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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第3期
谷子起源于中国，是世界上最古老的栽培作物
之一，也是我国北方重要的粮食作物。谷子具有适
应性广，耐干旱，耐瘠薄，抗逆强的特点，这些特
性决定了它在环境越来越恶化的自然条件下有很大
的种植和增产空间，在干旱、半干旱地区、低洼易
涝和盐碱地区、土壤贫瘠的山区和半山区均可种植。
同时，谷子营养均衡，是较好的饲料作物，这些特
收稿日期 ：2012-07-09
基金项目 ：“十二五”农村领域国家科技计划项目（2011BAD06B01），河北省自然科学基金项目（C2011405022）
作者简介 ：袁进成，硕士，副教授，研究方向 ：植物种质资源 ；E-mail ：jinchenyuan@126.com
通讯作者，董志平，硕士，研究员，研究方向 ：谷子抗锈育种 ；E-mail ：dzhping@126.com
谷子成熟胚诱导愈伤组织及植株再生的研究和
条件的优化
袁进成1  刘颖慧1  董志平2
（1. 河北北方学院，张家口 075000 ；2. 河北农林科学院谷子研究所，石家庄）
摘 要 ： 选用 4 个谷子品种，“冀谷 11”、“豫谷 2 号”、“铁谷 5 号”和“十里香”研究在不同条件下谷子成熟胚的再生能力
及其影响因素。研究表明谷子的再生能力受基因型影响较大，不同谷子品种诱导愈伤和愈伤分化能力不同，4 个品种中以“冀谷
11”的再生能力最好。后续试验用“冀谷 11”研究不同培养基、不同激素配比以及培养基的添加物对谷子再生能力的影响。结果
表明 LS 培养基适合谷子的愈伤组织诱导，MSB5 培养基适合谷子的分化 ；所试验的碳源中麦芽糖适合愈伤的诱导和分化 ；谷子诱
导愈伤较好的激素配比是 2，4-D+ZT，愈伤分化较优的激素配比为 NAA 和 6-BA 的组合。另外，硝酸银、酸水解酪蛋白、脯氨酸
及山梨醇等添加物会提高谷子的再生能力。
关键词 ： 谷子 愈伤组织 再生 诱导
Evaluation and Optimization on Callus Induction and Regeneration of
Mature Embryo in Millet（Tetaria italica）
Yuan Jincheng1 Liu Yinghui1 Dong Zhiping2
（1. Hebei North University，Zhangjiakou 075000 ；2. Hebei Academy of Agriculture and Forestry Sciences，Shijiazhuang）
Abstract:  In this paper, four millet varieties “JI GU11”, “YU GU2”, “TIE GU5” and “SHI LI XIANG” seeds were used to induce
calli, and the factors which influence callus induce rate and seedling regenerate rate were stuied. Variable frequencies of callus initiation were
observed among the varieties. The vareity “JIGU11” exhibited high callus induction efficiency and selected for further study. Four media,
three carbon sources at different concentrations, different concentrations of tryptophan, casein hydrolysate, gelrite and sorbitol were tested. The
concentrations and combination of different hormones were also examined. The results suggested that the optimal callus induction medium was
LS supplemented with 2 mg/L 2, 4-D combination with 1 mg/L ZT and 50 g/L maltose, 1 g/L casein hydrolysate, 50 mg/L tryptophan, 4% sorbitol
and 0.5% gelrite. While maximum regeneration response was detected on MSB5 medium fortified with 0.5 mg/L NAA+2.0 mg/L 6-BA, 30 g/L
maltose plus 4% sorbitol.
Key words:  Millet Callus Induction Regeneration
征都决定了谷子有较好的种植前景。从遗传学角度
来说谷子具有基因组小、染色体简单的特点，它的
测 序 完 成（DOE’s Joint Genome Institute，JGI） 为
其深入研究奠定了较好的基础，使其有可能成为基
础研究的模式植物。最近研究发现谷子的生物学特
征和柳枝稷非常相近，能从中提炼出酒精，又有“能
源草”的称谓，通过对谷子的研究和开发，有可能
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第3期78
开启人类改变获取能源方式的新开端。
随着谷子转基因技术的不断应用，大量的分子
生物学技术应用于谷子育种中，建立良好的受体系
统是转化技术的关键环节。目前谷子转化的外植体
多选取穗分化期的幼穗［1，2］，但是幼穗的取材经常
受地理条件、季节和发育阶段的严格限制。相比之下，
成熟胚取材方便，不受时间和数量的限制，是一种
较理想的谷子遗传转化的受体材料。然而谷子成熟
胚诱导愈伤组织、分化再生植株的能力对基因型的
依赖非常大，影响的条件也较多，还有很多不确定
因素。基于此，本试验选用了 4 个重要的谷子品种，
对谷子成熟胚愈伤组织诱导、继代、分化以及成苗
进行研究，并对影响成熟胚再生能力的条件进行了
优化。
1 材料与方法
1.1 材料
谷子品种“冀谷 11”、“豫谷 2 号”、“铁谷 5 号”
和“十里香”由河北农林科学院谷子所提供。
1.2 方法
1.2.1 种子的消毒处理 挑选饱满的成熟谷子种子，
用 75 % 乙醇灭菌 2 min，然后用 2.5% 次氯酸钠浸泡
15 min。表面消毒后的种子用无菌蒸馏水清洗 6 次，
放到无菌的滤纸上，紫外灯下消毒 5 min，然后将种
子接种在诱导愈伤培养基上，25℃暗中培养。
1.2.2 愈伤组织的诱导 种子接种于诱导培养基，
在 25℃黑暗中培养 3 周，得到初级愈伤组织，计算
愈伤组织诱导频率。然后将初级愈伤组织转移到继
代培养基上，25℃黑暗中继续培养，每 2 周继代一次，
诱导胚性愈伤组织。继代两次后，观察愈伤组织的
状态并记录。
1.2.3 胚性愈伤组织的分化与再生 将胚性愈伤组
织转移到分化培养基上，在 25℃、16 h/8 h 光暗交
替条件下进行分化培养。经过 3 周的培养，计算愈
伤组织中出现绿色芽点的频率，统计分化的频率。
将分化出的绿苗转入生根培养基培养 2 周后，然后
转入壮苗培养基中敞口培养 1-2 周，移栽到花盆中
种植。
1.2.4 谷子愈伤组织诱导和再生条件的优化 （1）
培养基的选择 ：诱导愈伤组织和分化培养基分别选
取 MS，LS，MSB5 培养基［3，4］，比较 3 种培养基对
谷子再生能力的影响 ；（2）培养基的碳源 ：培养基
中分别添加 3%，4% 和 5% 的蔗糖、葡糖糖和麦芽
糖进行比较 ；（3）培养基添加物质的影响 ：研究酸
水解酪蛋白、山梨醇和色氨酸对愈伤诱导和分化的
影响 ；研究不同浓度硝酸银对愈伤诱导和分化的影
响 ；（4）激素的影响 ：在愈伤组织诱导和分化培养
基中分别加入 2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D），激动
素（KT），吲哚乙酸（IAA），玉米素（ZT），细胞分
裂素（6-BA），比较不同浓度激素组配的影响 ；在壮
苗培养基研究激素（2，4-D，NAA，KT）对谷子移
栽成苗率的影响。
1.2.5 愈伤组织状态的观察记录 种子接种到诱导
愈伤培养基 21 d 后继代培养，继代 2 次后观察愈伤
组织出愈质量，“优”表示愈伤组织质量好，颜色呈
亮黄色，表面呈不规则颗粒状，质地致密，生长速
度快。“良”表示愈伤组织质量较好，颜色为淡黄色，
表面不规则，质硬，生长快。“差”表示愈伤组织水
浸状，质软，苍白色或者褐变，甚至死亡。
1.2.6 数据的统计分析 分析成熟胚接种到诱导愈
伤培养基 21 d 后，统计愈伤组织出愈数量，计算愈
伤组织诱导率 ；愈伤组织接种到分化培养基 21 d 后，
统计愈伤组织分化率 ；分化出的绿芽转至生根培养
基，待根健壮后转移到壮苗培养基中，约 20 d 后移栽，
统计成苗率。每次试验重复 3 次。试验数据用 SAS
软件（8.1 版本）的 ANOVA 过程进行差异显著性分析。
愈伤组织诱导率（%）= 诱导的愈伤组织种子
数 / 接种的种子总数 ×100%
愈伤组织分化率（%）= 分化幼苗的愈伤数 / 诱
导的总愈伤组织 ×100%
成苗率（%）= 移栽成活的苗数 / 移栽的总苗
数 ×100%
2 结果
2.1 不同培养基对谷子再生的影响
挑选饱满的谷子种子，表面消毒后用无菌蒸馏
水清洗，接种到含 2，4-D（2 mg/L）的不同培养基
中（MS，LS，MSB5），培养 2 周后诱导出颜色淡黄
的初级愈伤组织，继续培养 1 周后，观察愈伤组织
的状态并统计诱导率。从愈伤组织的诱导率中可以
2013年第3期 79袁进成等 ：谷子成熟胚诱导愈伤组织及植株再生的研究和条件的优化
看到 3 种培养基之间的诱导率差异不显著，LS 和
MSB5 培养基的愈伤诱导率要略高于 MS 培养基，但
是从愈伤组织的质量来看 LS 培养基愈伤的状态要较
其他培养基好，LS 培养基的愈伤多为黄色、结构致
密的胚性愈伤组织（表 1）。综合以上因素认为谷子
诱导愈伤选 LS 培养基要优于其他培养基。
选取状态好的愈伤放到分化培养基中，分化 21
d 后观察分化率，和愈伤组织的诱导不同，不同的
培养基对分化率的影响差异显著，其中以 MSB5 培
养基分化率最好，“冀谷 11”可以达到 45.75%，分
化率是 MS 培养基的 1.5 倍还要高，而 LS 培养基和
MS 培养基之间差异并不显著。综合以上试验结果，
后续的试验中选取 LS 培养基为诱导愈伤培养基，
MSB5 为分化培养基。
表 1 四种不同基因型谷子成熟胚在不同的培养基中愈伤组织的诱导状态
2.2 谷子再生能力基因型差异
从愈伤组织的诱导率和分化率以及愈伤组织状
态的比较可见，4 个谷子品种中 “冀谷 11”愈伤组
织的诱导率最高，在 LS 培养基中可以达到 60% 以
上（表 2），同时“冀谷 11”的愈伤状态也好于其他
品种，有一半以上的愈伤组织颜色亮黄色，质地致密，
生长速度快。愈伤组织的分化率也以“冀谷 11”为好，
可以达到 40% 以上 ；诱导率和分化率最差的品种是
“十里香”，诱导率不足 20%，而且愈伤组织的状态差，
多数为水渍状，较黏稠，培养一段时间会褐化以致
死亡。
从本试验可见谷子再生基因型依赖性较强，不
同的基因型差异较大。因为“冀谷 11”的表现要优
于其他 3 个品种，所以后续的条件优化试验中用“冀
谷 11”进行深入研究。
诱导愈伤培养基上进行诱导，比较不同激素浓度对
诱导率的影响。从结果（表 3）可见，加入多种激
素的组合可以提高愈伤组织的诱导率，其中愈伤诱
导率最高的为添加激素 2，4-D（2.0 mg/L）+KN（2.0
mg/L）+NAA（0.5 mg/L）+6-BA（2.0 mg/L）+ZT
（1.0 mg/L）的培养基，诱导率为单独加 2，4-D（2.0
mg/L）的 1.56 倍，但是多种激素组合之间愈伤诱导
率影响差异不是很大。从愈伤组织的状态看以 2，4-D
和 ZT 的组合愈伤的质量最好，多数为黄色、致密的
胚型愈伤组织。综合本试验的结果，考虑到试验的
简易化和愈伤的质量，选用 2.0 mg/L 2，4-D+1.0 mg/l
ZT 为诱导愈伤组织培养基较好。
从愈伤的分化率来看，6-BA 是必须的，但是增
加其他的激素可以明显的提高分化率，其中以 NAA
（0.5 mg/L）+6-BA（2.0 mg/L）组配的分化率最高，
为对照的 1.73 倍，所以愈伤的分化选取 NAA 和 6-BA
的组合。
2.4 不同添加物对谷子再生能力的影响
根据前面试验，以 LS 培养基为基础培养基，加
入浓度为 2.0 mg/L 2，4-D 对“冀谷 11”种子进行愈
伤组织诱导，分化培养基为 MSB5+2.0 mg/L BA 进行
分化培养，研究不同添加物对谷子再生的影响。
2.4.1 硝酸银浓度的影响 由图 1 可见硝酸银可以
改变谷子的诱导率，同时也可以改变谷子的愈伤状
态，在 50 mg/L 硝酸银的作用下谷子的愈伤诱导率
表 2 不同的培养基对谷子愈伤组织诱导率和分化率的影响
谷子基因型
诱导率（%） 分化率（%）
MS LS MSB5 MS LS MSB5
冀谷 11 58.52 60.35 57.33 33.25 41.21 45.75
豫谷 2 号 55.31 55.00 57.42 36.23 35.73 48.27
铁谷 5 号 40.23 42.14 38.68 30.34 36.35 45.67
十里香 15.12 12.75 20.96 10.00 12.24 23.03
每次选取 60 粒饱满的种子进行诱导，21 d 后计算诱导率，设 3 次重复
2.3 不同激素配比对谷子再生能力的影响
选取“冀谷 11”成熟的种子，灭菌后放到 LS
基因型
LS MS MSB5
优（%） 良（%） 差（%） 优（%） 良（%） 差（%） 优（%） 良（%） 差（%）
冀谷 11 52 23 44 20 36 25 40 22 38
豫谷 2 号 40 37 38 18 44 23 37 15 48
铁谷 5 号 15 38 10 17 36 47 10 12 78
十里香 0 12 0 2 98 88 0 12 88
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第3期80
为 69.25%，比对照提高 1.52 倍，继续提高硝酸银浓
度（100 mg/L）对提升愈伤的诱导率效果不大。从
分化率的影响看，不同浓度的硝酸银对分化率影响
不大，所以在分化培养基中不建议加入硝酸银。
糖对愈伤组织的诱导率提高最多，为对照的 1.21 倍。
不同浓度的糖都可以促进愈伤的分化，从分化效果
来看，愈伤在 3% 的麦芽糖上分化率达到最高（48%），
为对照的 1.26 倍。
表 3 不同的激素浓度和配比对“冀谷 11”愈伤组织诱导率和分化率的影响
“+” 表示添加激素，“-”表示不添加激素，选取 60 粒饱满的种子进行诱导，21 天后计算诱导率，选取发育好的胚性愈伤组织进行分化培养，21 天后计算分化率，
设定 3 次重复
2,4-D（2.0 mg/L） KN（2.0 mg/L） NAA（0.5 mg/L） 6-BA（2.0 mg/L） ZT（1.0 mg/L）
诱导率 （%） + （61.32） - - - -
+ + （67.86） - - -
+ - + （69.00） - -
+ - - + （70.71） -
+ - - - + （74.47）
+ + + （72.33） - -
+ + - + （75.43） -
+ + - - + （68.33）
+ - + + （73.64） -
+ - + - + （66.79）
+ - - + + （69.31）
+ + + + （74.53） -
+ + - + + （71.23）
+ + + - + （70.00）
+ - + + + （73.33）
+ + + + + （75.42）
分化率（%） - - - + （40.27） -
+ （60.13） - - + -
- + （57.76） - + -
- - + （71.54） + -
- - - + + (51.35)
0
20
40
60
䈡ሬ⦷100
0 25
硝酸银浓度mg/L 7550 100
䈡ሬ
⦷࠶
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%
࠶ॆ⦷
图 1 硝酸银浓度对谷子愈伤诱导率和分化率的影响
2.4.2 不同碳源的影响 研究 3%，4% 和 5% 的蔗
糖、葡糖糖和麦芽糖对诱导率和分化率的影响，从
表 4 可见不同浓度的糖作用不同。其中 5% 的麦芽
表 4 不同碳源对“冀谷 11”愈伤组织诱导率和分化率的影响
碳源 愈伤诱导率（%） 愈伤分化率（%）
蔗糖 3% 53.21 42.43
4% 59.23 39.32
5% 63.65 40.15
葡糖糖 3% 59.32 38.76
4% 58.64 40.38
5% 57.25 41.49
麦芽糖 3% 60.65 48.00
4% 68.27 46.55
5% 70.02 41.67
CK 52.32 38.36
选取 60 粒饱满的种子进行诱导，21 d 后计算诱导率，选取发育好的胚性愈
伤组织进行分化培养，21 d 后计算分化率，设定 3 次重复
2.4.3 培养基添加物对再生能力的影响 培养基中
分别加入 1 g/L 的酸水解酪蛋白、50 mg/L 色氨酸和
2013年第3期 81袁进成等 ：谷子成熟胚诱导愈伤组织及植株再生的研究和条件的优化
4% 的山梨醇研究诱导愈伤和分化的影响。从图 2 可
见，培养基的添加物可以提高谷子成熟胚的愈伤诱
导率，表现较好的是添加山梨醇或者酸水解酪蛋白、
色氨酸、山梨醇一起添加，愈伤组织质量最好的为
酸水解酪蛋白、色氨酸、山梨醇一起添加的培养
基。不同的添加物质也可以提高愈伤的分化率，单
纯的添加山梨醇就可以使分化率提高 1.27 倍。根据
以上的结果认为诱导愈伤培养基加入 1 g/L 的酸水解
酪蛋白、50 mg/L 色氨酸和 4% 的山梨醇较好，而分
化培养基加入 4% 的山梨醇可以达到提高分化率的
目的。
3 讨论
很多报道认为成熟胚诱导愈伤组织依赖于基因
型［5］，本试验也证明这一点，从 4 个谷子品种的研
究中发现基因型对谷子再生的影响较大（表 1）。在
合适的 2，4-D（2.0 mg/L）浓度的培养基中，4 种不
同基因型的成熟胚愈伤诱导率差异较大，从 60.75%
到 12.75%，而且诱导出来的愈伤状态差异也较大，
十里香诱导出的愈伤较难形成胚性愈伤，在继代培
养中易发生褐化、生根水渍状，继代几次后会死亡，
而且分化率极低，仅达到 13%。所以谷子基因型仍
然是限制谷子组织培养的一个关键因素，筛选适宜
培养的基因型仍然是谷子组培工作的重点［6］。
培养基是离体组织生长的介质也是营养的重要
来源，不同的植物生长需要的培养基也不同，本试
验的研究表明谷子成熟胚诱导愈伤较适合的培养基
是 LS 培养基，可能是因为该培养基的营养成分更
适合谷子愈伤的诱导和生长，这和 Srivastav 等［2］的
报道是一致的。分化最适合培养基是 MSB5 培养基，
其主要特点是含有较低的铵，可能减少了铵对愈伤
组织分化及生长的抑制作用。通过研究不同激素的
浓度和配比发现谷子愈伤的诱导和分化需要多种激
素的作用，可能是生长素和细胞分裂素相互配合能
调节细胞的分裂与分化，控制器官的分化，生长素
高时可诱导根的形成，细胞分裂素高时可促进芽的
分化，使谷子成熟胚的诱导效率更高 ［7］。硝酸银具
有诱导胚状体产生的作用［8］，有的植物培养需要一
定浓度的硝酸银，而有的植物并不需要。从本试验
的结果可见，谷子成熟胚中加入一定浓度的硝酸银，
可以较好地促进愈伤组织的形成，但是对分化的影
响不大，以上的研究和 Taylor 的结果相近［1］。色氨
酸、山梨醇、酸水解酪蛋白含有多种组织生长必须
的氨基酸等营养物质，对胚状体、不定芽的分化有
良好的促进作用［4，9］，本试验的研究结果也证明添
加以上物质可以提高谷子的再生能力。谷子幼穗一
直是再生最理想的外植体，关于幼穗诱导愈伤，分
化再生能力都进行了很多研究，再生体系也一步步
趋于完善［10］。用谷子成熟胚为外植体进行再生还在
进一步的试验探索中，谷子愈伤组织的分化再生培
养受很多因素的影响。由于谷子组织培养中的影响
0
10
20
30
40
50
60
70
80
CK Aษޫส␫࣐⢙⿽㊫B C D
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䈡ሬ⦷ ࠶ॆ⦷
A ：添加 1g/l 酸水解酪蛋白 ；B ：添加 50mg/l 色氨酸 ；C ：添加 4% 山梨醇 ；
D ：3 种物质都添加
图 2 酸水解酪蛋白、色氨酸、山梨醇对谷子再生的影响
2.5 不同激素对再生苗成活率的影响
将再生苗在壮苗培养基中培养两周，培养基中
加入不同激素促进根的生长发育，从表 5 中可见 2，
4-D、KT 和 NAA 都不同程度的提高再生苗的成活
率。虽然从表观看再生苗的根系长度和对照相差不
大，但是主根多且粗壮，茎杆也变粗，这时可以大
大提高再生苗的成活率。从不同激素的比较结果可
见 NAA 的效果更好一些，为对照的 1.4 倍。
表 5 不同激素对再生苗成活率的影响
选取 15 株苗进行壮苗培养，移栽后计算成活率，设定 4 次重复
激素种类 成活率（%）
2,4-D（2.0 mg/L） 83.21
KT（2.0 mg/L） 78.35
NAA（3.0 mg/L） 89.74
CK 65.04
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第3期82
因子多、遗传背景复杂，对于多种因素之间的互作
关系还有待于进一步的深入研究。人们已经建立了
水稻和小麦的高效成熟胚再生体系，这些都值得思
索和借鉴，可以通过对其他作物再生体系条件和机
理的研究，逐步解决谷子成熟胚再生的问题，建立
高效的成熟胚再生体系［11］。
4 结论
谷子愈伤组织的分化和再生受基因型以及培
养条件影响较大，LS 培养基中进行愈伤组织诱导，
MSB5 培养基进行分化可以获得较高的诱导率和分化
率，碳源中麦芽糖适合愈伤的诱导和分化 ；谷子诱
导愈伤较好的激素配比是 2，4-D+ZT，愈伤分化较
优的激素配比为 NAA 和 6-BA 的组合。另外，硝酸银、
酸水解酪蛋白、脯氨酸及山梨醇等添加物会提高谷
子的再生能力。
参 考 文 献
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（责任编辑 李楠）