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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第7期
葡萄糖淀粉酶（Glucoamylase EC3.2.1.3）又称 γ
淀粉酶（γ-amylase）或淀粉葡萄糖苷酶（Amylogluc-
osidase），简称糖化酶（缩写 GA 或 G），是世界上应
用范围最广、最重要的工业酶制剂之一［1］。随着世
界经济的发展，能源短缺问题日益突出，可再生能
源的开发利用问题受到高度重视。而糖化酶作为生
产燃料乙醇必须的生物催化剂，在国际国内市场上
的需求量大幅度上升，具有广阔的市场前景。然而，
近 30 年来，糖化酶生产几乎成为一个被遗忘的角落，
很少人继续从事这一课题的研究，致使菌种退化，
产量下降，技术水平停滞不前。因此，开展糖化酶
生产技术研究，选育优良菌株，革新生产工艺，已
收稿日期 ：2013-02-05
基金项目 ：玉米精深加工催化剂研发与产业化示范应用，吉林省重大攻关项目 （2012ZDGG005）
作者简介 ：张文丽，女，硕士研究生，研究方向 ：发酵工程 ；E-mail ：zhangwenli1863@126.com
通讯作者 ：胡耀辉，男，教授，博士生导师，研究方向 ：传统豆制品加工 ；E-mail ：huyaohui@vip.163.com
一株高产糖化酶生产菌的筛选与鉴定
张文丽1  于寒松1，2  朴春红1  胡鑫3  王舒婷1  胡耀辉1，2
（1. 吉林农业大学食品科学与工程学院，长春 130118 ；2. 国家大豆产业技术研发中心加工研究室，长春 130118 ；3. 吉林大学，长春 130118）
摘 要： 从吉林某豆制品加工厂污水排放口处的土样中，采用稀释平板法从中分离筛选得到一株高产糖化酶菌株 ZWL-1（18S
rDNA 基因的 GenBank 登录号 ：KC433410）。在进行形态观察的基础上，结合 18S rDNA 序列分析并建立系统发育树进一步对该菌
进行了种类鉴定。18S rDNA 序列分析表明，菌株 ZWL-1 与黑曲霉（Aspergillus niger）的 18S rDNA 的同源性均在 99.0% 以上 ；从构
建的系统进化树中可以看出，ZWL-1 与 Aspergillus sp. LQ21 共同构成一个分支，并与黑曲霉（Aspergillus niger strain CS1-1）聚成一
大支，最终确定该菌株为黑曲霉。
关键词 ： 18S rDNA 筛选 鉴定 黑曲霉 糖化酶
Screening and Identification of a High-yield Glucoamylase Bacteria
Zhang Wenli1 Yu Hansong1，2 Piao Chunhong1 Hu Xin3 Wang Shuting1 Hu Yaohui1，2
（1. College of Food Science and Technology，Jilin Agricultural University，Changchun 130118 ；2. National Soybean Industrial Technology R
& D Center Processing Laboratory，Changchun 130118 ；3. Jilin University，Changchun 130118）
Abstract:  An high-yield glucoamylase bacterial strain of ZWL-1（GenBank accession number of the 18S rDNA gene ：KC433410）
used dilution plate method was isolated from a soy processing plant in Jilin sewage outfall at soil samples . The species identification was made
on it, on the basis of morphological observation and through 18S rDNA sequence analysis further to the bacterial strain. The 18S rDNA sequence
shows that the homology of this bacterial strain and the18S rDNA of Aspergillus niger was above 99.0%. As shown in the phylogenetic tree, strain
ZWL-1 and Aspergillus sp. LQ21 constituted a branch and they constituted a high-order branch together with Aspergillus niger strain.CS1-1.
Thus, the primary identification proved that this bacterial strain is Aspergillus niger.
Key words:  18S rDNA Screening Identification Aspergillus niger Glucoamylase
成为当务之急。这一研究不仅有利于传统酶制剂产
业的技术进步，而且对应用酶制剂的相关产业的发
展也具有巨大的推动作用［2］。
目前用于真菌分类鉴定的核酸序列分析最常选
用的目的片段是 rDNA。真菌基因组中编码核糖体
的基因包括 4 种，28S rDNA、18S rDNA、5.8S rDNA
和 5S rDNA。真菌中 18S rDNA 是相对比较保守的序
列，进化上变异性较小，且 18S rDNA 序列较长，相
比之下包含了更多的遗传信息，使得对 18S rDNA
序列进行分析成为真菌分子学上鉴定菌种的主要方
法［3］。本研究通过此方法，结合微生物自身特性对
分离得到的一株产糖化酶菌株 ZWL-1 进行鉴定。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第7期132
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 样品 采自吉林某豆制品加工厂污水排放口
处的土样。
1.1.2 主要培养基 （1）葡萄糖淀粉培养基 ：蛋白
胨 1.0%，酵母粉 0.2%，牛肉粉 0.3%，氯化钠 0.2%，
葡萄糖 5%，玉米淀粉 1.0%，琼脂粉 1.7%，调 pH
值至 4.6-5.0 ；（2）发酵培养基 ：葡萄糖 8%，酵母
粉 0.5%，玉米糖浆 1%，豆饼粉 2%，磷酸二氢钾 0.2%，
硫酸镁 0.02%，调 pH 值至 4.6-5.0 ；（3）察氏培养
基 ：蔗糖 0.3%，硝酸钠 0.2%，磷酸氢二钾 0.1%，
硫酸镁 0. 05%，氯化钾 0.05%，硫酸亚铁 0.001%，
琼脂 1.8%，调 pH 值至 4.6-5.0。
1.1.3 仪器与设备 DL-CJ-IND 超净工作台，北京
市东联哈尔仪器制造有限公司 ；DHP120 型恒温培
养箱，上海实验仪厂有限公司 ；754 型紫外可见分
光光度计，上海光谱仪器有限公司 ；SY11-Ni 电热
恒温水浴锅，北京市长风仪器仪表公司 ；DYY-6C
型电泳仪，北京市六一仪器厂 ；BI2720 PCR 热循环
仪，美国应用生物系统公司；GIS-2019 凝胶成像系统，
上海天能科技有限公司。
1.2 方法
1.2.1 菌种初筛 称取 25 g 土样于装有灭过菌的
225 mL 生理盐水的三角瓶中，在磁力搅拌器上搅拌
均匀，之后静置 5 min。采用梯度稀释法制备 10-2-
10-6 的系列稀释液，分别吸取 1 mL 均匀涂布于葡萄
糖淀粉培养基上，每个处理设 3 个平行，30℃下培
养 5 d 后观察，在平板上倒入少量 0.1 mol/L 的碘液，
静置 10 min 观察并测量菌落周围出现透明圈的直
径（d /cm）和菌落直径（d /cm）［4］，再将有透明圈
的未知菌株落编号并移至斜面培养基上，30℃培养
3-5 d，保存于 4℃下，待下一步筛选。
1.2.2 菌种复筛 液体摇瓶培养 ：挑取 1 个单菌落
于装有 10 mL 蒸馏水的小三角瓶中，将菌落打碎
后，按 5% 的接菌量接种于发酵培养基中，培养温
度 30℃，转速 200 r/min，培养 5 d。
1.2.3 粗酶液的制备 将发酵结束后的发酵液倒入
50 mL 离心管中，以 6 000 r/min，离心 30 min，得到
的上清液为粗酶液［5］。测定酶活并计算糖化酶产率。
1.2.4 粗酶液酶活测定 经分离得到的糖化酶粗酶
液按照 GB8267—2006［6］测定标准酶活，空白用煮
沸失活的酶液代替，每个样做 3 个平行。酶活定义：
在 40℃、pH4.6 条件下每 1 h 生成 1 mg 葡萄糖所需
的酶量。
1.2.5 菌株形态观察 将筛选得到的菌株 ZWL-1 接
到察氏培养基平板上，置于 30℃下培养，每隔 8 h
观察菌落的颜色和形态。待菌丝长到盖玻片上后，
每隔 12 h 于显微镜下观察菌丝、分生孢子梗及分生
孢子的大小和形态［7］。
1.2.6 菌株 ZWL-1 总 DNA 的制备 将制备好的孢
子悬浮液接种于察氏液体培养基中，30℃，200 r/min
振荡培养 5 d。用灭过菌的四层纱布过滤，收集菌
丝体，在 -20℃的冰箱中预冷 30 min，再用液氮研
磨，然后转移至 EP 管中，通过改良后的 CTAB/NaCl
法［8］提取基因组 DNA，经 1% 琼脂糖凝胶电泳鉴定
其 DNA 的质量后作为 PCR 反应的模板。
1.2.7 菌株 ZWL-1 的 18S rDNA 序列 PCR 扩增 以
基因组 DNA 为模板，利用自己设计的引物（利用
Primer5.0 软件，根据 GenBank 发表的真菌 18S rDNA
保守基因序列设计的一对引物）对 18S rDNA 基因进
行扩增。引物序列为 ：上游引物 ：5-AGCGAAACT-
GCGAATGGC-3 ；下游引物 ：5-CATCCTTGGCAAA-
TGCTTTC- 3。
50 μL PCR 扩 增 体 系 ：ddH2O 35.5 μL，10×Ex
Taq buffer 5.0 μL， 引 物 各 2.0 μL，dNTP mixture 4.0
μL， 模 板 1.0 μL，Ex Taq 0.5 μL。PCR 反 应 条 件 ：
94℃预变性 4 min ；94℃变性 30 s，55℃复性 30 s，
72℃延伸 100 s，循环扩增 30 次 ；72℃延伸 10 min，
于 4℃结束反应［9］。
1.2.8 18S rDNA 序列同源性及系统发育树构建 登
录 http// ：www.ncbi.nlm.nih.gov， 将 测 序 结 果 用
BLAST 与在 GenBank 基因库中的 14 株其他真菌（表
1）的 18S rDNA 序列进行同源性比对，寻找其同源
关系，确定菌属。应用 BIOEDIT 7.0 中的 Clustal X
软件［10］和 MEGA 5 软件［11］经多重比较后构建系统
发育树。
2 结果
2.1 产酶活力较高菌株的筛选
从吉林某豆制品厂污水排放口处土样中，经反
2013年第7期 133张文丽等 ：一株高产糖化酶生产菌的筛选与鉴定
复分离筛选，得到 10 株生长速度较快、透明圈与菌
落直径之比（HC 值）较大的菌株，经初筛和复筛，
得到 4 株液态发酵产酶活力较高的菌株。其中菌株
ZWL-1 生长较快、透明圈与菌落直径之比（HC 值）
较大、酶产率较高，液体发酵酶产率高达 12 271 U
/mL，如图 1 和表 2 所示。故选定菌株 ZWL-1 作为
供试菌株进行菌种鉴定。
后菌落呈白色绒毛状（图 2），外观干燥，不透明菌
落与培养基的连接紧密，不易挑取；在液体培养基中，
振荡培养，形成白色小球 ；显微镜下观察到分枝繁
茂且具横隔的菌丝体，菌丝透明，形成多分枝轮廓，
分生孢子梗，直立无色，小枝对生，分生孢子褐色
球形，若干分生孢子在分生孢子梗上聚集成孢子头。
初步鉴定为半知菌亚门，丝孢纲，丝孢目，丛梗孢科，
曲霉属。
图 1 菌株 ZWL-1 透明圈
表 2 分离菌株 HC 值和发酵后酶产率
菌株
透明圈直径
（cm）
菌落直径
（cm）
HC 值
液态发酵
酶产率（U/mL）
ZWL-1 1.34 0.59 2.27 12 271
ZWL-3 0.87 0.46 1.89 9 016
ZWL-6 1.14 0.58 1.97 10 178
ZWL-9 0.69 0.41 1.68 7 342
图 2 分离获得的高产糖化酶菌株 ZWL-1 的菌落形态
2.3 18S rDNA基因PCR扩增
以提取的 ZWL-1 的基因组为模板，经 PCR 扩
增后，进行 1% 琼脂糖凝胶电泳，获得一条约 900
bp 的特异性条带（图 3）。
2000
bp
M 1
1000
750
500
250
100
M ：DL2000 DNA Marker ；1 ：ZWL-118S rDNA 基因 PCR 扩增产物
图 3 菌株 ZWL-1 的 18S rDNA 基因 PCR 扩增产物
2.4 菌株ZWL-1的18S rDNA序列同源性和系统发
育分析
2.4.1 菌株 ZWL-1 的 18S rDNA 测序结果 将 ZWL-1
的 18S rDNA PCR 扩增产物送去上海生工测序，菌株
ZWL-1 得到一条长度为 905 bp 的 18S rDNA 基因片段
（已去除引物序列），将序列提交 GenBank，得到登
录号为 ：KC433410。
表 1 选自 GenBank 中用于比对的真菌菌株
菌种名 菌株名 登录号
Aspergillus niger strain YM33182 DQ915806
Aspergillus niger strain HKS11 JX112703
Aspergillus niger strain CS 1-1 HM590646
Aspergillus awamori strain PSFW1RH-1 HQ393870
Aspergillus sp. LQ21 HM536999
Aspergillus sp. CPCC 480386 EU826478
Aspergillus niger strain IMT GQ338836
Aspergillus nomius nomius AB008404
Aspergillus terreus strain OUCMDZ-1925 JQ812052
Hemicarpenteles ornatus AB002067
Neosartorya sp. SAUFS5-3 JN176211
Aspergillus proliferans AB002083
Aspergillus sp. PSBORB-4 HQ393873
Eurotium herbariorum strain HDJZ-zwm-41 JX839684
2.2 菌落形态
菌落在察氏培养基上菌落蔓延迅速，孢子成熟
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第7期134
2.4.2 菌株进化树的建立 将所获得的菌株 ZWL-1
的 18S rDNA 序列登录 NCBI，通过在线 BLAST 分析，
菌株 ZWL-1 的 18S rDNA 序列与黑曲霉（Aspergillus
niger）最相似，序列同源性均在 99% 以上。选取 14
种与其相似性均为 99% 以上的已知菌种的 18S rDNA
基因核酸序列进行多序列排列构建进化树，如图 4
43
50
66
84
57
51
85
85
85
85 Aspergillus sp. LQ21
ZWL-1
Aspergillus niger strain CS 1-1
Aspergillus niger strain YM33182
Aspergillus niger strain HKS11
Aspergillus awamori strain PSFW1RH-1
Aspergillus sp. CPCC 480386
Aspergillus niger strain IMT
Aspergillus nomius
Aspergillus terreus strain OUCMDZ-1925
Aspergillus sp. PSBORB-4
Aspergillus proliferans
Eurotium herbariorum strain HDJZ-zwm-41
Neosartorya fischeri
Hemicarpenteles ornatus
85
85
每个支点处的数字为 Bootstrap（1 000 次抽样）的支持百分率
图 4 菌株 ZWL-1 18S rDNA 系统发育树
所示。
3 讨论
菌种的形态特征是由遗传物质和生存环境等因
素共同决定的，利用基于形态学、生理生化及分子
生物学等技术的多相分类鉴定方法现已广泛应用于
微生物分类学研究领域［12］。因此在真菌菌种鉴定和
分类时，利用多相分类学技术的综合使用，是保证
分析和鉴定更加准确的必要前提。目前用于鉴定物
种的分子标记和分子技术有 SCCP、DDGE、DDTE、
RFLP、RAPD、16S rDNA 及 18S rDNA， 其 中 18S
rDNA 已经多次应用于真菌的鉴定。真菌的分类鉴定
方法主要有两大类，一类是表型鉴定，另一类是分
子生物学鉴定，对菌体进行形态观察属于表型鉴定，
而通过 18S rDNA 基因序列分析法属于分子生物学
鉴定［13］。本研究中通过对菌株 ZWL-1 为期 1 周的
形态学定期观察和显微镜下观测，也只能确定到属。
18S rDNA 基因序列法从基因水平明确种属分类，基
因序列分析是以核酸为基础，受到外界环境影响较
小，不依赖于人肉眼观察，无个体差异，结果偏差
比表型鉴定小，是一种相对准确的鉴定方法。
本研究利用自己设计的引物对 ZWL-1 18S rDNA
基因序列扩增和序列测定，并通过 BIOEDIT 软件
中 的 Clustal X 软 件 将 菌 株 ZWL-1 的 18S rDNA 基
因片段序列与 14 种与其相似性均为 99% 以上的已
知菌种的 18S rDNA 基因核酸序列进行多序列排列
用 Neighbor-joining 方 法［14］ 构 建 进 化 树， 并 采 用
Bootstraping 法［15］评估其准确度，最后用 MEGA 5
软件进行系统进化分析，从构建的系统进化树中可
以看出，ZWL-1 与 Aspergillus sp. LQ21 共同构成一个
分支，并与黑曲霉（Aspergillus niger strain CS1-1）聚
成一大支。因此，ZWL-1 被鉴定为黑曲霉属。黑曲
霉为半知菌亚门真菌，在察氏琼脂培养基上生长时，
菌丝初为白色，后变黑，常出现黄色区带，厚绒状，
反面无色或略带黄褐色。但本研究中筛选得到的菌
株 ZWL-1，在进行形态观察培养时其菌丝由始至终
为白色，猜测是 ZWL-1 的原始菌株在受到长期环境
的影响发生了表型变异。由于黑曲霉生长发育较快，
分泌产生的代谢物种类和性质可能会具有其特殊性，
若该菌产酶能力保持稳定并对其再进一步优化，该
菌株有可能作为一种新型的工业生产菌株，发挥该
菌的生物学功能和实现其生产利用价值，提高传统
糖化酶制剂的发酵产率。
由于糖化酶具有重要的应用价值，国内外越来
越多的研究者正在将目光投向糖化酶的基础研究和
2013年第7期 135张文丽等 ：一株高产糖化酶生产菌的筛选与鉴定
工业应用中。接下来我们将进一步研究该菌产糖化
酶的结构，如糖链在糖化酶活性、稳定性及构象状
态中所起的作用，进一步阐明糖化酶的多型性原因
及糖化酶的热稳定性机制。
4 结论
从吉林某豆制品加工厂污水排放口处土样中经
反复分离筛选得到 4 株活较高的菌株，经液态发酵
产酶优化得到 1 株产糖化酶活力较高的菌株 ZWL-1。
结合形态鉴定和 18S rDNA 序列分析的结果，最终确
定该菌属于黑曲霉属（Aspergillus niger），且测定该
菌具有较高的糖化酶活性。
参 考 文 献
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（责任编辑 马鑫）