生产的
菌株都必须优化其培养条件，并且须经过中试矫正
之后才能投入工业生产。目前用于发酵条件优化的
试验设计有单因素试验、逐因子试验、正交设计及
表 3 正交试验结果及结果分析
试验号 因素 脂肪酶酶活力（U/mL）A B C D
1 1 1 1 1 32.8
2 1 2 2 2 61.4
3 1 3 3 3 53.9
4 2 1 2 3 66.7
5 2 2 3 1 28.4
6 2 3 1 2 121.3
7 3 1 3 2 79.5
8 3 2 1 3 54.6
9 3 3 2 1 71.3
K1 148.1 179.0 208.7 132.5
K2 216.4 144.4 199.4 262.2
K3 205.4 246.5 161.8 175.2
k1 49.4 59.7 69.6 44.2
k2 72.1 48.1 66.5 87.4
k3 68.5 82.2 53.9 58.4
R 22.7 34.1 15.7 43.2
为 129.7 U/mL。验证结果与正交试验结果一致，说
明工艺稳定可行。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第3期116
均匀设计、响应面法（RSM）等。正交设计、均匀
设计是在多因素多水平情况下用于优化反应条件的
试验设计方法，其中正交设计应用的最为广泛。正
交设计利用一套规格化的表格，可从许多因素中选
出主要因素及其最优水平。而所谓单因素试验即在
不考虑其他影响因素的前提下，单独考虑某一种因
素对菌株发酵结果的影响。本研究的单因素发酵试
验是从培养温度、接种量、种龄、起始 pH 值和装
液量等分别考察其对 HP2 产酶的影响。除了选择的
温度和 pH 要适宜菌体生长外，适当的菌龄也十分
重要。一般接种种龄以对数生长期的后期较为适宜，
太年轻的种子接种后往往会出现发酵前期菌体生长
缓慢，延长发酵周期 ；过老的种子虽然菌量较多，
但接种后菌体会过早自溶，导致生产能力下降。发
酵时选择的接种量也很关键，因为接种量过大，导
致发酵前期菌体量过大和营养物质消耗过快 ；在不
补加营养的情况下，到酶合成期，菌体会由于营养
物质不够而影响酶的合成和分泌。另外，在恒定转
速条件下，装液量的多少主要影响液体发酵培养基
中氧气的溶解量。不同的微生物、不同的生长阶段
对氧气的需求不同，在发酵过程中并不是维持溶氧
越高越好。即使是专性好氧菌，过高的溶氧对生长
和代谢也可能不利。
4 结论
本研究利用平板筛选法从筛选出 7 株产脂肪酶
细菌，进一步测其摇瓶发酵脂肪酶活力，选出一株
脂肪酶活力最高的菌株 HP2，通过细菌形态和生理
生化特性初步确定其为不动杆菌属。另外对 HP2 产
脂肪酶进行了摇瓶发酵优化，通过正交设计优化得
到 HP2 最佳发酵条件为初始 pH 为 7.7，培养温度为
35℃，接种量（V/V）为 1.5% ，发酵周期 48 h，脂
肪酶活力达到 129.7 U/mL。使在优化后 HP2 产脂肪
酶的酶活力提高了近一倍。
参 考 文 献
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（责任编辑 李楠）